#1  
قديم 11-22-2015, 07:52 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي Spastin، البروتين تحور في مرض وراثي جسمي الشلل النصفي التشنجي وراثي، وتشارك في ديناميات أنيبيب

 



http://hmg.oxfordjournals.org/content/11/2/153.full



يتميز راثي الشلل النصفي التشنجي (HSP) من خلال الضعف التدريجي والتشنج في الأطراف السفلية، والناجمة عن تدهور محدد من مساحات القشري، وهي أطول المحاور في البشر. معظم حالات شكل جسمية مهيمنة من المرض هي نتيجة لطفرات في الجين SPG4، الذي يشفر spastin، وهو أتباز عائلة AAA. مسارات الخلوية التي تعمل spastin ودورها في التسبب في تدهور المحاور الحركية غير معروفة حاليا. بالإعراب عن النوع البري أو أتباز معيب spastin في العديد من أنواع الخلايا، وتبين لنا الآن أن spastin تتفاعل بشكل حيوي مع الأنابيب الدقيقة. تم بوساطة جمعية Spastin مع الهيكل الخلوي أنيبيب من المنطقة N-محطة من البروتين، وينظم من خلال النشاط أتباز المجال AAA. التعبير عن كل الطفرات مغلطة في المجال AAA، التي تم تحديدها سابقا في المرضى، ويؤدي الى التأسيسي ملزم لميكروتثبول في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل والحث على اختفاء أستر وتشكيل حزم محيط بالنواة سميكة، مما يشير إلى دور spastin في ديناميات أنيبيب . باستمرار، من النوع البري spastin يعزز التفكيك أنيبيب في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. وتشير هذه البيانات قد يكون متورطا أن spastin في ديناميات أنيبيب على غرار katanin البروتين، و-قطع أنيبيب مثلي للغاية. ضعف التنظيم جيد من الهيكل الخلوي أنيبيب في محاور طويلة، ويرجع ذلك إلى حدوث طفرات spastin، قد تكمن وراء التسبب في HSP.
القسم السابق القسم التالي
تلقى 18 سبتمبر 2001. المنقحة والمقبولة 16 نوفمبر 2001.

مقدمة

الشلل النصفي التشنجي وراثي (HSP) ويضم مجموعة غير متجانسة وراثيا من الأمراض الوراثية، التي تتسم بالضعف والشلل التشنجي في الأطراف السفلية (1، 2). قد يكون الشلل النصفي التشنجي ميزة معزولة (HSP النقي)، أو تكون مصحوبة أعراض عصبية إضافية (معقدة HSP). المتعلقات عصبية مرضية من هذه الصورة السريرية هو انحطاط الوراء التدريجي من المحاور القشري، وهي أطول المحاور في جسم الإنسان (3، 4). على الرغم من أن العديد من الجينات HSP تم تعيينها، واستنسخت سوى عدد قليل منهم حتى الآن. تم العثور على هذه الجينات أن تشارك في التنمية محور عصبي القشري (L1CAM) (5)، في الدبقية إلى الخلايا العصبية الإنذار (حزب العمال التقدمي) (6)، وظيفة الميتوكوندريا (paraplegin) (7)، مشيرا إلى أن الآليات التي يمكن أن تسهم في انحطاط المحاور الحركية والمتعددة (للمراجعة رؤية 8).
التسبب في الشكل الأكثر شيوعا من راثي الشلل النصفي التشنجي السائد لا يزال غير معروف تماما. ومن المقرر أن الطفرات في الجين SPG4، التي تقوم بتعيين إلى الكروموسوم 2p21-P22 (هذا النموذج 10) ويشفر بروتين الحمض الأميني 616، واسمه spastin (11). وعلى غرار paraplegin، spastin ينتمي إلى AAA (ATPases المرتبطة بمختلف الأنشطة الخلوية) أسرة، والتي تتميز مجال الحفظ من 230 الأحماض الأمينية مع النشاط أتباز (12). وأفادت عدة ورقات الطيف من الطفرات SPG4 في المرضى الذين يعانون HSP (+13 - +18). وفقا لهذه الدراسات، تمثل الطفرات SPG4 لا يقل عن 40٪ من جميع الأسر HSP المهيمنة مقهورة. وقد تمت مشاهدتها جميعا مغلطة، هراء ولصق موقع الطفرات وكذلك الحذف أو الإدراج في الجين spastin. والجدير بالذكر أن تسقط جميع الطفرات مغلطة في المجال AAA، باستثناء استبدال S44L الذي يظهر أن المرض تسبب فقط في الدولة متماثلة اللواقح (14)، الكامنة وراء أهمية وظيفية لهذا المجال. وتنتشر الطفرات الأخرى على طول المنطقة ترميز الجين ويؤدي إلى كودونات إنهاء سابقة لأوانها، ومرنا عدم الاستقرار، مما يوحي بأن haploinsufficiency هو السبب الجزيئي للأمراض (18).
وتشارك البروتينات AAA في طائفة واسعة من العمليات الخلوية، مثل دورة الخلية والنقل الحويصلي، وظيفة الميتوكوندريا، بيروكسية نشوء حيوي والتحلل البروتيني (19 - +21). على أساس التماثل تسلسل وتحليل النشوء والتطور، spastin ينتمي إلى فصيلة-7 (12) أو مجموعة الانتصافي (22) من البروتينات AAA. البروتينات أفضل وصف لهذه المجموعة الفرعية، katanin P60 وVps4 / SKD1، وتورط في العمليات الخلوية متباينة تماما، مثل انقطاع أنيبيب (23، 24) وendosomal التشكل والاتجار (25، 26)، مما يعوق التنبؤ ظيفة spastin بناء على homologies. على الرغم من أن برامج الكمبيوتر تتنبأ إشارة استيراد النووية (11)، توطين التحت خلوية spastin لا يزال غير معروف، وليس لدينا أي فكرة عن الآلية التي يمكن أن تؤدي الطفرات spastin إلى انحطاط المحاور القشري.
نحن الآن البيانات الحالية تشير إلى أن spastin تتفاعل مع الأنابيب الدقيقة عبر المنطقة-N محطة لها، وأن هذه الجمعية تنظم من خلال النشاط أتباز المجال AAA. وعلاوة على ذلك، نحن نقدم الأدلة الأولية تشير إلى أن مثل katanin، يمكن أن تشارك spastin في بعض جوانب أنيبيب التفكيك. وأخيرا، وتبين لنا أن كل الطفرات مغلطة spastin تقع في نطاق AAA، التي سبق تحديدها في المرضى الذين يعانون HSP، ربط جوهري على الأنابيب الدقيقة ويؤدي إلى إعادة توزيع الهيكل الخلوي أنيبيب. وتشير هذه البيانات إلى أن HSP بسبب SPG4 الطفرات قد تعتمد على وجود ضعف ديناميات أنيبيب في محاور طويلة.

النتائج

الزميلة spastin أتباز معيبة مع ميكروتثبول

من أجل الحصول على فكرة عن الدور البيولوجي للspastin، ونحن التحقيق توزيعه التحت خلوية عليها بنقل عابر مختلف بنيات spastin الموسومة حاتمة في كوس-7 الخلايا (الشكل 1). وأظهرت التجارب مناعي بعد تجزيء التحت خلوية عصابة من الحجم المتوقع (68 كيلو دالتون) في جزء حشوية (الشكل 2). وأظهرت دراسات المناعي أن spastin يموضع إلى هياكل منقط المنفصلة، ​​والتي تعرض توزيع محيط بالنواة (الشكل 3 A). تميل هذه الهياكل لزيادة الحجم مع فترة أطول من التعبير وملء نهاية المطاف السيتوبلازم. تجارب المناعي مزدوجة استبعد احتمال أن هذه المقصورات قد تتوافق مع العضيات المعروفة، مثل الميتوكوندريا، peroxisomes، في وقت مبكر والإندوسومات في وقت متأخر أو الجسيمات الحالة (لا تظهر البيانات). وقد لاحظنا نفس النمط من التعبير في أنواع الخلايا الأخرى مثل هيلا (الشكل 3 B)، U2OS وGN11، خط خلية العصبية ال اتش ار اتش. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام المروجين مختلفة والحواتم (HA مقابل MYC أو GFP) إما المتمركزة على N- أو C-المحطة لن تتغير توطين spastin.

الشكل 1. تمثيل تخطيطي للبنيات spastin المستخدمة في هذه الدراسة. يشار إلى المجال AAA من قبل الشريط الرمادي. يتم عرض موقف N-المحطة أو C-محطة من علامات مختلفة. الأرقام للدلالة على بقايا الحالية في بداية ونهاية كل بناء والمجال AAA.


الشكل 2. تجزئة التحت خلوية تشير إلى أن spastin لديها توطين حشوية. و transfected خلايا كوس-7 إما مع pMT21-MYC ناقلات فارغة أو مع بناء spastin-MYC. تم تجهيز ثمانية وأربعين ساعة عينات بعد ترنسفكأيشن لجعل حشوية (C)، والنووي (N) الكسر. وكان كل من الكسور ثم ركز بواسطة مناعي، تعرض لالكهربائي على هلام الأكريلاميد 10٪ تليها immunoblotting مع الأجسام المضادة 9E10.


الشكل 3. التحليل المناعي للأعرب عابر من النوع البري spastin. يظهر Spastin-MYC على منقط توطين منفصلة حشوية سواء في كوس-7 (A) وخلايا هيلا (B) بعد 24 ساعة من التعبير. عندما تحققت مستويات منخفضة من التعبير (مواد وطرق)، spastin يموضع إلى منطقة محيط بالنواة منفصلة (C). التحليل المناعي مزدوج باستخدام spastin-GFP (إشارة خضراء) بناء وعلامات المناسبة (إشارة حمراء)، وكشف أن هذا مجال التعبير في القرب من جهاز جولجي (D)، إلى أستر أنيبيب (E)، والجسيم المركزي (F وG). في (G)، سهام تشير إلى centrosomes. استخدمت الاجسام المضادة ضد 58 كيلو دالتون البروتين جولجي، ألفا تويولين وGTU88 للكشف عن جهاز جولجي، الأنابيب الدقيقة والجسيم المركزي، على التوالي.

ثم أننا تصميم التجارب ترنسفكأيشن من أجل رصد توطين spastin في الخلايا التي هي مجرد بداية للتعبير عن بناء (مواد وطرق). في ظل هذه الظروف، مضان spastin معين المسمى واحد فقط منطقة محيط بالنواة (الشكل 3 C). يقع هذه المنطقة بالقرب من جهاز جولجي (الشكل 3 D)، ويتوافق مع مركز زهور النجمة أنيبيب، وفقا لتقييم وضع العلامات مزدوج مع المضادة للα تويولين الأضداد (الشكل 3 E). هذا مجال التعبير على مقربة من الجسيم المركزي التي كشفت عنها-γ تويولين تلطيخ (الشكل 3 F و G). وتشير هذه البيانات إلى أن بداية التعبير spastin قد تكون في مركز تنظيم أنيبيب وذلك على فترات أطول من التعبير، spastin قد تتراكم في المجاميع حشوية.
أعضاء آخرين من الأسرة AAA، مثل SKD1، katanin P60 وربط جبهة الخلاص الوطني والافراج عن ركائز البروتين في الطريقة التي تعتمد على النوكليوتيدات (24، +27 - 29). هذا قد يؤدي إلى جمعية عابرة في الجسم الحي مع أهدافها. ومع ذلك، يمكن كشف هذه الجمعيات بالتعبير عن المسوخ المهيمنة سلبية غير قادرة على ربط أو يتحلل ATP. لاختبار ما إذا كان هذا صحيحا أيضا لspastin، ونحن overexpressed طفرة تتميز كذلك (K388R)، الذي يقع في وكر A عزر أو P حلقة المجال AAA، وكما هو معروف لإلغاء ATP ملزم في أعضاء آخرين في الأسرة (27 ، 28، 30). تم العثور على هذا المسخ في المريض مع HSP، وبالتالي يمثل شكلهما من spastin (13). عندما تم transfected spastin K388R في كوس-7 الخلايا، في التعبير البدء بها لوحظ في مجال محيط بالنواة واحد، على غرار البروتين من النوع البري (الشكل 4 A). ومع ذلك، مع فترات أطول من التعبير، وهو نمط الخيطية، تذكرنا بالتعاون مع الهيكل الخلوي تم الكشف عن (الشكل 4 B). في بعض الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل لوحظ وجود مزيج من خيوط والمجاميع حشوية.

الرقم 4. Spastin K388R يموضع إلى الأنابيب الدقيقة. في جميع الحالات وأعرب K388R spastin كما الانصهار GFP في كوس-7 الخلايا ومرئيا بمثابة إشارة خضراء. هي ملطخة النوى مع هويشت، إشارة الزرقاء. تم الكشف عن خيوط الأنابيب الدقيقة والمتوسطة باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد α تويولين وvimentin، على التوالي، إشارة حمراء. يشار شارك في التعريب بواسطة إشارة صفراء في الصورة المدمجة (A). يبدأ Spastin التعبير K388R في المراسلات من أستر أنيبيب (A) والعائدات مع تراكم في البنى الخيطية (B). هذه الشعيرات تتوافق مع مجموعة فرعية من الأنابيب الدقيقة (C و D) ولا يشارك في توطين مع vimentin (E و F). يتم تبديل توزيع أنيبيب في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع اختفاء أستر، وتشكيل حزم محيط بالنواة سميكة (D). أيضا، يتأثر توزيع خيوط المتوسطة (F). وأكد جمعية أنيبيب عن طريق العلاج نوكودازول، مما يعطل كل من نمط الخيطية التعبير عن spastin (G) وشبكة أنيبيب (H). في بعض الحالات، كانت محمية حزم أنيبيب المسمى spastin من تأثير نوكودازول [سهام في (G و H)]. أعطى تعبيرا عن spastin K388R بناء في خطوط الخلايا الأخرى نتائج متطابقة أساسا (لا تظهر البيانات).

من أجل تقييم طبيعة خيوط، كنا الاجسام المضادة ضد α تويولين وvimentin في التجارب المشارك التعريب، للكشف عن الأنابيب الدقيقة والشعيرات المتوسطة، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، كان يعمل تلطيخ falloidin للتحقيق في علاقة محتملة مع الأكتين. أظهرنا أن خيوط وصفت في K388R spastin خلايا -transfected شارك في توطين مع α تويولين (الشكل 4 C و D)، وليس مع vimentin (الشكل 4 E و F) أو الأكتين (لا تظهر البيانات). لمزيد من تأكيد ربط K388R spastin إلى الأنابيب الدقيقة، كررنا هذه التجارب بعد علاج الخلايا مع نوكودازول، وهو دواء قادرة على حمل أنيبيب التحلل عن طريق تثبيط إضافة أحادية تويولين. في جميع الحالات، كان نوكودازول فعال في الحصول على تشتت متحولة spastin وتويولين أحادية داخل السيتوبلازم في معظم الخلايا (الشكل 4 G و H).
شارك في توطين K388R spastin مع الأنابيب الدقيقة يظهر السمات الخاصة. أولا، على الرغم من كل خيوط وصفت من قبل spastin متحولة يبدو أن تشارك في توطين مع الأنابيب الدقيقة، وصفت ليس كل الأنابيب الدقيقة الموجودة في الخلية spastin (الشكل 4 C و D). وتشير هذه البيانات إلى أن متحولة قد ربط مجموعة فرعية من الأنابيب الدقيقة. ثانيا، يبدو توزيع أنيبيب في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلى تغييرها، مع اختفاء أستر وتشكيل حزم محيط بالنواة سميكة وطويلة (الشكل 4 C و D). وتمشيا مع إعادة توزيع الأنابيب الدقيقة، تشتت خيوط المتوسطة ويبدو أيضا تتأثر في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل (الشكل 4 E و F). ثالثا، في بعض الحالات تظهر هذه الباقات لتكون أكثر مقاومة للعلاج نوكودازول، مما يوحي بأن spastin قد حمايتهم من التحلل (الشكل 4 H).

الزميلة Spastin مع الأنابيب الدقيقة عبر المنطقة-N محطة ل

نتائج هذا التعبير spastin يبدأ في وسط أنيبيب تنظيم وأن-أتباز خلل الزميلة متحولة مع الأنابيب الدقيقة في الجسم الحي دفعتنا للتحقيق في ما إذا كان spastin قد ربط الأنابيب الدقيقة استقرت التاكسول في المختبر. واستكملت مقتطفات من الخلايا transfected spastin مع التاكسول وطرد لميكروتثبول الرواسب والبروتينات المرتبطة بها. في هذه الظروف، وقد أثرى كامل طول spastin في جزء أنيبيب (الشكل 5 A). من أجل تعيين المفترض ملزم أنيبيب مجال، ونحن transfected اثنين من المسوخ الاصطناعية التي إما تم حذف المجال AAA (spastin Δ -AAA) أو الجزء N-محطة من spastin (spastin Δ -N) (الشكل 1). وتبين لنا أن spastin Δ -AAA الإبقاء على القدرة على المشاركة في الرواسب مع الأنابيب الدقيقة بلمرة في في المختبر فحص ملزمة، في حين خسر spastin Δ -N عليه (الشكل 5 A). تم الحصول على نفس النتائج في التجارب المناعي، حيث أظهر spastin Δ -AAA بناء نمط الخيطية التعبير عرضة للمعاملة نوكودازول (الشكل 5 B و C)، في حين عرضت spastin Δ -N تلطيخ حشوية منتشر (الشكل 5 D ). معا، وهذه البيانات تشير إلى أن spastin يتفاعل مع الأنابيب الدقيقة من خلال المنطقة-N محطة لها. التناقض بين البيانات التي تم الحصول عليها في المجراة في المختبر مع البرية من نوع spastin يمكن التوفيق على افتراض أن الربط الأنابيب الدقيقة هو عابر في الجسم الحي والتي ينظمها النشاط في المجال AAA. كل من حذف كامل نطاق AAA وطفرة مغلطة K388R تغيير قدرته على ربط ATP قادرون على إيقاع البروتين في حالة محددة أنيبيب. على العكس من ذلك، المجال AAA في حد ذاته غير قادر على ربط مع الأنابيب الدقيقة وتشكيل المجاميع.

يتفاعل الشكل 5. Spastin مع الأنابيب الدقيقة عبر ل-N محطة. (A) ملزم أنيبيب الفحص. و transfected خلايا كوس-7 مع spastin-MYC، أو spastin Δ -AAA أو spastin بنيات Δ -N. كانت لست] (L) من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إما لا تستكمل (- التاكسول) أو تكميل (+ التاكسول) مع 40 ميكرومتر التاكسول. بعد الترسيب على وسادة السكروز، طاف (S) وبيليه ويعاير (P) الكسور لspastin، spastin Δ -AAA، spastin Δ -N وكشف-α تويولين، وذلك باستخدام الأجسام المضادة المناسبة. عندما تستكمل لست] مع التاكسول، من أجل تحقيق الاستقرار الأنابيب الدقيقة بلمرة، تم الكشف عن كل من كامل طول البروتينات spastin وspastin Δ -AAA في بيليه مع الأنابيب الدقيقة بلمرة، في حين لا يزال spastin Δ -N في طاف. عن السيطرة، وعندما لا يتم التعامل مع العينات مع التاكسول، يتم الكشف عن البروتينات في جزء طاف بعد الترسيب. ويظهر التحليل المناعي من spastin Δ -AAA نمط الخيطية التعبير (B)، والتي تعطلت بسبب العلاج نوكودازول (C). على العكس من ذلك، يظهر بناء spastin Δ -N توطين حشوية منتشر (D)، مؤكدا أن spastin Δ -N بناء غير قادر على ربط الأنابيب الدقيقة سواء في المجراة في المختبر.

Spastin يفكك الأنابيب الدقيقة في الجسم الحي

القدرة Spastin لربط الأنابيب الدقيقة بطريقة تعتمد على ATP وتعديل توزيع أنيبيب والتشكل أدى بنا إلى افتراض أنه يمكن أن يكونوا متورطين في بعض جوانب ديناميات أنيبيب. آخر البروتين AAA من نفس فصيلة، P60 katanin، وقد تمت دراسة إلى حد كبير عن النشاط أنيبيب قطيعة إزاء الجسيم المركزي (23، 24، 31). لتقييم المفترض نشاط أنيبيب فك spastin في الجسم الحي، نحن العاملين مقايسة المستخدمة سابقا لقياس في الجسم الحي أنيبيب فك katanin ولها انواع معينة ايليجانس homolog MEI-1 (30، 32). في هذا الاختبار، يتم فحص الهيكل الخلوي أنيبيب المناعي لمكافحة تويولين في كوس-7 الخلايا معربا عن spastin-GFP وبالمقارنة مع خلايا untransfected المجاورة. عندما أعرب البرية من نوع spastin في كوس-7 الخلايا، لاحظنا انخفاض كبير في شدة تويولين المناعي في ~50٪ من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل (الجدول الشكل 6 A، B، D و E). وقد لوحظ انخفاض كثافة تويولين تلطيخ أبدا في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع K388R متحولة spastin أو مع GFP وحده. وعلاوة على ذلك، وهذا التأثير هو محدد لالأنابيب الدقيقة، ولا يؤثر على شعيرات متوسطة. أظهر التعرض المفرط للخلايا transfected spastin أن الأنابيب الدقيقة يتم تقسيم، مع نهاية النهايات للخيوط التعرف في حالات قليلة (الشكل 6 C و F). خيوط المتبقية لا تزال تنبعث من جسيم مركزي، ولكن البعد عن أستر وتقلص إلى حد كبير (الشكل 6 C و F).

الرقم 6. overexpression من النوع البري spastin يعزز أنيبيب التفكيك. في جميع الحالات وأعرب spastin لمدة 24 ساعة كما الانصهار GFP في كوس-7 الخلايا ومرئيا بمثابة إشارة خضراء. هي ملطخة النوى مع هويشت، إشارة الزرقاء. وكشف الأنابيب الدقيقة باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد α تويولين، إشارة حمراء. خلايا overexpressing spastin (A و D) تظهر كثافة أقل من-α تويولين تلطيخ (B و E) فيما يتعلق خلايا غير transfected. وعلاوة على ذلك، التعرض المفرط من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في (B) و (E) يدل على أن الأنابيب الدقيقة وتفكيكها، ويبدو مجزأة (C و F والآراء مكبرة).


الجدول 1.
آثار overexpression من spastin من النوع البري على التفكيك microtuble

توصيف وظيفي من الطفرات مغلطة spastin لوحظت في مرضى HSP

حتى الآن، كل الطفرات مغلطة spastin وجدت في المرضى الذين يعانون HSP تقع في نطاق AAA. والاستثناء الوحيد هو سيرين لاستبدال يسين في موقف 44 التي تم الإبلاغ عنها تحدث في الدولة متماثل (14). لقد أظهرنا بالفعل أن الزميلة K388R متحولة مع الأنابيب الدقيقة. كخطوة أولى للتحقيق في دور وظيفي لجميع الطفرات مغلطة المحددة في المرضى HSP، ونحن ننظر في توطين لهم التحت خلوية. ولذلك أدخلت العديد من الطفرات مغلطة spastin وجدت في المرضى الذين يعانون HSP في ناقلات التعبير المناسبة، من خلال الطفرات موقع الموجه (الجدول 2). وبناء على المعارف المتاحة على أفراد آخرين من أسرته، AAA، وتوقع الطفرات مغلطة في المجال AAA للتدخل إما مع ATP ملزم أو التحلل.

الجدول 2.
توطين التحت خلوية من أعرب عابر الطفرات مغلطة spastin ذكرت في المرضى الذين يعانون HSP

وأظهرت كل المسوخ نمط الخيطية، وهو ما يعادل بالتعاون مع الأنابيب الدقيقة، كما يتبين بعد العلاج نوكودازول من الخلايا. ملزمة أظهر أنيبيب نفس الخصائص التي تم وصفها أعلاه لطفرة K388R، أي تشكيل حزم محيط بالنواة سميكة، واختفاء أستر، و، في بعض الحالات، وزيادة المقاومة للعلاج نوكودازول. وكانت وهما الاستثناء الوحيد لإحلال S44L، والطفرة S362C أن تصرف مثل البروتين من النوع البري. الطفرة الأولى تكمن خارج AAA، في حين أن الثانية يؤثر على الحمض الأميني فقط في بداية المجال.
البروتينات AAA أداء مهامهم في المجمعات هومو أو مغاير بلازميدة قليلة القسيمات. من أجل تحديد ما إذا كان المسوخ مغلطة spastin يمكن أن تكون بمثابة المهيمنة سلبية وتتداخل مع التعبير البرية من نوع spastin، شاركنا في transfected spastin K388R -GFP أو spastin L426V -GFP مع HA-spastin ونظرت إلى توطين التحت خلوية في مزدوج الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. وجدنا أنه في جميع الحالات من شارك في ترنسفكأيشن، من النوع البري وبروتينات متحولة دائما المشارك المعربة (الشكل 7). في بعض خلايا transfected شارك البرية من نوع البروتين المسمى الأنابيب الدقيقة (الشكل 7 E). في حالات أخرى، فإن كلا من المسخ والبرية من نوع spastin المترجمة إلى بقع حشوية (الشكل 7 A و B). قد يعكس هذا السلوك مختلفة أسعار مختلفة للتعبير عن المسوخ نسبة إلى البروتين من النوع البري. هذه النتيجة تتفق مع عمل spastin يجري الاعتماد على تشكيل oligomers، وتجارب أخرى ضرورية لتأكيد هذه الفرضية.

الرقم 7. من النوع البري ومتحولة المجمعات شكل spastin في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. إما spastin L426V -GFP (A) أو spastin K388R -GFP (D) كانوا زملاء مع transfected البرية من نوع HA-spastin في كوس-7 الخلايا. كل من البروتينات المتحورة مرئية كما إشارة خضراء. هي ملطخة النوى مع هويشت، إشارة الزرقاء. نزلت من النوع البري HA-spastin باستخدام وحيدة النسيلة المضادة للHA الأجسام المضادة، إشارة الحمراء (B و E). يشار شارك في التعريب بواسطة إشارة صفراء في الصور المدمجة (C و F). في بعض خلايا transfected المشترك، سواء متحولة والبرية من نوع spastin المترجمة إلى بقع حشوية (A-C). وفي حالات أخرى يتم دمج البروتين من النوع البري في البرية من نوع / heterodimers متحولة مما أدى إلى نمط الخيطية التعبير (D-F).

نقاش

الأنابيب الدقيقة هي البوليمرات ديناميكية للغاية من مفارز ألفا و-β تويولين، التي تقدم الدعم المعماري للخلايا حقيقية النواة، وتنظيم العضيات غشائي ويكون بمثابة السكك الحديدية على طول الذي يتم نقل مكونات حشوية. الأنابيب الدقيقة تخضع إعادة تنظيم السريع لتشكيلها خلال دورة الخلية، ويمكن تبديل فجأة بين استطالة وتقصير. وقد تم تحديد العديد من البروتينات التي تتحكم في التغيرات في الهيكل الخلوي أنيبيب في الجسم الحي (+32 - +35). نحن الآن البيانات الحالية تشير إلى أن spastin يمكن أن تشارك في ديناميات أنيبيب، وفتح آفاقا جديدة لفهم التسبب في HSP.
نجد أن الزميلة spastin مع الأنابيب الدقيقة في المختبر والتي تتوسط هذا التفاعل حسب المنطقة-N محطة لها. في الجسم الحي، ويمكن الكشف عن جمعية أنيبيب فقط بالإعراب عن المسوخ التي تفتقر إلى المجال AAA كامل أو عيب في ATP ملزم أو التحلل، مشيرا إلى أن الربط لميكروتثبول هو عابر وتنظيمها من خلال الدولة ملزمة النوكليوتيدات المجال AAA. أعضاء آخرين من الأسرة AAA تعرض oligomerization ATP التي تعتمد عابرة في وجود الركيزة البروتين، وعند التحلل ATP، الخضوع لتغيير متعلق بتكوين الذي يؤدي إلى الإفراج عن الركيزة (24، 27). وهكذا، على هذه البروتينات، ملزمة للأهداف البروتين هو عابر في الجسم الحي. P60 katanin يربط الأنابيب الدقيقة في المختبر ولكن لم يظهر أبدا لتسمية الأنابيب الدقيقة في الجسم الحي (24، 30، 36). وبالمثل، فقد وجد جمعية Vps4 / SKD1 إلى الأغشية endosomal في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل أن تعتمد على الدولة ملزمة النوكليوتيدات المجال AAA (25، 26).
عدة أسطر من الأدلة تشير إلى أن قد يكون متورطا spastin في تنظيم ديناميات أنيبيب. أولا، overexpression من النوع البري spastin في كل من كوس-7 و خلايا هيلا النتائج في النمط الظاهري-أنيبيب التفكيك. وقد لوحظ هذا النمط الظاهري أبدا في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع متحولة spastin أو مع ناقلات فارغة، وغير محددة لالأنابيب الدقيقة. ثانيا، overexpression من المسوخ spastin مما يؤدي إلى التأسيسي ملزم لالأنابيب الدقيقة يؤدي الى إعادة توزيع مجموعة أنيبيب، مع اختفاء أستر وتشكيل حزم محيط بالنواة سميكة، والتي كانت مقاومة للعلاج نوكودازول في بعض الحالات. قد تبقى الأنابيب الدقيقة المغلفة spastin طويلة وغير محله بسبب اضطراب ديناميتها بسبب البروتين متحولة. ثالثا، spastin هو غاية مثلي ضمن المجال AAA إلى katanin P60 وMEI-1، واثنين من حفز أنيبيب ATPases، والتي تتطلب المائي ATP لتفكيك الأنابيب الدقيقة (23، 24، 31، 32، 37). Katanin هو مغاير P60 / P80، وجدت في centrosomes وأقطاب المغزل الإنقسامية، ويعتقد أن يكون مسؤولا عن الإفراج عن الأنابيب الدقيقة من نقاط التعلق centrosomal بها (36، 38). A دورا مماثلا، وإن كان ذلك في الانقسام الاختزالي، وقد وصفت لمجمع MEI-1 / MEI-2 في C.elegans (32). كلا katanin P60 وMEI-1 تتطلب P80 WD-التي تحتوي على 40 البروتينات وMEI-2، على التوالي، في استهداف لcentrosomes وتحفيز النشاط قطع أنيبيب بها (23، 30، 32). على الرغم من أن المناطق N-الطرفية من spastin، P60 katanin وMEI-1 لا تحفظ بشكل علني، في جميع الحالات التي تم تعيينها مجال ملزم أنيبيب لهذه المنطقة. وبالمثل، البروتين استهداف أفضل درس عضوا الأسرة AAA، NSF، ينطوي-N محطة المجال الخاص به (39).
على الرغم من spastin يمكن أن تشترك الخصائص الفنية مع البروتينات قطع أنيبيب المعروف أن هناك عدة قضايا لا تزال بلا حل. لم نتمكن من تحديد ما إذا كان spastin يربط الأنابيب الدقيقة في centrosomes أو طول امتدادها في الجسم الحي، وإذا كان هذا التفاعل المباشر أو بوساطة بالتعاون مع بروتين آخر. على الرغم من transfections نفذت من أجل تحقيق مستويات منخفضة جدا من التعبير يوحي التعريب ممكن من spastin في مركز تنظيم أنيبيب، ينبغي تفسير هذه البيانات بحذر والدراسات مع الاجسام المضادة المحددة للكشف سوف تكون هناك حاجة إلى البروتين الذاتية. إذا ملزمة لميكروتثبول يحدث أيضا خارج الجسيم المركزي، يبدو أن يقتصر على أية حال لمجموعة فرعية منها، مشيرا إلى أن هذه الجمعية هي دينامية وربما ترتبط إلى إعادة تشكيل الهيكل الخلوي. وأخيرا، يمكن أن النمط الظاهري-أنيبيب التفكيك الناجمة عن overexpression spastin في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل يستمد إما من تعزيز الكارثة التي تقلص من الأنابيب الدقيقة من غاياتهم أو عن طريق توليد فواصل الداخلية داخل خيوط مع آلية فك الحقيقية. تجاربنا لا تسمح للتمييز بين هذين الاحتمالين وقطع أنيبيب في فحوصات المختبر باستخدام بروتين spastin المنقى المؤتلف مطلوبة قبل احتساب spastin في عدد من البروتينات قطع أنيبيب المعروفة.
أظهرنا أن جميع الطفرات spastin مغلطة، التي تقع في المجال AAA، تصرفت كما المسوخ أتباز معيبة، تغيير قدرة spastin لتنظيم التفاعل مع هذا الهدف، وبالتالي تؤدي إلى التأسيسي ملزمة لالأنابيب الدقيقة. والاستثناء الوحيد هو استبدال S362C، والذي يقع في بداية الفورية المجال، مما يشير إلى أن هذه الطفرة لا تعطل وظيفة spastin مع آلية مختلفة. تجارب زملاء ترنسفكأيشن من النوع البري ومتحولة spastin تتفق مع كائن معقد تجميعها تحتوي على خليط من هذين الشكلين من البروتينات. إذا كان هذا هو الوضع الفسيولوجي أو ما إذا كان spastin هو جزء من مجمع مغاير بلازميدة قليلة القسيمات مع شريك آخر، على غرار katanin P60 وMEI-1، يحتاج إلى توضيح. وقد أظهرت دراسات سابقة من النمط الجيني-النمط الظاهري ارتباط أنه لا يوجد اختلاف في شدة الشلل النصفي التشنجي بين المرضى الذين يعانون من الطفرات مغلطة spastin وتلك الطفرات إيواء مما أدى إلى إنهاء البروتين من السابق لأوانه (13). كلما تم اختبار مستوى مرنا spastin في الأنسجة من المرضى الذين يعانون من هذا النوع الأخير من الطفرات، فقد وجد أن بانتظام انخفضت بشكل حاد. هذه النتائج تتفق مع عدم الاستقرار مرنا، ولقد اقترحت أن haploinsufficiency هو السبب الجزيئي للأمراض (18). ومع ذلك، بياناتنا تفتح إمكانية أن آلية إمراضي المهيمنة سلبية يمكن أن تشارك في المرضى الذين يعانون من الطفرات مغلطة spastin ويبرر دراسات أكثر تفصيلا لتقييم هذا الاحتمال.
Spastin هو بروتين أعرب على نطاق واسع (11)، ولكن النمط الظاهري المرض هو مقيد بشكل ملحوظ على محاور القشري. الأنابيب الدقيقة ضرورية لنمو محور عصبي والصيانة. النموذج الحالي بشأن الآلية التي يتم من خلالها إنشاء مجموعة أنيبيب من محور عصبي المتزايد هو أن الأنابيب الدقيقة والأنوية في centrosomes ومن ثم نقلها بنشاط على طول المحاور والتشعبات (40). وأظهرت التجارب التي تم microinjected الأجسام المضادة حجب الوظيفية ضد P60 katanin في الخلايا العصبية مثقف أن katanin دورا أساسيا للإفراج عن الأنابيب الدقيقة من الجسيم المركزي الخلايا العصبية، ولكن أيضا لتنظيم طولها بعد الإفراج عن (41). وأشارت هذه التجارب أنه في الخلايا العصبية، أنيبيب فك يمكن أن يحدث أيضا بعيدا عن الجسيم المركزي، كآلية للحفاظ على الأنابيب الدقيقة قصيرة بما فيه الكفاية ليتم نقلها بكفاءة إلى المحاور والتشعبات. ومن المغري إلى التكهن بأن spastin هو بروتين رواية تشارك في ديناميات أنيبيب في الخلايا العصبية. لائحة غرامة وظيفة spastin قد يكون حاسما في عمليات طويلة من العصبونات الحركية القشرية، حيث وجود نصف الجرعة العادية من البروتين يمكن أن يكون ضارا بالفعل.
في الختام، ونحن نقدم أدلة على أن spastin تشارك في ديناميات أنيبيب عن طريق الربط بشكل عابر إلى الأنابيب الدقيقة بطريقة تعتمد على أتباز وتعزيز التفكيك في الجسم الحي. على الرغم من أن الدراسات المستقبلية ستتناول إذا spastin هو البروتين قطع أنيبيب صحيح، تفتح هذه النتيجة آفاقا جديدة لفهم التسبب في HSP بسبب الطفرات spastin.

المواد والأساليب

جيل يبني spastin

وقد تضخمت المنطقة الترميز من كدنا] spastin بواسطة PCR باستخدام PFU I البلمرة (PROMEGA)، هيلا كدنا] كقالب والاشعال محددة مصممة على تسلسل المتاحة (11). ثم subcloned جزء مما أدى إلى إطار في ناقلات التعبير حقيقية النواة التالية: pMT21-MYC، pcDNA3-MYC-GFP وpcDNA3-HA. في التركيبات الناتجة عن ذلك، يتم وضع MYC وGFP به محطة C إلى المنطقة الترميز spastin، في حين أن العلامة HA-N هي محطة لها (الشكل 1).
وspastinΔ -AAA بناء (المقابلة لطفرة هراء C932G) تم إنشاؤه بواسطة PCR التضخيم مع الاشعال محددة، وذلك باستخدام PFU I كما البلمرة، وsubcloned في ناقلات pMT21-MYC. و-N بناء spastin Δ، تفتقر أول 241 الأحماض الأمينية من spastin، ولدت قبل هضم spastin-MYC بناء مع منظمة التعاون الاقتصادي RI- جمعية مهندسي البترول الأول، تليها Klenow I العلاج في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، وربط المصير. وأعادت ATG بعد ربط المصير. في كل حالة، تم تحديد سلامة الحيوانات المستنسخة عن طريق التسلسل المباشر.

في المختبر الطفرات

لإدخال طفرات نقطة، S44L، S362C، G370R، F831C، N386K، K388R، L426V، C448Y، R460L، R499C وA556V، إلى كل من spastin-MYC و / أو spastin-mycGFP يبني، في المختبر تم إجراء الطفرات باستخدام Quickchange موقع الموجه الطفرات مجموعة (Stratagene)، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. وبعد ذلك أكدت وجود طفرة النقطة تسلسل الحمض النووي. استخدمت الاشعال التالية: S44L، 5'-GCCCCTCCGCCCGAGTTGCCGCATAAGCGGAAC-3؛ S362C، 5'-GTTATTCTTCCTTGTCTGAGGCCTGAG-3؛ G370R، 5'-CCTGAGTTGTTCACAAGGCTTAGAGCTCCTG-3؛ F831C، 5'-GGCTGTTACTCTGTGGTCCACCTGG-3؛ N386K، 5'-GTCCACCTGGGAAGGGGAAGACAATGC-3؛ K388R، 5'-CTGGGAATGGGAGGACAATGCTGGC-3؛ L426V، 5'-GAAATTGGTGAGGGCTGTTTTTGCTGTGGCTCG-3؛ C448Y، 5'-GTTGATAGCCTTTTGTATGAAAGAAGAGAAGGG-3؛ R460L، 5'-GCACGATGCTAGTAGACTCCTAAAAACTGAATTTC-3؛ R499C، 5'-GGCTGTTCTCAGGTGTTTCATCAAACG-3؛ A556V، 5'-GCTTTGGCAAAAGATGTAGCACTGGGTCCTATC-3 ".

خطوط الخلايا والأجسام المضادة

قرد الكلى كوس-7 الخلايا، خلايا هيلا، GN11 (42) (يرجى التي تقدمها R.Maggi، ميلان) كان المثقف في المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco ولل(DMEM؛ Highclone) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (Highclone). وأنتج وحيدة النسيلة الأجسام المضادة لمكافحة MYC من 9E10 خلايا هجين (43). تم شراؤها وحيدة النسيلة المضادة للHA الضد من بابكو، وحيدة النسيلة المضادة للα تويولين (1: 250) من المسابر الجزيئية. كان من سيجما: ومكافحة 58K البروتين (100 1)، مضادة للγ تويولين (01:50 GTU88). تم الحصول على جميع الأجسام المضادة الثانوية للالمناعي من داكو، في حين أن الفجل البيروكسيديز (HRP) الأجسام المضادة -conjugated من أمرشام.

ترنسفكأيشن الخلية والمناعي

و transfected كل بنيات باستخدام lipofectamine وفقا للتعليمات التي قدمتها الشركة المصنعة (لايف تكنولوجيز). Transfections للحصول أجريت على مستوى منخفض التعبير التي يحتضنها الخلايا التي تحتوي على خليط-DNA lipofectamine لمدة 4 ساعات وتحديد الخلايا في وقت لاحق 2 ساعة. وقد نمت الخلايا إما coverslips على أو على chamberslides multiwell (نونك) في DMEM، و 10٪ FBS، transfected كما هو موضح، وثابتة في بارافورمالدهيد 4٪ / برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة. ل-γ تويولين المناعي، تم إصلاح الخلايا في الميثانول بنسبة 100٪ في -20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد التثبيت، تم permeabilized الخلايا في 0.2٪ تريتون X-100 / PBS لمدة 10 دقيقة، ومنعت في 10٪ مصل الخنازير لمدة 30 دقيقة. بعد حظر، وحضنت الخلايا التي تحتوي على الأجسام المضادة الأولية لمدة 2 ساعة والأجسام المضادة الثانوية المناسبة (1: 100) لمدة 1 ساعة. للكشف نوى، كانت ملطخة الخلايا باستخدام وصمة عار DNA محددة هويشت (سيغما). عند الطلب، تم علاج الخلايا مع 20 ميكرومتر نوكودازول (Calbiochem) لمدة 2.5 ساعة عند 37 ° C. وقد شنت الخلايا مع Vectashield (داكو) وفحصها تحت المجهر Axioplan (زايس) مجهزة مع كاميرا CCD Axiocam وAxiovision برامج التصوير الرقمي (زايس). ثم تم معالجة الصور باستخدام فوتوشوب 5.5 برنامج (أدوبي).

التفكيك أنيبيب في transfected كوس-7 خلايا

و transfected الخلايا مع spastin-GFP، spastin K388R -GFP، أو pcDNA3-GFP، الثابتة 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن وتحليلها بواسطة المناعي مزدوج باستخدام مضان GFP وحيدة النسيلة ضد α تويولين. تم تنفيذ ثلاثة على الأقل تجارب ترنسفكأيشن مستقلة لكل بناء. لكل تجربة، تم فحص 100 الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل لتقييم شدة مكافحة α تويولين تلطيخ. سجلنا خلية وجود النمط الظاهري-أنيبيب التفكيك فقط عندما كان موضع تقدير انخفاض هائل في تويولين مضان مقارنة مع الخلايا untransfected المجاورة. لتحليل سلامة الأنابيب الدقيقة في الخلايا مما يدل على انخفاض هائل في شدة-α تويولين تلطيخ، تم الحصول على صور مع وقتا أطول من التعرض.

تجزيء التحت خلوية ومناعي

وقد تم جمع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، معلق في المخزن A (10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.9، 1.5 ملي MgCl 2، 10 ملي بوكل، 0.5 ملي DTT، 0.5 ملي PMSF)، حضنت على الجليد لمدة 10 دقيقة والمتجانس. تم طرد العينات في 510 غ لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، وجمعت طاف وتخزينها ككسر حشوية. وكان بيليه معلق الناتجة في المخزن B (20 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.9، 1.5 ملي MgCl 2، 0.42 M كلوريد الصوديوم، و 25٪ الجلسرين، 0.2 ملي EDTA، 0.5 ملي DTT، 0.5 ملي PMSF)، المتجانس وحضنت على الجليد لمدة 30 دقيقة. وبعد ذلك طرد العينة في 12 900 جم لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية وتحليل طاف ككسر النووي. سواء كانت تتركز الكسور النووية وحشوية بواسطة مناعي للبروتين الأجسام المضادة 9E10. كانت مجزأة عينات من مناعي على 8٪ هلام SDS-بولكرلميد، نشف على الغشاء PVDF والتي كشفت عنها تحليل طخة مناعية.

فحص ملزم أنيبيب

وقد تم جمع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن و lysed في بيم-DNNA العازلة (80 ملي أنابيب الرقم الهيدروجيني 6.8، 1 ملم EGTA، 1 ملم MgCl 2، 0.5 ملي DTT و 150 ملي كلوريد الصوديوم، 1٪ NP-40) تستكمل مع مثبطات الأنزيم البروتيني في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تم طرد لست] في 610 غ لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. والعصارة الخلوية ثم تنقيته بواسطة centrifugations على التوالي في 000 10 غرام لمدة 10 دقيقة، في 21 000 جم لمدة 20 دقيقة، وعند 100 000 ز لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. بعد ذلك تستكمل كل طاف مع 1 ملم GTP (Boeringher) و 40 ميكرومتر التاكسول (المسابر الجزيئية) وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. كما أعدت عينات المقابلة دون التاكسول. والطبقات كل عينة على وسادة السكروز 15٪ وطرد في 30 000 جم لمدة 30 دقيقة في 30 ° C إلى الرواسب الأنابيب الدقيقة بلمرة. تم حفظ supernatants الناتجة عنها، وكان معلق الكريات في حجم مساو من عينة العازلة 1 × لالكهربائي وتحليل طخة مناعية.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
 

أدوات الموضوع
طريقة عرض الموضوع

تعليمات المشاركة
لا تستطيع إضافة مواضيع جديدة
لا تستطيع الرد على المواضيع
لا تستطيع إرفاق ملفات
لا تستطيع تعديل مشاركاتك

BB code is متاحة
كود [IMG] متاحة
كود HTML معطلة

الانتقال السريع


 المكتبة العلمية | المنتدى | دليل المواقع المقالات | ندوات ومؤتمرات | المجلات | دليل الخدمات | الصلب المشقوق وعيوب العمود الفقري | التوحد وطيف التوحد  | متلازمة داون | العوق الفكري | الشلل الدماغي | الصرع والتشنج | السمع والتخاطب | الاستشارات | صحة الوليد | صحة الطفل | أمراض الأطفال | سلوكيات الطفل | مشاكل النوم | الـربـو | الحساسية | أمراض الدم | التدخل المبكر | الشفة الارنبية وشق الحنك | السكري لدى الأطفال | فرط الحركة وقلة النشاط | التبول الليلي اللاإرادي | صعوبات التعلم | العوق الحركي | العوق البصري | الدمج التربوي | المتلازمات | الإرشاد الأسري | امراض الروماتيزم | الصلب المشقوق | القدم السكرية



الساعة الآن 12:49 AM.