#1  
قديم 12-13-2015, 04:13 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي خلايا دبقية قليلة التغصن النسب المساهمة الميزات الفريدة لمتلازمة ريت أمراض الأعصاب

 

http://www.jneurosci.org/content/33/48/18764.full





الطفرات في ميثيل الدليل السياسي الشامل بروتين 2 الجينات، Mecp2، ملزمة تؤثر في المقام الأول على المخ وتؤدي إلى مجموعة واسعة من الاضطرابات العصبية والنفسية، والأكثر شيوعا متلازمة ريت (RTT). على الرغم من أن أمراض الأعصاب من RTT غير مفهومة جيدا، وآلية الخلوية والجزيئية (ق)، والتي تؤدي إلى بدء المرض والتقدم، لم يتم بعد توضيح. ويعزى RTT في البداية فقط لاختلال الوظائف العصبية، ولكن تظهر الدراسات الحديثة لدينا ومصالح الآخرين أن RTT ليس الخلايا العصبية حصرا بل ينطوي أيضا على التفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. الأهم من ذلك، فقد أظهرت الدراسات أن الخلايا النجمية استعادة MeCP2 والخلايا الدبقية الصغيرة قادرة على التخفيف من تطور المرض في الفئران إلا MeCP2 فارغة. نحن هنا تبين أن نوع آخر من الخلايا الدبقية، قليلة التغصن، والأسلاف التي تشارك أيضا في مظهر من مظاهر أعراض محددة RTT. الفئران التي فقدت MeCP2 تحديدا في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب، على الرغم عموما وضعها الطبيعي، كانت أكثر نشاطا وضعت hindlimb الشبك الظواهر الشديدة. عكسيا، واستعادة MeCP2 في الخلايا النسب دبقية قليلة التغصن، في الفئران إلا MeCP2 فارغة، على الرغم من أن إطالة أقل ما يقال فقط حياتها، تحسنت بشكل ملحوظ العجز الحركي وhindlimb الشبك النمط الظاهري، سواء في الذكور والإناث الفئران، واستعادة كامل وزن الجسم في ذكور الفئران . وأخيرا، وجدنا أن مستوى بعض البروتينات المرتبطة المايلين كان لديه عجز في الفئران MeCP2 فارغة. التعبير عن MeCP2 في الخلايا قليلة التغصن من هذه الفئران استعادة جزئيا فقط التعبير عنها، مما يدل على أن هناك تأثير غير الخلية-الحكم الذاتي من قبل أنواع الخلايا الأخرى في أدمغة على التعبير من البروتينات المرتبطة المايلين في الخلايا قليلة التغصن.
المقدمة

متلازمة ريت (RTT) هو اضطراب طيف التوحد التي تسببها طفرات في الجين متفرقة ميثيل الدليل السياسي الشامل البروتين المرتبط X كروموسوم ملزم 2 (Mecp2) (أمير وآخرون، 1999). الفتيات ولدت مع RTT بلوغ مراحل التطور الطبيعية. ومع ذلك، في 12-18 شهرا من العمر، والتراجع، وفقدان الكلام والمهارات الحركية والمعاناة غيرها من المشاكل الخطيرة، بما في ذلك التخلف العقلي، وتشوهات في الجهاز التنفسي، نوبات الصرع، وتأخر النمو الشامل (Hagberg، 2002). وقد تم إنشاء العديد من النماذج الفأر مع الطفرات سلالة الجرثومية المختلفة في Mecp2، كل منها يلخص العديد من السمات المميزة لRTT (تشن وآخرون، 2001.؛ غي وآخرون، 2001.؛ Shahbazian وآخرون، 2002.). الأهم من ذلك، مشروط الضربة القاضية، (ك / س) من Mecp2 تحديدا في نتائج الدماغ في RTT النمط الظاهري مماثلة (تشن وآخرون، 2001)، مما يوحي بأن RTT ويتسبب في المقام الأول من اختلال وظيفي في MeCP2 في خلايا الجهاز العصبي المركزي.
في السابق، ويعزى RTT فقط إلى اختلال الوظائف العصبية. ومع ذلك، فقد أظهرت الدراسات التي أنفسنا والآخرين أن الدبقية متحولة، بما في ذلك الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة، هي جزء لا يتجزأ من مظاهر RTT، مما يؤثر على بنية الخلايا العصبية وظيفة (بلاص وآخرون، 2009.؛ Maezawa وجين، 2010؛ Lioy وآخرون. ، 2011؛. Derecki وآخرون، 2012). تظهر لنا الدراسات الحديثة أيضا أن مثل الخلايا العصبية، الخلايا النجمية من الفئران MeCP2 فارغة أيضا يحمل انخفاض تعقيد عملية (نغوين وآخرون، 2012). الأهم من ذلك، reexpression من MeCP2 تحديدا في الخلايا النجمية أو الخلايا الدبقية الصغيرة من الفئران RTT يحسن بشكل ملحوظ الأنشطة الحركية والسلوكيات، وكذلك يطيل عمر إلى وضعها الطبيعي تقريبا (Lioy وآخرون، 2011.؛ Derecki وآخرون، 2012.).
بين الخلايا الدبقية، خلايا دبقية قليلة التغصن النسب، بما في ذلك خلايا دبقية قليلة التغصن السلائف (نسمة، المعروف أيضا باسم NG2 الخلايا) و oligodendrocytes، والمشاركة الفعالة في الشبكات العصبية. بالإضافة إلى كونه الأسلاف لقليلة التغصن، يجد OPCs أيضا الحصول على مدخلات متشابك من الخلايا العصبية (Bergles وآخرون، 2010)، و oligodendrocytes، الخلايا myelinating في الدماغ، وتلعب أدوارا حاسمة في انتشار الإشارات العصبية (باومان وفام-دينه، 2001). وعلى الرغم من دورها المهم في وظيفة الدماغ، لم يتم التطرق السؤال الحرج وهو ما إذا كانت الخلايا دبقية قليلة التغصن النسب تساهم في RTT الأعصاب.
نحن هنا تبين أن الفئران التي تفتقر MeCP2 فقط في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب، على الرغم من وضعها الطبيعي بشكل علني، أكثر نشاطا مقارنة مع الأشقاء سيطرتهم ووضع شديد hindlimb الشبك النمط الظاهري، مما يدل على الشعور بالضيق العصبي العام. في الدراسات متبادلة، أدت التعبير عن MeCP2 فقط في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب في تحسن كبير من أعراض معينة RTT، بما في ذلك استعادة كامل من وزن الجسم في ذكور الفئران، وتحسن ملحوظ في hindlimb الشبك النمط الظاهري والنشاط الحركي العجز في كل من الفئران الذكور والإناث. عمر، ومع ذلك، كان لفترة طويلة أقل ما يقال فقط، التمييز بين دور قليلة التغصن والخلايا النجمية في هذه المعلمة. وأخيرا، حددنا بعض البروتينات المرتبطة المايلين الذي أصيب بإعاقة في أدمغة الفئران MeCP2 باطل التعبير. في حين أن التعبير انخفاض بروتين ملزمة المايلين (ب ب) أعيد جزئيا فقط على التعبير عن MeCP2 في الخلايا النسب دبقية قليلة التغصن، وظل التعبير ضعاف من البروتين المايلين شحم بروتيني (حزب العمال التقدمي) دون تغيير، مما يدل على أن هناك تأثير غير الخلية-الحكم الذاتي من قبل أنواع الخلايا الأخرى في الدماغ على التعبير عن هذه البروتينات في الخلايا قليلة التغصن من الفئران RTT.

المواد والأساليب

الحيوانات

تمت الموافقة على جميع الدراسات الحيوانية رعاية الحيوان المؤسسية واللجان استخدم في جامعة ستوني بروك وتتماشى مع المبادئ التوجيهية التي وضعتها المعهد الوطني للصحة.
Mecp2 إيقاف / ذ (غي وآخرون، 2007 تم الحصول عليها) (B6.129P2- Mecp2 tm2Bird / J) الفئران المعدلة وراثيا من مختبر جاكسون. وMecp2 loxJ / ص (تشن وآخرون، 2001.) (B6، 129S4- Mecp2 tm1Jae / Mmcd) تم الحصول على الفئران المعدلة وراثيا من MMRRC وNG2Cre (Ng2CreBAC) (. Komitova وآخرون، 2009) وقدمت الفئران المعدلة وراثيا من قبل الدكتور Colognato (جامعة ستوني بروك). لتوليد Mecp2 loxJ / ص / ذكور NG2Cre مزدوجة المعدلة وراثيا وجميع تتزاحم سيطرتهم (البرية من نوع [WT]، NG2Cre، وMecp2 loxJ / ذ)، عبرنا إناث الفئران متخالف لأليل Mecp2-السلمون المدخن (Mecp2 loxJ / +) مع ذكور الفئران متخالف لالتحوير NG2Cre. وقد استخدمت استراتيجية مماثلة لتوليد Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre أو Mecp2 إيقاف / + / NG2Cre والسيطرة على الفئران الضرورية (WT، NG2Cre، وMecp2 إيقاف / Y أو Mecp2 إيقاف / +). وقد استخدم الجيل F1 الماوس فقط في هذه الدراسة. تم مرمزة الفئران عن طريق الخزعات الذيل، وحددت لجنة المساواة العرقية flox وتسلسل بواسطة PCR باستخدام المجموعات التالية من الاشعال وفقا لتوصية من مختبر جاكسون: لMecp2 loxJ أليل، إلى الأمام، 5'-CAC CAC AGA AGT ACT ATG ATC -3 '؛ عكس، 5'-CTA GGT AAG AGC TCT TGT TGA-3 ". لMecp2 وقف أليل، إلى الأمام، 5'-AAC AGC AGT دول مجلس التعاون الخليجي TGC TCT TC-3؛ عكس متحولة، 5'دول مجلس التعاون الخليجي AGA GGC CAC TTG TGT AG-3؛ WT عكس، 5'-CTG TAT CCT TGG GTC AAG CTG-3 ". لأليل NG2Cre، إلى الأمام، 5'-CCG TAC ACC AAA ATT TGC C-3؛ عكس، 5'-ATC GCG AAC ATC TTC AGG-3 ". عندما تم تمييزها اللازمة، من الذكور والإناث باستخدام بادئات Y كروموسوم معين ZFY، إلى الأمام، 5'-AAG ATA AGC TTA CAT AAT CAC ATG GA-3؛ عكس، 5'-CCT ATG AAA TCC TTT GCT GCA CAT GT-3 ".

سجل المظهري

وسجل الفئران الذكور والإناث أسبوعيا أو كل أسبوعين، على التوالي. تم إزالة الفئران من القفص وطنهم ووضعها على مقاعد البدلاء، في نفس الوقت خلال النهار عندما يكون ذلك ممكنا. تم إجراء التهديف أساسا كما وصفنا سابقا (نغوين وآخرون، 2012). وسجل كل من الأعراض الخمسة، بما في ذلك التنقل، مشية، hindlimb الشبك، ورعاش، والحالة العامة ك 0 (تغيب الأعراض) (1)، (أعراض الحاضر)، أو 2 (أعراض شديدة).

المقايسات السلوكية

لجميع الدراسات السلوكية، كان أعمى المراقب إلى التركيب الوراثي.
رصد نشاط Digiscan.

وضعت الماوس في وسط قفص الفئران فارغ (44 سم × 21 سم) تقع داخل النشاط الحيوان علم البصريات Varimex-الصغرى متر (كولومبوس الآلات). 15 × 15 أشعة تحت الحمراء تعمل في إحداثيات س ص و 2 سم فوق قاعدة آلة تسجيل فواصل شعاع المرتبطة بالنشاط المتنقلة (فواصل شعاع التوالي) والنشاط الإجمالي (كل انقطاع شعاع) خلال فترة الملاحظة 20 دقيقة. وقد تم تحديد تحركات السيارات المعتمدة أو تربية كاملة (النشاط العمودي) وحيوان باستخدام أطرافه العلوية والسفلية لتصل جانب من القفص وتصمد جسمها.

Rotarod.

تم اختبار الفئران على المنتسبين الطبية (نموذج ENV-575M) Rotorod وركض بها "rotarod" التي تسيطر عليها ديل طراز OptiPlex مع منصة التشغيل ويندوز 98. كان الجهاز قضيب 30 سم لمدة ميكانيكية تنقسم إلى خمسة أقسام 6 سم بنسبة 4 أقراص بيضاء بلاستيكية. زادت سرعة دوران 4-40 دورة في الدقيقة من خلال مسار جلسة 5 دقائق. وكان الكمون في ثوان سقطن من rotarod المقياس الرئيسي تعتمد الكفاءة الحركية. تم اختبار كل فأر لمدة ثلاث محاكمات متتالية مع بقية 10 دقيقة بين كل دورة.

سلك شنق الاختبار.

وضعت الفئران على 44 سم طويلة أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ مع وقف التنفيذ 54 سم عن الأرض من قبل اثنين من أعمدة خشبية بحيث لا الكفوف الأمامية اتصال السلك. الكمون لتسقط على وسادة رغوة أدناه تم تسجيل الجهاز. الحد الأقصى شنق كان الوقت قبل إزالة 60 ثانية. تم اختبار كل فأر على ثلاث محاكمات متتالية دون راحة.

النشاط المفتوح المجال.

تم اختبار Mecp2 loxJ / ص / NG2Cre وMecp2 loxJ / ص الفئران في هذا الجهاز، الذي كان مربع ومصنوعة من الخشب مغطاة الفينيل (60 × 60 سم)، والجدران المحيطة به كانت 25 سم ارتفاع. تم تقسيم الساحة في 16 الساحات (10 × 10 سم). تركت الفئران لاستكشاف ساحة مفتوحة لمدة 10 دقيقة. ولقد تم تصوير المحاكمة. وقد أحصى عدد المرات الفئران عبرت خط.

ضوء مربع الظلام الاختبار.

وقدم ضوء / مربع الظلام (43 × 21 × 21 سم) من صندوق زجاجي شفاف ويتألف من مجلسين متصلة بواسطة افتتاح (5 × 5 سم) وتقع في الطابق في وسط الجدار الفاصل. وقد رسمت غرفة صغيرة (حجرة مظلمة) (14 × 21 سم) الأسود، وتركت الغرفة الكبيرة (مقصورة الخفيفة) (29 × 21 سم) شفافة. وضعت الفئران في غرفة مظلمة تواجه افتتاح غطت على الفور من قبل غطاء الظلام وسمح لاستكشاف الجهاز لمدة 5 دقائق. الكمون للخروج من غرفة مظلمة، وطول الوقت الذي يقضيه في الجانب ضوء مربع، وعدد الانتقالية (عدد من الزمن الحيوان مرت داخل وخارج الضوء وغرف مظلمة) تم تسجيلها.

تحليل لطخة غربية

والمتجانس الأنسجة كامل الدماغ في الخالط Dounce مع مدقة فضفاضة في ارتفاع الملح تحلل العازلة التي تحتوي على 20 م HEPES م، ودرجة الحموضة 7.9، 1.5 م م MgCl2، 0.2 م م EDTA، 420 م م كلوريد الصوديوم، 0.5 م م DTT، 20 ٪ الجلسرين ومثبطات الأنزيم البروتيني (روش). تم تنفيذ النشاف الغربي كما هو موضح سابقا (بلاص وآخرون، 2009). الأجسام المضادة الأولية المستخدمة هي كما يلي: الدجاج الأجسام المضادة لمكافحة MeCP2 (هدية سخية من الدكتور JM لاسال، جامعة كاليفورنيا ديفيس) (1: 10000) أو ماوس مكافحة MeCP2 (سيغما) (1: 2000)، والماوس المضادة -MBP (كوفانس) (1: 1000)، الأرنب مكافحة حزب العمال التقدمي (سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية) (1: 5000)، والماوس مكافحة CNPase (سيغما) (1: 5000)، والأرنب المضادة للسكري المايلين دبقية قليلة التغصن (MOG، Epitomics ) (1: 1000). كان يستخدم لمراقبة التحميل: أرنب مكافحة β الأكتين (Abcam) (5000 1). كانت الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة IRDye800 أو IRDye700، مترافق (LI-COR العلوم البيولوجية) (1: 10000). تم مسحها ضوئيا الأغشية باستخدام نظام التصوير أوديسي الأشعة تحت الحمراء (LI-COR العلوم البيولوجية)، وتم تحديد كثافة من عصابات الفائدة من الصور التي تم التقاطها باستخدام برنامج التصوير الأوديسة.

المناعية

تم إصلاحها الفئران عن طريق نضح transcardial مع PBS مخزنة بارافورمالدهيد 4٪ كما هو موضح سابقا (بلاص وآخرون، 2009). أزيلت العقول وpostfixed بين عشية وضحاها مع PBS مخزنة بارافورمالدهيد 4٪ في 4 درجات مئوية. وcryoprotected النسيج ثابتة مع السكروز 30٪ في برنامج تلفزيوني العازلة والمجمدة في الأمثل القطع المتوسطة (Neg50، ريتشارد ألان العلمي). وقد تم الحصول على مقاطع الاكليلية التي كتبها باجتزاء الأنسجة على HM505E MICROM ناظم البرد (الصناعات ناظم البرد) في 40 ميكرون سمك والحفاظ على -20 ° C في برنامج تلفزيوني مخزنة 50٪ الجلسرين حتى تحليلها. و immunostained المقاطع باستخدام أرنب المضادة للMeCP2 الأجسام المضادة (هدية سخية من الدكتور ME غرينبرغ، كلية هارفارد الطبية) (1: 500)، والدجاج مكافحة GFAP (ميليبور بحوث العلوم البيولوجية الكواشف) (1: 500)، والماوس مكافحة NeuN (ميليبور بحوث العلوم البيولوجية الكواشف) (1: 150)، خنزير غينيا مكافحة NG2 (هدية سخية من الدكتور WB Stallcup، معهد بيرنهام)، والماوس مكافحة CC1 (Calbiochem) (1: 100)، والماوس المضادة للS100β (سيغما ) (1: 2000)، والفأر مكافحة MBP (كوفانس) (1: 250)، تليها الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة مترافق إلى cyanine (مختبرات جاكسون ImmunoResearch). وتعززت MeCP2 المناعية باستخدام الأجسام المضادة streptavidin مترافق البيوتين الثانوية. وقد تم جمع الصور على زايس المسح بالليزر متحد البؤر LSM 510 المجهر.

إحصائيات

للمقارنة بين الأنماط الجينية اثنين في كل ضروب المعاملة أو نقطة زمنية، تم استخدام اختبار (ت) أو مان ويتني الاختبار. وقد استخدم في اتجاه واحد أنوفا أو اتجاهين المتكررة تدابير ANOVA للمقارنات متعددة المجموعة وتلتها هولم-Sidak اللاحق الاختبار في جميع الحالات. يتم عرض مستوى أهمية التأثير الرئيسي والتفاعل التالية في وصف كل اختبار معين في الأساطير الرقم. تم قبول الحد الأدنى قيمة p من 0.05 كما دلالة إحصائية في جميع أنحاء. وتعرض البيانات كما يعني ± SEM.

النتائج

تم استنفاد MeCP2 تحديدا في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب من Mecp2 loxJ / ص / NG2Cre مخ الفأر

سابقا، أظهرنا أن MeCP2 موجود في كل الخلايا الدبقية WT، بما في ذلك يجد OPCs و oligodendrocytes بها متباينة، في الثقافات الأولية، وكذلك في ما بعد الولادة مخ الفأر (بلاص وآخرون، 2009). أكدنا وجود MeCP2 في يجد OPCs (خلايا NG2) من الدماغ WT وبينت أنه غائب في يجد OPCs من الدماغ RTT الماوس (الشكل 1 A). لتحليل الدور الذي يمكن أن تقوم به MeCP2 في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب، ونحن إنشاء Mecp2 ك / س نموذج الفأر NG2 محرض عن طريق عبور خط الماوس المعدلة وراثيا NG2Cre (Komitova وآخرون، 2009) مع خط الماوس تحمل floxed Mecp2 أليل (Mecp2 loxJ) (تشن وآخرون، 2001). درسنا نسل الذكور إيواء NG2Cre والأليلات Mecp2 loxJ (Mecp2 loxJ / ص / NG2Cre) لخصوصية Mecp2-السلمون المدخن الختان من قبل recombinase لجنة المساواة العرقية في يجد OPCs وقليلة التغصن متباينة. المناعية لMeCP2 وعلامات خلية محددة أكدت وجود MeCP2 في جميع أنواع الخلايا في الدماغ السيطرة على الفئران NG2Cre وغيابها محددة في يجد OPCs و oligodendrocytes في دماغ Mecp2 loxJ / ص / الفئران NG2Cre (الشكل 1 B) . على وجه التحديد، كان MeCP2 لا يمكن الكشف عنها في معظم يجد OPCs في مناطق الدماغ المختلفة (3-11٪ NG2 + / MeCP2 + الخلايا) من Mecp2 loxJ / ص / الفئران NG2Cre لكنها ظلت موجودة في الخلايا العصبية (93-98٪ NeuN + / MeCP2 +) والخلايا النجمية (90-96٪ GFAP + / Mecp2 + الخلايا) (الشكل 1 الجدول 1). وعلاوة على ذلك، أعرب 8٪ فقط من الخلايا قليلة التغصن ناضجة (CC1 +) MeCP2 في الجسم الثفني من هذه الفئران (الشكل 1 الجدول 1). الختان محدد من الكاسيت Mecp2-السلمون المدخن من قبل NG2Cre في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب يتزامن مع تحليل مصير نشرت الخلايا NG2 في الفئران المعدلة وراثيا المزدوج NG2Cre / ROSA26R (Komitova وآخرون، 2009).

الشكل 1.
يتم استنفاد البروتين MeCP2 تحديدا من خلايا دبقية قليلة التغصن النسب في أدمغة Mecp2 loxJ / ص / الفئران NG2Cre صور الممثل من أقسام الدماغ من WT وRTT. (Mecp2 J. - / ذ) (. تشن وآخرون، 2001) ذكور الفئران coimmunolabeled لMeCP2 (الخضراء) وNG2 (الحمراء). دابي (الأزرق) يمثل تلطيخ النووي. وأعرب عن MeCP2 (الأخضر) في يجد OPCs (NG2 +، أحمر) في قرن آمون من الفئران WT وغائبة في الفئران RTT. أشرطة النطاق، 20 ميكرومتر. صور الممثل من أقسام الدماغ تبين وجود MeCP2 في جميع أنواع الخلايا في الدماغ من NG2Cre الفئران الذكور وغيابها معين في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب (NG2 + وCC1 + الخلايا) في دماغ MeCP2 loxJ / ص / NG2Cre الفئران الذكور. تم coimmunolabeled أقسام للMeCP2 (الخضراء) وعلامة العصبية (NeuN والأحمر) في منطقة التلفيف المسنن، MeCP2، ونجمي (GFAP، أحمر) أو يجد OPCs (NG2، أحمر) علامات في الحصين، وMeCP2 وتنضج علامة oligodendrocytic ( CC1، أحمر) في الجسم الثفني. دابي (الأزرق) يمثل تلطيخ النووي. أشرطة النطاق، 20 ميكرومتر. السهام تشير colocalization أو غياب MeCP2 في GFAP، NG2، أو خلايا CC1 إيجابي.


الجدول 1.
خصوصية وإعادة التركيب الكفاءة في مناطق مختلفة من Mecp2 loxJ / ص / NG2Cre مخ الفأر ل

فقدان MeCP2 في دبقية قليلة التغصن النسب خلايا النتائج في العجز السلوكية RTT مثل انتقائية

درسنا ما إذا كانت الفئران Mecp2 loxJ / ص / NG2Cre تطوير أي الظواهر RTT مثل العلنية مقارنة مع الفئران MeCP2 باطل تحمل نفس التحور (Mecp2 J .- / ذ) (تشن وآخرون، 2001). لهذا، كانت الحيوانات وسجل أسبوعيا بعد نظام الرصد المظهرية التهديف (0-10) هو موضح سابقا (غي وآخرون، 2007.؛ نغوين وآخرون، 2012.، لمدة خمس الظواهر النموذجية RTT): قابلية التنقل والمشية، hindlimb الشبك، والهزات ، والحالة العامة. كما نشرت سابقا (تشن وآخرون، 2001)، وضعت الفئران MeCP2 باطل الظواهر RTT العلنية ابتداء من الساعة 4-5 أسابيع من العمر، والتي تزداد سوءا مع مرور الوقت، وبلغ درجة من 6-10 بين 9 و 15 أسبوعا من العمر ( الشكل 2 A)، وتوفي قبل الأوان (الشكل 2 B). وكان في المقابل، Mecp2 loxJ / ص / NG2Cre ذكور الفئران عمر العادي؛ ومع ذلك، فإنها وضعت RTT تشبه النمط الظاهري معتدل ابتداء من الساعة ~10 أسابيع من العمر وتتقدم إلى النتيجة الإجمالية من 2 في 20 أسبوعا من العمر (الشكل 2 C). وكانت نتائج كل السيطرة على الفئران littermate، بما في ذلك WT، NG2Cre، وMecp2 loxJ الفئران الذكور، 0 أو على مقربة 0 في جميع نقاط الوقت (الشكل 2 C). على وجه التحديد، عرضت على Mecp2 loxJ / ص / NG2Cre الفئران الفراء مملة، وقدم بعض منهم انتصاب الشعر. وأظهرت نسبة منخفضة (~20٪) من السيطرة على الفئران ص Mecp2 loxJ / معتدل hindlimb الشبك النمط الظاهري (الشكل 2 D) من المحتمل بسبب hypomorphic Mecp2-السلمون المدخن أليل. في الواقع، التحليل الكمي لطخة غربية والمناعية للمناطق الدماغ المختلفة أظهرت انخفاض طفيف MeCP2 التعبير في Mecp2 loxJ / الفئران ص بالنسبة إلى تتزاحم WT الخاصة بهم (الشكل 3 A، B). ومع ذلك، فإن نسبة أعلى بكثير (~60٪) من Mecp2 loxJ / ص / NG2Cre الفئران hindlimb الشبك النمط الظاهري مقارنة مع سيطرتهم Mecp2 loxJ / تتزاحم ص، الذي كان أيضا أكثر شدة وتشارك الشبك أكثر تواترا من كلا hindlimbs (الشكل. 2 E).

الرقم 2.
فقدان MeCP2 التعبير فقط في نتائج خلايا دبقية قليلة التغصن النسب في hindlimb الشبك وزادت السيارات الظواهر النشاط. A، B، عشرات المظهرية (A) وكابلان ماير دوام البقاء على قيد الحياة (B) من الفئران MeCP2 فارغة (Mecp2 J. - / ذ) مقارنة مع السيطرة على الفئران WT D، عشرات المظهرية ونسبة hindlimb الشبك، على التوالي، من Mecp2 loxJ / ص / NG2Cre والسيطرة littermate الفئران الذكور أشار صور توضح hindlimb الشبك النمط الظاهري لل. Mecp2 loxJ / ص / الماوس NG2Cre مقارنة بالكنترول Mecp2 loxJ / ص الماوس. Rotarod الاختبار. سلك شنق الاختبار. ضوء / مربع مظلم الاختبار. J، إجمالي والرأسي اختبار النشاط المعتمدة في النشاط digiscan رصد، على التوالي. مجموع النشاط في الاختبار الميداني الطلق. عدد الفئران في B مماثلة لتلك التي في عدد الفئران في D مماثلة لتلك التي في عدد الفئران في G مماثلة لتلك التي في H. ألوان الرسوم البيانية والرسوم البيانية تتوافق مع الأنماط الجينية أشار (أعلى / يمين). اتجاهين المتكررة تدابير ANOVA (النمط الجيني والوقت)، يليه هولم-Sidak اللاحق لعدة مقارنات الاختبار كان يستخدم لتحليل البيانات في C و F-G. في اتجاه واحد ANOVA تليها هولم-Sidak اللاحق لعدة مقارنات الاختبار كان يستخدم لتحديد الاختلافات بين الجماعات المشار إليها في H-K. أشرطة الخطأ تشير يعني ± SEM. * P <0.05، فروق ذات دلالة إحصائية بين Mecp2 loxJ / ص / NG2Cre الماوس مقارنة مع تتزاحم التحكم الأخرى (WT، Mecp2 loxJ / ص، NG2Cre) في بين الأول والمحاكمة الثالثة في G؛ وبين المجموعات الماوس المشار إليها في H-K.


الرقم 3.
يتم تقليل التعبير عن MeCP2 في Mecp2 loxJ / ص مخ الفأر مقارنة مع تلك التي في مخ الفأر WT. لطخة غربية الكمية تظهر انخفاضا في مستويات MeCP2 في مناطق المخ المشار إليها من Mecp2 loxJ / الفئران ص مقابل السيطرة على الفئران WT في 32 أسابيع من العمر. خدم الأكتين كما تحميل السيطرة. المناطق صور الممثل المناعية من القشرة (أعلى) وقرن آمون (أسفل) Mecp2 loxJ / ص والسيطرة الفئران WT immunolabeled لMeCP2 (الخضراء). دابي (الأزرق) يمثل تلطيخ النووي. لذلك، المتجهة الطبقة. الحمر، طبقة الهرمية؛ ريال الطبقة المشععة. أشرطة النطاق: قاع والألواح أعلى اليسار، 100 ميكرون. اللوحة العلوية اليمنى، 50 ميكرون.

نحن ثم درست الأداء السلوكي للفئران Mecp2 loxJ / ص / NG2Cre في 32 أسبوعا من العمر، عندما تتعرض الإجمالية النتيجة أعراض قد وصلت إلى هضبة ~2 (الشكل 2 C). وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن هذه الفئران ليس لديها عجز في التنسيق الحركي، قوة قبضة، أو السلوكيات مثل القلق مقارنة مع تتزاحم سيطرتها، والمقررة من قبل rotarod، والأسلاك شنق، والضوء / اختبارات مربع الداكنة، على التوالي (الشكل 2 F- H). لم يتأثر تعلم المهارات الحركية للMecp2 loxJ / ص / NG2Cre الفئران إما أدائها في rotarod زادت بشكل كبير بين الأولى والتجارب الثالثة (الشكل 2 F). كما هو متوقع، بسبب أليل hypomorphic (الشكل 3)، في اختبار digiscan، كانت Mecp2 loxJ / الفئران ص أقل نشاطا من تتزاحم WT أو NG2Cre التحكم (الشكل 2 I، J). والمثير للدهشة، ولكن، Mecp2 loxJ / ص / أظهرت الفئران NG2Cre زيادة في النشاط الكلي والرأسي مقارنة مع Mecp2 loxJ / ص الفئران، ليصل إلى مستوى قريب من WT وNG2Cre الفئران (الشكل 2 I، J). وقد أكد هذا أكبر مقارنة مستوى النشاط في اختبار حقل مفتوح فيها Mecp2 loxJ / ص / الفئران NG2Cre عبرت أكثر بكثير خطوط (70٪ و 100٪ أكثر من الخطوط في يوم 1 ويوم 2 تجارب) من Mecp2 loxJ / الفئران ص في جلسة 10 دقيقة (الشكل 2 K).

يتم استعادة MeCP2 التعبير على وجه التحديد في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب من Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre مخ الفأر

كما غياب MeCP2 فقط في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب أدت إلى الظواهر RTT جزئية، سألنا عما إذا التعبير MeCP2 طبيعي في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب في الفئران إلا MeCP2 فارغة، يمكن إنقاذ، على الأقل جزئيا، والأعراض الشبيهة RTT. لهذا، عبرنا متخالف الفئران NG2Cre الذكور مع إناث الفئران متخالف التي تحتوي على لجنة المساواة العرقية -excisable تسلسل إيقاف النسخي في Mecp2 الجين الذاتية (Mecp2 إيقاف / +) (غي وآخرون، 2007)، لتوليد ذرية من الذكور إيواء التحوير وNG2Cre أليل Mecp2 إيقاف (Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre)، وتتزاحم السيطرة، بما في ذلك WT، NG2Cre، وMecp2 إيقاف / ص ذكور الفئران. أكدنا أول مرة من قبل المناعية للMeCP2 وعلامات خلية محددة أن الخلايا العصبية (NeuN +)، النجمية (GFAP +)، يجد OPCs (NG2 +)، و oligodendrocytes الناضجة (CC1 +) في دماغ Mecp2 إيقاف / كانت الفئران ص ناقصة ل (MeCP2 4 الشكل A). نحن بعد ذلك فحص ما إذا كان وأعرب عن MeCP2 تحديدا في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب في دماغ الفئران Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن 75-85٪ من يجد OPCs (NG2 +) في مناطق مختلفة من الدماغ، بما في ذلك القشرة، الحصين، والمخطط، و 90٪ من الخلايا قليلة التغصن ناضجة (CC1 +) في الجسم الثفني تعبير عن MeCP2 (الشكل 4 باء؛ الجدول 2). التعبير عن بروتين MeCP2 غير محددة لخلايا دبقية قليلة التغصن النسب كما يدل على ذلك عدم وجود MeCP2 في الغالبية العظمى من الخلايا العصبية (0.5٪ -4.3٪ NeuN + / MeCP2 +) والخلايا النجمية (1٪ -2.2٪ GFAP + / + MeCP2 ) من مناطق الدماغ المختلفة (الشكل 4. الجدول 2). كنا ندرك من الملاحظة السابقة أن مجموعة فرعية من الخلايا النجمية الجبلة، والتي كانت GFAP سلبية ولكن S100β إيجابية في المنطقة البطنية من القشرة، وقد استمدت من الخلايا معربا عن NG2Cre (تشو وآخرون، 2008). لذلك، أيضا أحصينا الخلايا التي هي S100β + / + MeCP2 في هذا المجال محددة؛ في حين أن معظم الخلايا S100β أعربت MeCP2 في الفئران WT٪ فقط 11-12 reexpressed MeCP2 في Mecp2 إيقاف / ص / الفئران NG2Cre (الشكل 4. أسفل؛ الجدول 2).

الرقم 4.
يتم استعادة البروتين MeCP2 تحديدا في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب في أدمغة Mecp2 إيقاف / ص / الفئران NG2Cre. صور الممثل من أقسام الدماغ من Mecp2 إيقاف / ص ذكور الفئران تبين غياب العالمي للMeCP2 في جميع أنواع الخلايا. تم coimmunostained المقاطع مع MeCP2 (الخضراء) وعلامة العصبية (NeuN والأحمر) في منطقة المسنن التلفيف، MeCP2 مع نجمي (GFAP والأحمر)، ويجد OPCs (NG2، أحمر) علامات في الحصين، وMeCP2 مع ناضجة دبقية قليلة التغصن علامة ( CC1، أحمر) في الجسم الثفني. دابي (الأزرق) يمثل النووي تلطيخ. صور الممثل المناعية من أقسام الدماغ من Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre ذكور الفئران تبين تعبيرا محددا من MeCP2 في يجد OPCs (NG2 +) و oligodendrocytes (CC1 +) ولكن ليس في S100β + أو GFAP + الخلايا النجمية وNeuN + الخلايا العصبية. وكما أشار خلية محددة علامات ومناطق الدماغ في A. أشرطة النطاق: 20 ميكرون. السهام تشير colocalization أو غياب MeCP2 في GFAP، S100β، NG2، أو خلايا CC1 إيجابي.


الجدول 2.
خصوصية وإعادة التركيب الكفاءة في مناطق مختلفة من Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre مخ الفأر ل

التعبير عن MeCP2 فقط في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب يعيد جزئيا بعض الظواهر RTT مثل العلنية في الفئران RTT الذكور والإناث

قمنا بتحليل أولا ما إذا كان التعبير MeCP2 طبيعي في خلايا النسب دبقية قليلة التغصن يمكن انقاذ بعض الظواهر RTT مثل الكلاسيكية التي سبق وصفها لMecp2 إيقاف / ص الفئران (غي وآخرون، 2007) فضلا عن غيرها من الفئران MeCP2 فارغة (تشن وآخرون .، 2001؛. غي وآخرون، 2001) (الشكل 2 A، B) أو تأخر بدايتها. لهذا، Mecp2 إيقاف / ص / الفئران NG2Cre وتتزاحم ضبط نفس العمر وتركزت الأسبوعية وسجل بعد نظام التسجيل المظهري الرصد (0-10) المذكورة أعلاه. على الرغم من أن الفئران WT وNG2Cre ليس له أعراض، كما هو متوقع، أظهرت Mecp2 إيقاف / الفئران ص التقدم الشديد في درجات أعراض الإجمالية تليها الفتك، مع بقاء 50٪ في 13 أسبوعا من العمر (الشكل 5 A، C). Mecp2 إيقاف / ذ وأظهرت / NG2Cre ذرية حركية مماثلة من تطور أعراض مثل Mecp2 إيقاف / ص الفئران (الشكل 5. A)؛ ومع ذلك، وهي نسبة أقل بكثير من هذه الفئران طورت hindlimb الشبك النمط الظاهري (~40٪) مقارنة مع Mecp2 إيقاف / الفئران ص (~65٪) (الشكل 5 B). بالإضافة إلى ذلك، تم تمديد عمر Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre الفئران عن طريق ~3 أسابيع مقارنة مع Mecp2 إيقاف / الفئران ذ مع بقاء 50٪ في 16 أسبوعا من العمر (الشكل 5 C). وعلاوة على ذلك، في حين كانت Mecp2 إيقاف / ص الفئران من نقص الوزن، واستعادة وزن الجسم للMecp2 إيقاف / ص / NG2Cre الفئران تماما على مستوى WT السيطرة وNG2Cre الفئران littermate الذكور (الشكل 5 D). وتشير هذه البيانات إلى أن التعبير عن MeCP2 فقط في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب يمكن جزئيا أو كليا استعادة بعض الظواهر RTT مثل العلنية، على الرغم من أن تقصير عمر وتحسنت بشكل طفيف فقط.

الرقم 5.
التعبير عن MeCP2 في الخلايا النسب دبقية قليلة التغصن ينقذ جزئيا بعض الملامح RTT تشبه في Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre الذكور وMecp2 إيقاف / + / NG2Cre إناث الفئران. A-D، عشرات المظهرية، نسبة الشبك hindlimb والبقاء كابلان-ماير، و هيئة دوام الوزن، على التوالي، من Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre وlittermate أشار السيطرة على الفئران الذكور. B، D، وعدد من الفئران هي مماثلة لتلك المشار إليها في A. E-G، وعشرات المظهرية، نسبة hindlimb الشبك، ووزن الجسم الوقت بطبيعة الحال، على التوالي، من Mecp2 إيقاف / + / NG2Cre والسيطرة littermate أشار إناث الفئران. G، وعدد من الفئران يشبه مبين في E. واستخدمت الرموز الذكور والإناث في الشكل للتمييز بين جنس مجموعة كل حيوان. اتجاهين المتكررة تدابير ANOVA (النمط الجيني والوقت)، يليه هولم-Sidak اللاحق لعدة مقارنات الاختبار كان يستخدم لتحليل البيانات في A، D،G و. . أشرطة الخطأ تشير يعني ± SEM # ف <0.05، فروق ذات دلالة إحصائية بين الضوابط WT، NG2Cre ذكور الفئران، وMecp2 إيقاف / ص وMecp2 إيقاف / ص / NG2Cre الفئران الذكور في بين الضوابط WT، NG2Cre إناث الفئران، وMecp2 إيقاف / + وMecp2 إيقاف / + / NG2Cre إناث الفئران في G. * P <0.05، فروق ذات دلالة إحصائية بين Mecp2 إيقاف / ص الفئران وWT، NG2Cre، وMecp2 إيقاف / ص / NG2Cre littermate الفئران الذكور في D. لا يمكن إجراء الحسابات الإحصائية لعمر أكثر من 12 أسبوعا بسبب زيادة عدد الوفيات في Mecp2 إيقاف / ص و/ ص / NG2Cre مجموعة الماوس Mecp2 إيقاف.

في البشر، RTT يظهر في الغالب في الفتيات. ولذلك، فإننا أيضا بتحليل تأثير استعادة MeCP2 التعبير في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب على النمط الظاهري RTT تشبه في إناث الفئران متخالف. تحقيقا لهذه الغاية، Mecp2 إيقاف / + / NG2Cre تم رصد إناث الفئران وسيطرتهم WT، NG2Cre، وMecp2 إيقاف / + littermate إناث الفئران مرة كل أسبوعين لوزن الجسم وأعراض RTT مثل العلنية. مثل Mecp2 إيقاف / ص / ذكور NG2Cre، أظهرت الإناث Mecp2 إيقاف / + / NG2Cre مماثلة عشرات أعراض الكلي للMecp2 إيقاف / + إناث (الشكل 5 E). على الرغم من وجود اتجاه التحسن في درجات أعراض الإجمالية كان ملحوظا في Mecp2 إيقاف / + / NG2Cre إناث الفئران، كان nonsignificant إحصائيا (الشكل 5 E). لكن، وكما في Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre ذكور الفئران، وهي نسبة أقل بكثير من الإناث Mecp2 إيقاف / + / NG2Cre (~20٪) وضعت hindlimb الشبك النمط الظاهري مقارنة مع Mecp2 إيقاف / + الفئران (~40٪) (الشكل 5 F). بما يتفق مع الدراسات السابقة (. غي وآخرون، 2007)، وتشير البيانات المتوفرة لدينا أنه بعد فترة طبيعية من التنمية، أصبحت الإناث Mecp2 إيقاف / + الفئران انطلاق يعانون من السمنة المفرطة في ~26 أسابيع من العمر. و38 أسبوعا من العمر، وزنه 20٪ أكثر من WT أو NG2Cre سيطرة تتزاحم الإناث (الشكل 5 G). زيادة الوزن يتزامن مع بدء الأعراض في Mecp2 إيقاف / + إناث الفئران، لتصل إلى الهضبة المقابلة لدرجة إجمالية مقدارها 4 البداية في 36 أسبوعا من العمر (الشكل 5 E).ومن المثير للاهتمام، في حين أن النمط الظاهري الوزن من Mecp2 إيقاف / ص ذكور الفئران تم انقاذ بالكامل من خلال استعادة MeCP2 في الخلايا النسب دبقية قليلة التغصن في Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre الفئران (الشكل 5 D)، والنمط الظاهري يعانون من زيادة الوزن لوحظ في Mecp2 إيقاف / + الفئران وهو ما يحدث عادة للإناث الفئران RTT (غي وآخرون، 2007)، لم يكن انقاذ في Mecp2 إيقاف / + / NG2Cre إناث الفئران (الشكل 5 G).

استعادة MeCP2 في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب بشكل كبير على تحسين العجز السلوكية RTT تشبه محددة في الذكور والإناث الفئران RTT

الفئران ناقص لMeCP2 تثبت النشاط الحركي، قوة قبضة، والتخلف عن القلق (غي وآخرون، 2001.؛. ماكجيل وآخرون، 2006؛ سانتوس وآخرون، 2007؛. ستيرنز وآخرون، 2007). درسنا ما إذا كانت بعض العجز السلوكية من الفئران MeCP2 لاغيا وتحسين في Mecp2 إيقاف / NG2Cre الفئران. أخضعنا الذكر Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre الفئران وتتزاحم سيطرتهم الاختبارات السلوكية في 9-10 أسابيع من العمر، وهي مرحلة عندما Mecp2 إيقاف / ص وMecp2 إيقاف / ص / NG2Cre كانت الفئران لا أعراض شديدة، وبلغ متوسط النتيجة 5-6 (الشكل 5 A). كما هو متوقع، وقوة التنسيق الحركي وforelimb من Mecp2 إيقاف / ص الفئران الذكور وضعف ملحوظ لأنها سقطت بشكل أسرع من نظرائهم WT وNG2Cre تتزاحم سيطرة الذكور في rotarod والأسلاك تعليق الاختبارات (الشكل 6 A، C). ومن المثير للاهتمام، وMecp2 إيقاف / ص / NG2Cre الفئران أداء أفضل بكثير من Mecp2 إيقاف / ص الفئران وبقيت مرتين أطول في المحاكمات 2 و 3 في السلك شنق اختبار (الشكل 6 C). في الواقع، في درب 2، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين أدائها وأداء WT وNG2Cre تتزاحم الذكور. كان هناك أيضا اتجاه التحسن في أداء Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre الفئران مقارنة مع Mecp2 إيقاف / ص الفئران في الاختبار rotarod، على الرغم من أنه كان nonsignificant إحصائيا (الشكل 6 A). وكانت تحسينات مماثلة قوة ملحوظة في التجربة الرصد digiscan. في حين أن Mecp2 إيقاف / ذ بدعم كان النشاط العمودي٪ فقط ~30 من WT وNG2Cre النشاط littermate، وMecp2 إيقاف / ص / NG2Cre تحسنت الفئران حتى ~65٪ من مستوى النشاط للWT وNG2Cre الفئران الذكور (الشكل. 6 E)، مما يدل على ترميم كبيرة من قوة hindlimb. في الاختبارات digiscan، Mecp2 إيقاف / ص أظهرت انخفاضا كبيرا في النشاط الحركي، ليصل إلى 35٪ فقط من نشاطهم السيطرة littermate (الشكل 6 G). الأهم من ذلك أن النشاط الحركي من Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre وتحسنت الفئران حتى ~70٪ من مستوى النشاط للWT السيطرة وNG2Cre الفئران الذكور (الشكل 6 G). وعلاوة على ذلك، لوحظ تعزيز النشاط الحركي أيضا في ضوء / التجارب مربع المظلمة فيه عدد من مجموع التحولات بين المقصورات الداكنة والفاتحة للMecp2 إيقاف / ص / NG2Cre تم استعادة الفئران تماما على مستوى WT وNG2Cre سيطرة الذكور الفئران، في حين أن عدد من التحولات من Mecp2 إيقاف / ذ كان الفئران٪ فقط ~40 مستوى WT الفئران الذكور (الشكل 6 I). إجمالي الوقت الذي يقضيه في ضوء أو حجرة مظلمة والكمون للخروج من الظلام هي نفسها لجميع المورثات (لا تظهر البيانات)، مشيرا إلى عدم وجود فروق في السلوك مثل القلق بين هذه الفئران.

الرقم 6.
التعبير عن MeCP2 في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب في Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre الذكور وMecp2 إيقاف / + / NG2Cre إناث الفئران تنقذ جزئيا بعض العجز السلوكية RTT. تعرض الفئران الذكور والإناث للاختبارات سلوكية المشار إليها في 9-10 أسابيع أو 1 سنة من العمر، على التوالي. A، Rotarod اختبار للذكور (A) والإناث (B) الفئران. C، سلك تعليق اختبار ل الذكور (C) وإناث الفئران (D). E-H، عمودي دعم النشاط (E، F) والنشاط الإجمالي (G، H) الاختبارات في رصد نشاط digiscan. G، ذكور. H، الإناث. I ، الضوء / الظلام اختبار مربع للذكور الفئران. ألوان الرسوم البيانية والرسوم البيانية تتوافق مع الأنماط الوراثية المشار إليها في أسفل الزاوية اليمنى. واستخدمت الرموز الذكور والإناث في الشكل للتمييز بين جنس مجموعة كل حيوان. اتجاهين المتكررة تدابير ANOVA (النمط الجيني والمحاكمة)، يليه هولم-Sidak اللاحق لعدة مقارنات الاختبار كان يستخدم لتحليل البيانات في A-D. يليه في اتجاه واحد ANOVA من قبل هولم-Sidak اللاحق لتم استخدامها عدة مقارنات اختبار لتحديد فروق بين المجموعتين في E-I. أشرطة الخطأ تشير يعني ± SEM. A-D، * ع <0.05، فروق ذات دلالة إحصائية بين Mecp2 إيقاف مجموعة الماوس مقابل جميع الفئات الأخرى. ** ف <0.05، فروق ذات دلالة إحصائية بين كل من Mecp2 وقف وMecp2 إيقاف / NG2Cre المجموعات الماوس مقابل WT وNG2Cre مجموعة littermate. # ع <0.05، فروق ذات دلالة إحصائية بين Mecp2 إيقاف / NG2Cre مجموعة الماوس مقابل Mecp2 إيقاف مجموعة littermate. ## ص <0.05، فروق ذات دلالة إحصائية بين Mecp2 إيقاف مجموعة الماوس مقابل WT وNG2Cre مجموعة littermate. ### ص <0.05، فروق ذات دلالة إحصائية بين Mecp2 إيقاف / NG2Cre مجموعة الماوس مقابل جميع الفئات الأخرى. A، C، G، I، وعدد من الفئران هي مماثلة لتلك المشار إليها في E. B، D، H، وعدد من الفئران هي مماثلة لتلك المشار إليها في F.

بعد ذلك، قمنا بتقييم سلوك الأنثى Mecp2 إيقاف / + / NG2Cre الفئران عندما كانوا 12 شهرا من العمر، وهي مرحلة عندما أعراضهم استقرت وصلت إلى درجة متوسط ​​من 4-5 (5 الشكل E). مثل الذكور Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre الفئران، وجدنا أن النشاط الحركي للإناث Mecp2 إيقاف / + / NG2Cre الفئران التي تم قياسها في اختبار digiscan وتحسنت تصل إلى 90٪ من مستويات نشاط WT أو NG2Cre إناث الفئران، في حين نشاط Mecp2 إيقاف / + والفئران 60٪ فقط من السيطرة littermate الإناث الفئران منها (الشكل 6 H). في rotarod والأسلاك تعليق الاختبارات، والإناث Mecp2 إيقاف / + الفئران أظهرت عجز في التنسيق الحركي والقوة forelimb مقارنة مع تتزاحم السيطرة؛ ومع ذلك، كان لا تحسن ملحوظ في هذه المعلمتين لMecp2 إيقاف / + / NG2Cre الفئران (الشكل 6 B، D). من ناحية أخرى، فإن النشاط تربية بدعم من Mecp2 إيقاف / + / NG2Cre تم استعادة الفئران ل~90٪ من مستوى السيطرة على الفئران WT (الشكل 6 F)، مما يشير إلى تحسن قوة hindlimb كبير، والذي يسمح للحيوانات لتصمد أجسامهم بصورة انتقالية، على عكس Mecp2 إيقاف / + الفئران (الشكل 6 F). ومن المرجح أن ضعف أداء Mecp2 إيقاف / + / NG2Cre الفئران في rotarod وفي السلك تعليق الاختبارات، التي تحتاج إلى دعم كامل الجسم والتنسيق، ويرجع ذلك إلى النمط الظاهري يعانون من السمنة المفرطة لها (الشكل 5 G). معا، البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن MeCP2 التعبير في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب في الدماغ إلا MeCP2 الصفرية إلى التقليل بعض العجز السلوكية التي لوحظت في الفئران RTT من الذكور والإناث.

يتم تبديل التعبير عن البروتينات المشاركة في إنتاج المايلين في Mecp2 إيقاف / ص الفئران ولكن فقط استعادة جزئيا في Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre الفئران

درسنا أولا ما إذا كان غياب MeCP2 فقط في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب يؤثر على التعبير عن البروتينات الرئيسية المشاركة في إنتاج المايلين. قمنا بتحليل التعبير البروتين من الجينات ذات الصلة المايلين في ما بعد الولادة اليوم 16 (P16)، وهو الوقت الذي تكون الميالين يحدث بنشاط في الدماغ الأمامي. وأظهر التحليل الكمي لطخة غربية عدم وجود فروق في التعبير البروتين من CNPase (2، 3'-دوري-النوكليوتيدات-3'-فوسفودايستريز)، MOG (المايلين دبقية قليلة التغصن بروتين سكري)، MBP، أو حزب العمال التقدمي (المايلين البروتين شحم بروتيني) بين WT، Mecp2 loxJ / ص، وMecp2 loxJ / ص / NG2Cre الفئران (الشكل 7 A).

الرقم 7.
التعبير MeCP2 في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب ينقذ جزئيا فقط نمط التعبير المنحرف من البروتين MBP في الفئران RTT. A، وفقدان MeCP2 فقط في النسب دبقية قليلة التغصن لا يؤثر على نمط التعبير البروتينات التي تؤثر في تكون الميالين. التحليل الكمي لطخة غربية تظهر مستويات التعبير البروتينات التي تؤثر في تكوين المايلين في مقتطفات كامل الدماغ من P16 Mecp2 loxJ / ص / NG2Cre والسيطرة على الفئران المشار إليها. التعبير عن MeCP2 في Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre الفئران استعادة جزئيا فقط لوحظ انخفاض التعبير عن MBP في Mecp2 إيقاف / ص الفئران. التحليل الكمي لطخة غربية تظهر التعبير المنحرف من MBP وحزب العمال التقدمي في مقتطفات كامل الدماغ من P16 Mecp2 إيقاف / ص الفئران واستعادة جزئية من MBP التعبير في Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre العمر المتطابقة الفئران littermate. إعادة MBP الصور مبائر الجسم الثفني (CC) و(ST) المناطق المخطط للWT وMecp2 إيقاف / ص العقول. CTX، اللحاء. LV، البطين الجانبي. أشرطة النطاق، 200 ميكرون. D، التكبير عالية من المناعية MBP في مناطق الجسم الثفني. السهام تشير سمك MBP تلطيخ في منطقة الجسم الثفني المحسوبة في E. الرسوم البيانية التي تمثل سمك MBP تلطيخ في منطقة الجسم الثفني من WT، Mecp2 إيقاف / ص، وMecp2 إيقاف / ص / NG2Cre العقول. تم استخدام ما معدله ثلاثة قياسات طول الجسم الثفني لكل صورة لحساب سماكة. في اتجاه واحد ANOVA تليها هولم-Sidak اللاحق كان يستخدم لعدة مقارنات اختبار لتحديد فروق بين المجموعتين في A، B و E. أشرطة الخطأ تشير يعني ± SEM. * ع <0.05. ن = 3 الفئران في التركيب الوراثي.

نحن ثم تحليلها التعبير عن نفس البروتينات في مقتطفات كامل الدماغ من Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre الفئران في P16. وأظهر تحليل لطخة غربية أي تغييرات في التعبير عن CNPase وMOG البروتينات بين أنواع مختلفة من الفئران. ومع ذلك، والتعبير عن MBP والبروتينات حزب العمال التقدمي تم تغيير بشكل كبير في Mecp2 إيقاف / ص الفئران مقارنة مع WT أو NG2Cre الفئران (الشكل 7 B). على وجه التحديد، فقد انخفض MBP التعبير ~40٪، وزيادة مستوى البروتين حزب العمال التقدمي تصل إلى ~200٪ من مستوى في WT والعمر المتطابقة NG2Cre السيطرة على الفئران littermate (الشكل 7 B). عندما قمنا بتحليل تعبير عن نفس البروتينات في Mecp2 إيقاف / ص / NG2Cre أدمغة فئران، وجدنا أنه في حين ظل مستوى PLP الشاذة، لم يكن سوى استعادة مستوى MBP جزئيا إلى ~60٪ من مستوى الرقابة WT أو NG2Cre الفئران (الشكل 7 B). قمنا بتحليل كذلك نمط التعبير عن MBP في P16 التي كتبها المناعية وجدت أن تم تخفيض هناك تعبير عن MBP في الجسم الثفني والمخطط من Mecp2 إيقاف / ص الفئران مقارنة مع الفئران WT (الشكل 7 C). نحن أيضا تقييمها سمك MBP في الجسم الثفني وجدت انخفاضا كبيرا في Mecp2 إيقاف / ص الدماغ مقارنة مع تلك الفئران littermate WT (الشكل 7. D، E)؛ ومع ذلك، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين سمك MBP بين Mecp2 إيقاف / ص الفئران وMecp2 إيقاف / ص / NG2Cre الفئران (الشكل 7 D، E). معا، وتشير هذه البيانات إلى أن التعبير عن MeCP2 في الخلايا قليلة التغصن في الفئران إلا MeCP2 الصفرية لم يكن لها تأثير (حزب العمال التقدمي) أو تأثير خفيف فقط (ب ب) على استعادة البروتينات التي تؤثر في تكون الميالين وتشير إلى أن هناك من المحتمل أن يكون غير الخلية-مستقلة تأثير على التعبير عن هذه البروتينات في الخلايا قليلة التغصن.

نقاش

أدلة متزايدة تدعم الرأي القائل بأن RTT ليس حصرا اضطراب الخلايا العصبية بل المرض الذي ينطوي أيضا على التفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. وأشارت دراساتنا الأخيرة ومصالح الآخرين أن اثنين على الأقل من أنواع الدبقية، الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة، الخلايا العصبية المتأثرة سلبا بطريقة غير الخلية-ذاتية الحكم وتساهم في تطور المرض (بلاص وآخرون، 2009.؛ Maezawa وجين، 2010؛ Lioy وآخرون، 2011.؛. Derecki وآخرون، 2012). هنا، نحن اختبار للمساهمة في RTT من نوع ثالث من الخلايا الدبقية، قليلة التغصن والخلايا الاصلية، ويجد OPCs. وجدنا أنه على الرغم من وجود بعض التداخل في مساهمات قليلة التغصن والخلايا النجمية لبدء الأعراض RTT الشبيهة، وبقدرتهم على إنقاذ الظواهر RTT، كانت بعض الملامح الفقهي إلى النسب oligodendrocytic.
فقدان MeCP2 من خلايا دبقية قليلة التغصن النسب، كما في نجمية ك / س نموذج الفأر، أدت إلى النمط الظاهري معتدل بشكل عام. A السلوك الفريد بوساطة فقدان MeCP2 من خلايا دبقية قليلة التغصن النسب، لكن كانت هناك زيادة نسبيا النشاط، والتي كانت مشابهة إلى مستوى WT من النشاط ولكن مرتفعة مقارنة مع نشاط floxed Mecp2 ذكور الفئران. وهذا هو المرجح النمط الظاهري الحجية لأن ك النسب دبقية قليلة التغصن / س الفئران تحتوي على نفس الأليل floxed كما floxed Mecp2 الفئران، وهذا الأخير يتطور ضعف RTT تشبه النمط الظاهري مع مرور الوقت، بما في ذلك نقص نشاطها معتدل، الناتجة عن أليل hypomorphic (التين. 2 و3). وأبلغ عن درجة معينة من العجز السلوكية الناجمة عن أليل hypomorphic أيضا عن آخر Mecp2-السلمون المدخن نموذج الفأر (Mecp2 B. السلمون المدخن / ذ) (ساماكو وآخرون، 2008.)؛ ومع ذلك، فإن انخفاض مستوى MeCP2 والعجز السلوكية في نموذج الفأر (Mecp2 J. السلمون المدخن / ص كان) ونحن المستخدمة في الدراسات الحالية أكثر اعتدالا. على الرغم من تعزيز النشاط كما لوحظ في دبقية قليلة التغصن ك / س الفئران ليست واحدة من الظواهر RTT الكلاسيكية، Mecp2 S421A؛ S424A (الضربة القاضية في الفئران، التي تضعف MeCP2 الفسفرة، زادت الحركة. تاو وآخرون، 2009). وعلاوة على ذلك، المرضى الذين يعانون من طفرة-C محطة (R294X) هم مفرط (شحرور والزغبي، 2007؛. Temudo وآخرون، 2011). وهكذا، والطفرات في Mecp2 يمكن أن يؤدي إلى النمط الظاهري فرط النشاط، في الفئران والبشر، وربما تعكس وظائف محددة بوساطة مختلف المجالات في MeCP2. ومع ذلك، هناك ما يبرر إجراء المزيد من الدراسات لنفهم تماما هذا النمط الظاهري.
في النموذج الإنقاذ، على الرغم من أن الفئران لا يزال توفي قبل الأوان، العديد من الأعراض RTT مثل وتحسنت بشكل ملحوظ في كل من الذكور والإناث RTT الفئران عن طريق استعادة MeCP2 في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب. على وجه التحديد، المهارات الحركية، بما في ذلك النشاط، والقوة، والتنسيق، وتحسنت بشكل ملحوظ. وهكذا، وجميع أنواع الدبقية معربا عن MeCP2 يبدو قادرة على استعادة، على الأقل جزئيا، ومستويات السيارات من الفئران RTT الذكور والإناث (Lioy وآخرون، 2011.؛. Derecki وآخرون، 2012؛ Lioy وماندل، اتصال شخصي؛ الشكل. 6). هذه النتائج توحي معا أن فقدان MeCP2 من أنواع الدبقية مختلفة من الفئران RTT والمرضى من المرجح له آثار المضافة على العجز الحركة.
مقارنة مع الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة، لديها خلايا دبقية قليلة التغصن النسب معربا عن MeCP2 قدرة أكثر اعتدالا نسبيا لإطالة العمر. هذا التأثير التفاضلي يمكن أن يكون نتيجة لزيادة قدرة الخلايا النجمية وقد تم تجديده MeCP2 والخلايا الدبقية الصغيرة على خلايا دبقية قليلة التغصن النسب وقد تم تجديده MeCP2 لعكس العيوب التنفس في الفئران MeCP2 فارغة (Lioy وآخرون، 2011.؛. Derecki وآخرون، 2012) . على الرغم من أن ليس هناك الكثير من المعلومات عن دور الخلايا الدبقية الصغيرة في التنفس، وقد ثبت النجمية على وجه الخصوص أن تلعب دورا هاما في تنظيم الخلايا العصبية حساس للكيماويات (Gourine وآخرون، 2010). وبالإضافة إلى ذلك، على عكس الخلايا النجمية (Lioy وآخرون، 2011)، وكانت قادرة على تحسين السلوك مثل القلق التي لوحظت في الفئران RTT خلايا دبقية قليلة التغصن النسب معربا عن MeCP2. ومع ذلك، أظهرت الفئران الانقاذ دبقية قليلة التغصن تحسنا في hindlimb الشبك النمط الظاهري الذي هو RTT تشبه أعراض بارزة في الفئران. كان هذا التحسن ليس واضحا في الفئران مع الخلايا النجمية وقد تم تجديده MeCP2 أو الخلايا الدبقية الصغيرة (Lioy وآخرون، 2011.؛ Derecki وآخرون، 2012.، والبيانات لا تظهر). ومن المثير للاهتمام، على عكس الفئران الذكور التي تم ترميمها بالكامل النمط الظاهري يعانون من نقص الوزن، والنمط الظاهري السمنة احظ عادة في الفئران RTT الإناث ولكن ليس في المرضى RTT لم انقاذهم من قبل استعادة MeCP2 في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب. معا، والمقارنة بين الظواهر في الفئران MeCP2 ناقصة وانقاذ الأنساب الدبقية مختلفة تشير إلى أن مثل فرعية العصبية المختلفة (تشن وآخرون، 2001.؛. Fyffe وآخرون، 2008؛. تشاو وآخرون، 2010)، هناك أيضا مساهمات التفاضلية ومحددة من الخلايا الدبقية مختلفة لRTT الأعصاب.
كان فقدان MeCP2 تحديدا في يجد OPCs و oligodendrocytes المتباينة أي تأثير على مستوى التعبير العديد من البروتينات التي تؤثر في تكوين المايلين، وهي المهمة الرئيسية لهذا النسب. ومن المثير للاهتمام، والفئران MeCP2 باطل الذكور المستخدمة في هذه الدراسة لم تظهر التعبير المنحرف من اثنين على الأقل من البروتينات المرتبطة المايلين وفيرة في الجهاز العصبي المركزي الثدييات. MBP وحزب العمال التقدمي (يان وآخرون، 2009). ومع ذلك، أدت استعادة MeCP2 في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب في هذه الفئران فقط في استعادة جزئية لمستوى MBP، في حين أن مستوى PLP لا يزال أعلى من المعتاد. هذه النتائج نستنتج أن MeCP2 التعبير في الخلايا قليلة التغصن له تأثير ضئيل على التعبير عن البروتينات المرتبطة المايلين وكذلك تشير إلى أن هناك الأرجح تأثير غير الخلية-مستقلة على التعبير عن هذه الجينات من أنواع الخلايا الأخرى في الدماغ، وتفتقر MeCP2. يمكن بوساطة هذه الآثار غير الخلية-الحكم الذاتي من قبل الخلايا العصبية و / أو النجمية، وهي معروفة للتأثير الميالين بواسطة إفراز جزيئات الإشارة. على سبيل المثال، عامل نمو سرطان الدم، LIF، وهو ما يعزز المايلين التي قليلة التغصن ناضجة، يتم تحريرها من قبل الخلايا النجمية في الاستجابة لاعبي التنس المحترفين المحررة من المحاور اطلاق امكانات العمل (ستيفنز وآخرون، 2002). مثال آخر هو الإفراج عن الغلوتامات من الحويصلات المشبكية على طول المحاور التي تعزز المايلين الاستقراء من خلال تحفيز تشكيل المجالات الإشارات الغنية بالكوليسترول بين الخلايا قليلة التغصن والمحاور، وزيادة توليف المحلي للبروتين رئيسي في غمد المايلين، MBP (ويك وآخرون .، 2011).
بشكل جماعي، وتوفر دراستنا المزيد من الدعم لفكرة أن أنواعا مختلفة من الخلايا في الدماغ تساهم بشكل مختلف لRTT الأعصاب، بطريقة خلية مستقلة وغير الخلية-الحكم الذاتي، من خلال التفاعلات الدينامية بين مختلف الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. على هذا النحو، على الرغم من إزالة كل مكان أو reexpression من MeCP2 يمكن تلخيص أو عكس، على التوالي، ومجموعة كاملة من أعراض RTT (تشن وآخرون، 2001.؛. غي وآخرون، 2007؛. ماكجرو وآخرون، 2011؛. شوفال وآخرون، 2012؛ نغوين وآخرون، 2012... روبنسون وآخرون، 2012)، وفقدان أو استعادة MeCP2 في أنواع معينة من الخلايا يبدأ إلا بصورة جزئية أو ينقذ أعراض محددة RTT.http://www.jneurosci.org/content/33/48/18764.full

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
 

أدوات الموضوع
طريقة عرض الموضوع

تعليمات المشاركة
لا تستطيع إضافة مواضيع جديدة
لا تستطيع الرد على المواضيع
لا تستطيع إرفاق ملفات
لا تستطيع تعديل مشاركاتك

BB code is متاحة
كود [IMG] متاحة
كود HTML معطلة

الانتقال السريع


 المكتبة العلمية | المنتدى | دليل المواقع المقالات | ندوات ومؤتمرات | المجلات | دليل الخدمات | الصلب المشقوق وعيوب العمود الفقري | التوحد وطيف التوحد  | متلازمة داون | العوق الفكري | الشلل الدماغي | الصرع والتشنج | السمع والتخاطب | الاستشارات | صحة الوليد | صحة الطفل | أمراض الأطفال | سلوكيات الطفل | مشاكل النوم | الـربـو | الحساسية | أمراض الدم | التدخل المبكر | الشفة الارنبية وشق الحنك | السكري لدى الأطفال | فرط الحركة وقلة النشاط | التبول الليلي اللاإرادي | صعوبات التعلم | العوق الحركي | العوق البصري | الدمج التربوي | المتلازمات | الإرشاد الأسري | امراض الروماتيزم | الصلب المشقوق | القدم السكرية



الساعة الآن 01:46 PM.