متلازمة بارديه-بيدل

[رافت ابراهيم]

 

http://www.pnas.org/content/104/49/19422.full

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب غير المتجانسة وراثيا أن يؤدي إلى تنكس الشبكية، والسمنة، وضعف الادراك، polydactyly، تشوهات الكلى، ونقص الأعضاء التناسلية. من 12 جينات BBS المعروفة، BBS1 هو تحور الأكثر شيوعا، وطفرة مغلطة واحدة (M390R) يمثل ≈80٪ من الحالات BBS1. للحصول على نظرة ثاقبة وظيفة BBS1، ولدت لنا نموذجا knockin الماوس Bbs1 M390R / M390R. الفئران متماثل لطفرة M390R تلخيصها جوانب النمط الظاهري الإنسان، بما في ذلك تنكس الشبكية، العقم عند الذكور، والسمنة. كانت فئرانا معدلة وراثيا السمنة نهم وhyperleptinemic وعرضت خفض النشاط الحركي ولكن لا ارتفاع في متوسط ​​ضغط الدم الشرياني. تقييم الصرفي من Bbs1 التشريح العصبي في الدماغ متحولة كشف ventriculomegaly من البطينات الجانبية والثالث، رقيق من القشرة الدماغية، وتخفيض حجم المخطط الإحضار والحصين. وقد لوحظت تشوهات مماثلة أيضا في أدمغة Bbs2 - / -، Bbs4 - / -، وBbs6 - / - الفئران، وإنشاء هذه العيوب تشريحي عصبي باعتباره غير موصوف سابقا BBS نموذج الفأر النمط الظاهري. أظهر التركيبية النظر في أهداب الخلايا البطانة العصبية التي تبطن البطين الثالث الموسع لأدمغة متحولة Bbs1 أنه، في حين كان ترتيب 9 + 2 من الأنابيب الدقيقة axonemal سليمة، أهداب ممدود وأهداب مع نهايات القاصي تورم غير طبيعي كانت موجودة. جنبا إلى جنب مع البيانات من انتقال الإلكترون التحليل المجهري للخلايا مستقبلة للضوء ربط أهداب، طفرة Bbs1 M390R لا يؤثر على بنية axonemal، ولكنها قد تلعب دورا في تنظيم التجمع أهداب و / أو وظيفة.
متلازمة بارديه-بيدل [BBS، الانترنت وراثة مندلية في مان (OMIM) 209900] هو جسمية اضطراب المتنحية غير المتجانسة وراثيا تتميز السمنة، وتنكس الشبكية، polydactyly وضعف الإدراك، نقص الأعضاء التناسلية، والشذوذ الكلى، وكذلك التعرض لارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري السكري، والعجز الشم، وعيوب القلب الخلقية. وقد تم تحديد اثني عشر جينات BBS (BBS1-12) إلى تاريخ (1 - 14). أنها ترميز مجموعة من البروتينات يعتقد أن تلعب دورا في بنية أو وظيفة الأهداب، والهيئات القاعدية، والنقل داخل الخلايا (15، 16). الطفرات في BBS1 هي وحظ الأكثر شيوعا في BBS. طفرة مغلطة واحدة يحول كودون ميثيونين إلى كودون أرجينين (M390R) حسابات لل≈80٪ من الطفرات BBS1 ويشارك في 25٪ من جميع حالات BBS (5). تحدث الطفرة M390R بالقرب من المناطق المتوقع من المجالات البروتين ملفوف لفائف وتقع ضمن الحفاظ توقع WD40 مثل البروتين عزر. وتشارك هذه الزخارف البروتين في مثل هذه العمليات البيولوجية الأساسية كما نقل الإشارة، والتوليف RNA / التجهيز، والتجمع لونين، والاتجار حويصلي، والتجمع هيكل الخلية والتحكم في دورة الخلية، وموت الخلايا المبرمج (17).
مؤخرا، عرضت BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8، وBBS9 لتشكيل مستقر بروتين معقد ≈450 كيلو دالتون يسمى BBSome في شبكية العين الصباغ الظهارية (RPE) الخلايا المستزرعة والخصيتين الماوس. نضوب بعض مكونات BBSome، بما في ذلك BBS1، يؤثر تكون الأهداب في الخلايا RPE عن طريق التداخل مع الاتجار الغشاء إلى هدب (16). من أجل فهم أفضل وظيفة BBS1 والآثار الجزيئية للطفرة M390R، وضعنا نموذجا knockin الماوس Bbs1 M390R / M390R. الفئران الميزات الواضحة الكاردينال من النمط الظاهري الإنسان، بما في ذلك تنكس الشبكية، العقم عند الذكور، والسمنة، والعجز الشم، كما ذكرت لBbs2، Bbs4، وBbs6 نماذج الماوس خروج المغلوب (+18 - +22). هنا، ونحن التقرير BBS نموذج الفأر النمط الظاهري لم يسبق توصيفها تشريحي عصبي، التي تنطوي على ventriculomegaly البطينين الثالث والجانبي، رقيق من القشرة الدماغية، والحد من حجم المخطط الإحضار والحصين. بالإضافة إلى ذلك، لوحظ تشوهات شكلية في أهداب الخلايا المبطنة بطانية عصبية البطين الثالث الموسع للدماغ متحولة Bbs1. هذه النتائج تعد تصديقا فعالية Bbs1 M390R نموذج الفأر knockin لمزيد من التوضيح من BBS الفيزيولوجيا المرضية.

القسم السابق القسم التالي

النتائج

جيل من Bbs1 M390R / M390R Knockin الفئران.

نحن استهداف الجين Bbs1 في الفئران عن طريق بناء ناقلات تحتوي على مناطق الماوس Bbs1 الجين الذي حل محل كودون ميثيونين العادية في موقف 390 في اكسون 12 مع كودون أرجينين على إعادة التركيب مثلي (الشكل 1 A). أكد RT-PCR من [كدنا] تضخيم من الفئران knockin التي كانت تقسم أليل M390R بشكل صحيح دون إدراج النيوميسين كاسيت intronic. وأكد تسلسل Bbs1 M390R / M390R [كدنا أن هذا الجين Bbs1 تم تعديل مع إدماج ميثيونين متماثل إلى أرجينين (ATG لAGG) تغيير في خط knockin (الشكل 1 B). مستويات التعبير Bbs1 مرنا في أدمغة فئران knockin كان مماثلة لتلك التي البرية من نوع الفئران وفقا لتقييم الشمالية النشاف (الشكل 1 C). أدى التزاوج من Bbs1 + / M390R الفئران متخالف في 25.8٪ من متماثل ذرية لM390R أليل knockin (بيرسون χ 2 صلاح صالح = 0.72). هذا هو على النقيض من وتيرة الاكتئاب من المسوخ فارغة متماثل للسلالات Bbs2، Bbs4، أو Bbs6 التي تم إنشاؤها بواسطة مختبرنا (18، 19، 21). هذا يدل على أن الطفرة Bbs1 M390R لا يؤدي إلى الفتك الجنينية أو حديثي الولادة.

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 1.

Bbs1 M390R / M390R استهداف الجين knockin. يتم استبدال Bbs1 اكسون 12 (الرمز مع النجمة) مع اكسون التي تحتوي على M390R بديل على إعادة التركيب مثلي. السهام تشير الاشعال تستخدم ل5 'و 3' اختبار إعادة التركيب مثلي (A). تسلسل Bbs1 كدنا] من Bbs1 الحيوانات متحولة كامل يؤكد أن M390R متماثل (ATG لAGG) طفرة مغلطة ومعاد homologously مع سلامة (النجمة) (B). تحليل لطخة الشمالي من Bbs1 التعبير في 20 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع الخلوي من النوع البري (WT) والعقول متحولة باستخدام Bbs1 جزئي 5 "التحقيق كدنا] (العلوي) وβ الأكتين كعنصر تحكم التحميل (السفلى) (C).

الفئران Bbs1 M390R Knockin الإفتقار الحيوانات المنوية سياط ولا تتطور Polydactyly أو الكلى الخراجات.

على الرغم من polydactyly والكيسات الكلوية هي السمات الأساسية للالنمط الظاهري BBS البشري، ونحن لم نلاحظ forelimb أو hindlimb تشوهات أو الكيسات الكلوية في فئرانا معدلة وراثيا تحليلها في ثلاث نسخ (لا تظهر البيانات). وقد لوحظ عدم وجود polydactyly في جميع سلالات دينا الماوس BBS، على الرغم من الكيسات الكلوية لوحظت في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران أيضا عرضت Bbs1 فئرانا معدلة وراثيا عدم وجود هيمنة الاجتماعية (P <0.001)، جزئية. الشم (P = 0.0003)، وعدم وجود سياط الحيوانات المنوية (الشكل 2 ألف وباء).

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 2.

الحيوانات المنوية فقدان سياط والعيوب مبصرة. الهيماتوكسيلين / eosin- (H & E) -stained عمره 6 أشهر من النوع البري (A) ومتحولة تظهر (B) الأنابيب المنوية عدم وجود الحيوانات المنوية سياط. (شريط مقياس، 50 ميكرون.) H & E الملون لمدة 6 أشهر من العمر البرية من نوع (C) ومتحولة (D) شبكية العين تظهر فقدان طبقة النووية الخارجي في Bbs1 knockin (KI) شبكية العين وانحطاط مبصرة الداخلي وشرائح الخارجي . (شريط مقياس، 50 ميكرون) تحليل TEM من شبكية العين متحولة العمر 5 اشهر (E) يدل على التشكل تعطلت والارتباك من مبصرة OS أقراص غشائي. أهداب ربط واضحة في أقسام السهمي (السهم). (شريط مقياس، 500 نانومتر). وقد لوحظت أهداب توصيل أون مواجهة بين أبرز وOS (F). (شريط مقياس، 200 نانومتر.) قياس الممثل أرج لمن النوع البري وفئرانا معدلة وراثيا في الإنارة 26.7 مؤتمر نزع السلاح · ق · م -2 عرض تخفيض أ ب الموجة سعة في الحيوان متحولة (G). قياسات أرج تمثيلية من الردود على فوتوبيك المحفزات في البرية من نوع وفئرانا معدلة وراثيا. تم الكشف لا يوجد فرق كبير بين الأنماط الجينية اثنين (H). CH، المشيمية. RPE، في شبكية العين الظهارة الصبغية. OS، شرائح الخارجي؛ هي قطاعات الداخلية، ONL، طبقة النووية الخارجي؛ INL، طبقة النووية الداخلية. GCL، طبقة الخلايا العقدية. PC، خلايا مستقبلة للضوء.

الفئران Bbs1 M390R Knockin الخضوع مبصرة انحطاط.

في 6 أشهر من العمر، لوحظ انحطاط كبير من القطاعات الداخلية والخارجية من خلايا مستقبلة للضوء وطبقة النووية الخارجي في Bbs1 فئرانا معدلة وراثيا (الشكل 2 C و D). وmislocalized رودوبسين في طبقة النووية الخارجي (لا تظهر البيانات)، وتعطلت بشدة التشكل والارتباك من الجزء الخارجي أقراص غشائي شوهدت في شبكية العين متحولة (الشكل 2 E). وقد لوحظت خلايا مستقبلة للضوء ربط أهداب أحيانا أون مواجهة بين قطاعات الداخلية-الميتوكوندريا الغني والجزء الخارجي أقراص غشائي غير طبيعية (الشكل 2 F). العادي 9 + 0 ترتيب الأنابيب الدقيقة axonemal يبدو سليما في خلايا مستقبلة للضوء Bbs1 M390R ربط أهداب.
Electroretinograms (ERGs) من المسوخ Bbs1 من العمر 11 أسابيع لم تكن تختلف كثيرا عن العمر كعينة ضابطة ردا عتبة السعة أو ظلامية بأقل الرؤية الليلية الإنارة [المعلومات الداعمة (SI) الشكل. 6 A]. في أعلى الإنارة ظلامية، كان هناك تخفيف كبير في أ (P <0.001) وب موجات (P = 0.0021) (الشكل 2 G وSI الشكل 6 B). كان لا يزال متدرج للب الموجة فيما يتعلق الإنارة، مما يشير إلى انخفاض في أي عدد أو كفاءة المستقبلات الضوئية قضيب. كان ضيائية V أقصى انخفاض (الشكل 2 H) ولكن ليس بشكل كبير جدا في الحيوانات متحولة. كان هناك اختلاف كبير (P = 0.0038) في التباين من ضيائية ب الموجة في المسوخ، مما يدل على تأثير طفرة M390R على الطريق مخروط، على الرغم من أن موقع هذا التأثير لا يزال غامضا. وepithelium- الشبكية الصبغية (RPE) التي تم إنشاؤها تم تخفيض ج-سعة الموجة إلى حد كبير (P = 0.046) ولكن كان في المسوخ متدرج الإنارة، مما يشير إلى هذه النتائج من خلل مستقبلة للضوء بدلا من خلل وظيفي في RPE نفسها. مجموع هذه الملاحظات أرج يشير إلى طفرة Bbs1 M390R تؤثر في الغالب على عدد و / أو وظيفة الخلايا قضيب مبصرة.

السمنة والقلب والأوعية الدموية النمط الظاهري.

بالإضافة إلى الميزات الأساسية BBS الإنسان العقم عند الذكور، والعجز الشم، وتنكس الشبكية، كما أصبحت Bbs1 فئرانا معدلة وراثيا يعانون من السمنة المفرطة. أدت الطفرة M390R في زيادة وزن الجسم (الشكل 3 A). وكشف التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) من الحيوانات القديمة 6 أشهر 3.5- إلى أن محتوى الدهون الكلي للفئرانا معدلة وراثيا ومرتفعة بشكل ملحوظ مقارنة مع الضوابط (الشكل 3 B و C). وقد تم قياس وزن مستودعات الدهون في الأنسجة تشريح الفردية. زيادات كبيرة في محتوى الدهون من الأنسجة الدهنية البنية، والدهون الإنجاب، والدهون محيط بالكلية، والدهون ثربية التحقق من صحة البيانات MRI (SI الشكل 7). ارتبط زيادة كتلة الدهون في المسوخ Bbs1 مع مستويات عالية من المصل المشتقة من خلية شحمية هرمون ليبتين (الشكل 3 F). وعلاوة على ذلك، قد المسوخ Bbs1 زادت كمية الغذاء (الشكل 3 D) وانخفض النشاط الحركي (الشكل 3 E). التغيير في كل من هذه المعايير يمثل النمط الظاهري السمنة التي لوحظت في هذه الحيوانات. لأن الفئران knockin Bbs1 المستخدمة في القياس عن بعد لم ضعاف البصر، وفقدان الرؤية ليست هي السبب في انخفاض النشاط الحركي (SI الشكل 8). بدلا من ذلك، فإنه يمكن أن يكون نتيجة لنقص هرمون الليبتين الإشارات، وذلك لأن هرمون الليبتين يزيد النشاط الحركي (23)، وBbs1 الفئران knockin هم hyperleptinemic، مما يشير إلى مقاومة اللبتين. هناك حاجة للمزيد من التجارب لإثبات السبب الرئيسي لانخفاض النشاط الحركي.

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 3.

السمنة النمط الظاهري. زيادة الوزن في الحيوانات الذكور والإناث مقابل العمر (بحد أدنى 11 حيوانات في كل مجموعة). يتم التعبير عن القيم كما يعني ± SEM. وبحلول الأسبوع 12، كانت الفئران الطافرة متماثل أثقل بكثير من النوع البري أو الفئران متخالف (A). يوضح ممثل المرجحة T1 MRI الإكليلي زيادة في كتلة الدهون في الفئران الطافرة من العمر 6 أشهر 3.5- إلى مقابل البرية من نوع الضوابط. الدهون تظهر بيضاء، في حين العضلات والمياه تظهر الرمادي أو الأسود (B). إجمالي الدهون (في وحدات التعسفي، AU) كميا عن طريق تحليل يماغيج البيانات MRI البرية من نوع (ن = 6) مقابل متحولة (ن = 6) الحيوانات (C). متوسط ​​استهلاك الأغذية (الحيوانات الذكور والإناث جنبا إلى جنب مع ما لا يقل عن 11 حيوانات في كل مجموعة، وبلغ متوسط) (D). النشاط أربع وعشرين ساعة من البرية من نوع (ن = 6) مقابل متحولة (ن = 5) الفئران التي تقاس القياس عن بعد (E). فئرانا معدلة وراثيا يحمل أقل بكثير النشاط الحركي من النوع البري الضوابط. ورفع مستويات هرمون الليبتين في مصل الدم بشكل ملحوظ في فئرانا معدلة وراثيا (F). *، P ≤ 0.05 مقابل البرية من نوع الحيوانات.

وأخيرا، لاختبار ما إذا كانت فئرانا معدلة وراثيا لديها عيوب في القلب وارتفاع ضغط الدم شائع في BBS المرضى، ضربات القلب والدورة الدموية وظائف قيست في 3.5- إلى متحولة والسيطرة فئران عمرها 6 أشهر. زيارتها Bbs1 فئرانا معدلة وراثيا ارتفاع معدل ضربات القلب مقارنة مع ضوابط (SI الجدول 1). في المقابل، لم يلاحظ أي تغييرات كبيرة في الضغط الشرياني يعني أو حجم القلب وظيفة.

العيوب تشريحي عصبي.

Bbs1 أدمغة فئران معدلة وراثيا معارضها يقتصر ventriculomegaly إلى البطينين الدماغي الجانبي والثالث. كان تضخم البطين الجانبي الأكثر حدة، في حين أن زيادة حجم البطين الثالث كان أقل وضوحا. توسيع معتدلة البطينات الجانبية وشوهدت مخفضة جسم المخطط في وقت مبكر من الأسبوع ما بعد الولادة 3 (SI الشكل 9). علم الأمراض على ما يبدو تقدمية على أساس أكبر توسعة للالبطينات الجانبية والثالث من الحيوانات متحولة القديمة 6 أشهر 3.5- لوفقا لتقييم الاكليلية MRI (الشكل 4 A). وتم قياس كمية أحجام البطين باستخدام برنامج يماغيج (الشكل 4 B)، وكذلك التحقق من صحة في أقسام الدماغ الاكليلية counterstained مأخوذة من نفس الفئران (الشكل 4 C). بالإضافة إلى ventriculomegaly، كما لاحظنا ترقق النصف الذيلية من قشرة الدماغ وانخفاض في حجم المخطط الإحضار والحصين (الشكل 4 C). وقد لوحظت هذه العيوب تشريحي عصبي أيضا في Bbs2 - / -، Bbs4 - / -، وBbs6 - / - الفئران من مختلف الأعمار مقارنة (SI الشكل 10.). وأظهر التصوير بالرنين المغناطيسي سهمي جميع سلالات الفئران الطافرة أربعة BBS أي توسيع الإجمالي من البطين الرابع (لا تظهر البيانات). وبالإضافة إلى ذلك، لم يلاحظ أي شذوذ المورفولوجية الجسيمة في الجمجمة أو المخيخ في أي من سلالات الفئران الطافرة BBS (لا تظهر البيانات).

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 4.

عيوب تشريحي عصبي. ممثل المرجحة T1 المحوري (A العليا) والإكليل (A السفلى) MRI مما يدل على جانبي الموسع (النجمة) والثالث (رأس السهم) البطينين في 3- لمتحولة مقابل الضوابط من النوع البري القديمة 6.5 أشهر. (B) الكمي لكميات البطين من بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي باستخدام برنامج يماغيج. (C) توضح أقسام الدماغ المحايدة الحمراء الملطخة 100 ميكرون سميكة الاكليلية من الفئران المستخدمة في الدراسة MRI البطينات الجانبية والثالث الموسع، رقيق من القشرة المخية (CC)، وانخفاض الحصين (H)، والجسم المخطط (S) . (أشرطة مقياس، 1 ملم.) *، P ≤ 0.05 مقابل البرية من نوع الحيوانات.

إلى فهم أفضل لعلم الأمراض الكامنة وراء البطينين الموسع في Bbs1 فئرانا معدلة وراثيا، وكنا انتقال المجهر الإلكتروني (TEM) لدراسة أهداب الخلية بطانية عصبية التي تبطن البطين الثالث. خلايا البطانة العصبية خط كل من البطينين الدماغي ولها العديد من أهداب متحركة، تتألف من 9 + 2 الحلل من الأنابيب الدقيقة axonemal، التي يعتقد أنها تلعب دورا في السائل النخاعي (CSF) الدورة الدموية من خلال الدماغ (24). لاحظنا نوعين من أهداب الخلية بطانية عصبية العيوب الشكلية في أدمغة متحولة. 20٪ من أهداب كانت حوالي طويلة بشكل غير طبيعي، وكان 80٪ المناطق البعيدة تورم التي تحتوي على المجاميع حويصلي (الشكل 5). وأظهرت مقاطع عرضية من متحولة أهداب الخلايا البطانة العصبية أي شذوذ في الترتيب 9 + 2 axonemal من الأنابيب الدقيقة.

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 5.

البطانة العصبية تشوهات أهداب الخلية. الميكروسكوب الإلكتروني لأهداب الخلية بطانية عصبية تبطن الجزء البطني من البطين الثالث (المتاخمة للنواة المقوسة من منطقة ما تحت المهاد) في البرية من نوع الفئران (A و B) وBbs1 فئرانا معدلة وراثيا (C-F) تثبت إطالة غير طبيعية من أهداب في Bbs1 الحيوانات متحولة (C و D) وتوسيع المنطقة البعيدة من أهداب (E و F). وتشير السهام صلبة لأهداب سليمة في فئرانا معدلة وراثيا (C-F). وتشير السهام المفتوح الرأس إلى أقسام عرضية من أهداب غير طبيعي (C و D). يظهر العادي 9 + 2 ترتيب axonemal من الأنابيب الدقيقة في أقسام أهداب عرضية من النوع البري وBbs1 M390R الفئران knockin في أعلى التكبير (إدراجات من B و D). [الحانات مقياس، 1 ميكرون (A-F).] BB، الجسم القاعدية. 3V، البطين الثالث.

القسم السابق القسم التالي

نقاش

في هذه الدراسة، نقدم تقييم المظهري من نموذج حيواني من الطفرة BBS الأكثر شيوعا، BBS1 M390R. هذه الفئران تبدي ضمور شبكية العين، عدم وجود الحيوانات المنوية في الذكور سياط، انخفض الشم، وعدم وجود هيمنة الاجتماعية. وهم يعانون من السمنة المفرطة، نهم، وhyperleptinemic وتظهر انخفض النشاط الحركي. هذه الظواهر هي نموذجية لجميع نماذج الماوس BBS درس في التاريخ (+18 - +22). على الرغم من أن قضيتهم الأساسية لا تزال غير مفهومة تماما، والظواهر تتسق مع فكرة أن البروتينات BBS مطلوبة من أجل السليم القاعدية الجسم / أهداب / توليف سياط و / أو وظيفة (15، 16). بين الأنسجة المتضررة، وقد ارتبطت أهداب المعيبة مع العجز الشم (20)، ولقد لوحظ بشكل غير طبيعي أهداب طويلة في Bbs4 - / - خلايا الكلى ويمكن أن تلعب دورا في التنمية الكيس الكلى في هذه الفئران (25). يبدو فقدان وظيفية البروتينات Bbs1، Bbs2، Bbs4، أو Bbs6 أيضا أن يؤدي إلى خلية مستقبلة للضوء ربط أهداب / ضعف النقل داخل الخلايا تبدأ في المراحل الأولى من تطوير شبكية العين (26). تنعكس الآثار الوظيفية لهذه الحالات الشاذة في القياسات أرج الشاذة وصفها في الدراسة الحالية ودعم مراقبة الخلل البصري في المرضى الذين يعانون BBS إيواء طفرة M390R (27).
يحتوي الدماغ أيضا العديد من الخلايا المهدبة. أهداب الخلايا العصبية هي امتحركة ويعتقد أنها تعمل في chemosensation وmechanosensation (28). خلايا البطانة العصبية تبطن البطينات الدماغية تمتلك العديد من أهداب متحركة وتسهيل تداول CSF من خلال البطينين (24، 29). في هذه الدراسة، لاحظنا BBS نموذج الفأر النمط الظاهري الذي قد يكون نتيجة لالشاذة بطانية عصبية التشكل أهداب الخلية و / أو وظيفة. وأدت خسارة Bbs1 ظيفية، Bbs2، Bbs4، أو Bbs6 في توسيع حاد في البطينات الجانبية، وإلى درجة أقل، وتضخم البطين الثالث، رقيق من القشرة الدماغية في المنطقة الذيلية من الدماغ، والحد من حجم الحصين والجسم المخطط. أحد التفسيرات لهذا النمط الظاهري هو أن ضمور المخ أو تطوير غير مكتملة النتائج أنسجة المخ في التعويضي توسيع السابقين الخلاء من البطينين. وثمة بديل أكثر ترجيحا هو أن ضغط من القشرة الدماغية، الحصين، ويمكن أن يكون الجسم المخطط لها تأثير ثانوي من البطينين الموسع. أظهر الفحص الدقيق لأهداب الخلية بطانية عصبية تبطن البطين الثالث الموسع في Bbs1 M390R الفئران knockin كل من أهداب ممدود وأهداب مع المناطق البعيدة تورم، مما يشير إلى هذه التشوهات تكمن وراء النمط الظاهري الدماغ.
وقد أظهرت الدراسات التي أجريت على عدد من نماذج الماوس خروج المغلوب أن العيوب الهدبية في خلايا البطانة العصبية يمكن أن يؤدي إلى استسقاء الرأس، وهي حالة تتميز تدفق ضعف CSF، CSF الإنتاج الزائد، و / أو عدم كفاية امتصاص CSF (30). في الحالات الشديدة، وهذا يمكن أن يؤدي إلى ضغط من القشرة المخية والمخيخ والرأس على شكل قبة الموسع. في الفئران، وقد ارتبط تطور استسقاء الرأس مع عيوب في البروتينات المرتبطة مصفوفة الغشاء الهدبي (نابا / hydin)، الهدبية المرتبطة الخيط المحوري البروتينات (hydin / Spag6، Mdnah5)، وintraflagellar (IFT) الأجهزة (بولاريس)، و الجينات الأخرى اللازمة لتكون الأهداب، مثل Rfx3 عامل النسخ (30، 31). ومزيد من التحليل للBBS فئرانا معدلة وراثيا تساعد على تحديد الأحداث الأولية التي تؤدي إلى تطوير استسقاء مثل معوقات تدفق السائل النخاعي، وتغير في الضغط داخل الجمجمة، وجود الدماغي القناة تضيق. وثائق من العيوب neuroantomical في المرضى الذين يعانون BBS بواسطة تصوير الدماغ محدودة. ذكرت دراسة حديثة من ثلاثة مرضى مع ميزات BBS تشبه دليل على ضمور الدماغ القشرية، وضمور المخيخ، الأفقي توسيع البطين، الصدغي الجداري وتضخم الفص، وصغر الرأس (32). ومع ذلك، كان دليلا الجيني للطفرات BBS محدود أو غير متوفر. وهناك ارتباط شامل لBBS الوراثي المريض والنمط الظاهري تشريحي عصبي تكون ضرورية لمواصلة استكشاف العلاقة بين النتائج تشريحي عصبي الإنسان والفأر نموذج لدينا.
مؤخرا، تم العثور على BBS1 ليكون عنصرا من عناصر مجمع بروتين يسمى BBSome (16). الزميلة BBS1 مع رابين 8، وهو عامل الصرف guanosyl للراب 8، والمعروف عن الاتجار حويصلي. استنزاف BBS1 في الخلايا RPE مثقف تتأثر تكون الأهداب عن طريق التداخل مع الاتجار الغشاء. في الدراسة الحالية، تم العثور على ترتيبات سليمة من الأنابيب الدقيقة axonemal في نوعين مختلفين من أهداب، متحركة وامتحرك، في اثنين من أنواع مختلفة من الخلايا في Bbs1 M390R الفئران knockin. وبناء على هذه النتائج، Bbs1 قد لا تكون هناك حاجة لالعادي بشكل صارخ هيكل axonemal أنيبيب. بدلا من ذلك، الطفرة M390R قد يؤثر سلبا على الانتهاء من التجمع أهداب و / أو وظيفة. وهذا يتفق مع موقع M390R تحور في بروتين عزر مثل WD40 أن ثبت أن تشارك في الاتجار حويصلي، بين الوظائف الخلوية الأخرى (17).
في الختام، أثبتت نماذج الماوس BBS أن تكون أدوات قيمة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لBBS. العديد من الظواهر دراستها حتى الآن يبدو أن ذات الصلة أهداب. في هذه الدراسة، فإننا نقدم دليلا على وجود النمط الظاهري تشريحي عصبي غير موصوف سابقا (ventriculomegaly) الذي يظهر أن سببها خلل أهداب الخلية بطانية عصبية. واصلت استخدام نماذج الماوس BBS في الدراسات الفنية إضافة إلى فهمنا للcilia- والجوانب المتعلقة noncilia من الفوضى.

القسم السابق القسم التالي

طرق

جيل من Bbs1 M390R / M390R Knockin الفئران.

تم استخدام PCR لتضخيم 5 'و 3' مناطق الجين Bbs1 من 129 / SVJ الحمض النووي الجيني التي تم استنساخها في استهداف pOSDUPDEL ناقلات (التي تقدمها O. سميثيز، جامعة نورث كارولاينا في تشابل هيل). تم electroporated ناقلات خطي إلى R1 الجذعية الجنينية (ES) خلايا (129 × 1 / SvJ3 129S1 / سيفرت). تم فحص الحيوانات المستنسخة مقاومة للG418 بواسطة PCR لتحديد Bbs1 -targeted خطوط الخلايا ES. واستخدمت اثنين من خطوط الخلايا ES لإنتاج الوهم. تم التنميط الجيني لالفئران عن طريق PCR باستخدام بادئات أن كلا يحيط وكانت الداخلية للمنطقة المستهدفة من هذا الجين. جميع الدراسات انضمت إلى المبادئ التوجيهية الموضوعة لرعاية واستخدام حيوانات التجارب وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان من جامعة ولاية ايوا.

عزل الحمض النووي الريبي وشمال تحليل وصمة عار.

تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من Bbs1 العقول التحكم الماوس متحولة ويقابل الشيخوخة 3 أشهر، electrophoresed، نشف، والمهجنة كما هو موضح (33). وكان المسبار 400-BP Bbs1 كدنا] من الإكسونات 2 إلى 6. تم تجريده من لطخة من النشاط الإشعاعي وreprobed مع β الأكتين كعنصر تحكم التحميل.

اختبار الهيمنة الاجتماعي، اختبار شمي، قياس ضغط الدم، معدل ضربات القلب، وآخر.

أجريت هذه الاختبارات كما هو موضح (18، 19، 21).

تحليل النسيجي من الفئران Bbs1 M390R Knockin.

وقد أجريت الهيماتوكسيلين / يوزين تلطيخ العين والخصيتين من Bbs1 متحولة والعمر المتطابقة الضوابط عمرها 6 أشهر كما هو موضح (18). تم التقاط الصور باستخدام أوليمبوس BX-41 المجهر مع الكاميرا الرقمية SPOT-RT.
(ن = 3) والحيوانات التحكم (ن = 3) وأجريت دراسات مورفولوجية الدماغ من Bbs1 الحيوانات متحولة القديمة 6 أشهر 3.5- إلى خارج كما هو موضح (34). كانت ملطخة الستين إلى 100 ميكرون مسلسل أقسام الاكليلية مع محايد الأحمر وتصويرها مع stereomicroscope أوليمبوس SZX12.
TEM.

الميكروسكوب الالكتروني من Bbs1 العقول متحولة القديمة 8 أشهر 7- ل(ن = 3) والعقول التحكم الماوس العمر المتطابقة (ن = 3) تم الحصول عليها كما هو موضح في المرجع. 33. وقد تم الحصول على الميكروسكوب الإلكتروني لا يقل عن ثلاثة المسوخ Bbs1 وشبكية العين السيطرة العمر المتطابقة من مختلف الأعمار كما هو موضح في المرجع. 26.

تخطيط كهربية الشبكية.

أجري تخطيط كهربية الشبكية على Bbs1 M390R الفئران knockin من العمر 11 أسابيع (ن = 6) والعمر كعينة ضابطة (ن = 5) كما هو موضح في SI النص.

الوزن، والشحوم، واستهلاك الأغذية التحليلات.

ومقارنة الاستهلاك الغذائي من قفص فردي Bbs1 الحيوانات متحولة مع متغايرة والبرية من نوع الضوابط 8-18 أسابيع من العمر باستخدام متوسط ​​11 حيوانات في كل مجموعة. تم تسجيل الوزن بداية الأسبوعية عند الفطام. لتحديد أنسجة الدهون الفردية للفئرانا معدلة وراثيا (ن = 6)، والبرية من نوع الفئران (ن = 6)، تم تشريح مستودعات الدهون المختلفة في وفاة وزنه.

اللبتين الفحص.

وقد تم تحليل تعميم مستويات اللبتين في الدم التي تم جمعها من الكبار Bbs1 فئرانا معدلة وراثيا الفئران (ن = 9) والسيطرة (ن = 9). تم الحصول على البلازما بواسطة الطرد المركزي الدم في 2040 × ز لمدة 8 دقائق. وقد تم قياس تركيز هرمون الليبتين الفئران وكالة ريا باستخدام طقم المتاحة تجاريا (كريستال علم).

التصوير بالرنين المغناطيسي والكمي لفات والدماغ البطينين.

التصوير من الدهون في الجسم والدماغ من Bbs1 M390R من العمر 6 أشهر 3.5- إلى knockin الفئران الفئران (ن = 3) والسيطرة (ن = 3) من خلال التصوير بالرنين المغناطيسي أجري كما هو موضح في SI النص. وقد تم قياس حجم البطينات الدماغية باستخدام يماغيج البرمجيات (المعاهد الوطنية للصحة).

تخطيط صدى القلب.

تم إجراء تخطيط صدى القلب ثنائي الأبعاد على التحكم القديمة 6 أشهر 3- لوBbs1 M390R الفئران knockin (5-10 الفئران في كل مجموعة)، كما هو موضح في نص SI (35، 36).

 

[رافت ابراهيم]

 

http://www.pnas.org/content/106/6/1820.full

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هي ciliopathy الموروثة المرتبطة عادة مع السمنة المفرطة، ولكن لا تزال الآلية الكامنة وراء افتراضية ويقترح عموما أن يكون الهرموني العصبي المنشأ. في هذه الدراسة، وتبين لنا أنه في حين nonciliated وpreadipocytes انتشارها أو الخلايا الشحمية ناضجة في الثقافة، وهو هدب الأساسي النموذجي هو موجود في التفريق preadipocytes. هذا هدب عابر يحمل مستقبلات WNT والقنفذ الممرات، وربط هذه العضية لمسارات التنظيمية التي سبق وصفها لتكون الشحم. وتبين لنا أيضا أن BBS10 وBBS12 البروتينات الموجودة داخل الجسم القاعدية من هذا هدب الابتدائي وتثبيط التعبير عنها يعوق تكون الأهداب، ينشط الجليكوجين سينسيز كيناز 3 المسار، ويدفع بيروكسية تنشيط مستقبلات ناشر تراكم النووي، وبالتالي تفضيل تكون الشحم. وعلاوة على ذلك، الخلايا الشحمية المستمدة من الخلايا الليفية الجلدية BBS-المرضى في الثقافة المعرض الميل العالي لتراكم الدهون بالمقارنة مع الضوابط. هذا يوحي بقوة بأن الخلل الأساسي الطرفية من تكون الشحم يشارك في التسبب في السمنة في BBS.

• تكون الشحم
• هدب الأساسي
• ciliopathy
• بدانة

أصول السمنة الإنسان معقدة ودراسة أعراض السمنة ورثت هي ذات أهمية كبيرة في تحديد مسارات معينة قد تكون متورطة أيضا في أشكال أكثر شيوعا. متلازمة بارديه-بيدل (BBS)، وهو اضطراب وراثي جسمي مقهور مع عدم التجانس nonallelic واسعة، يعرف أساسا من السمنة، والفشل الكلوي، تنكس الشبكية وضعف الإدراك، وpolydactyly (1 ⇓ - 3)، وارتبط وجود عيب في مستوى البيولوجيا هدب الأساسي. وهدب الأساسي هو عضية القائم على أنيبيب أن يبرز من سطح كل الخلايا البشرية تقريبا، بوصفها هوائي تشارك في خارج الخلية نقل الإشارة، تورط المسارات البيولوجية الكبرى مثل مجنح (WNT) والقنفذ (4، 5). وقد أبرزت أهميتها مؤخرا من قبل عدد متزايد من الاضطرابات الوراثية المتعلقة العيوب الهدبية (6، 7)، مما يدل على وظائف نسيجي واسعة النطاق لهذه العضية. BBS هو ciliopathy رمزية مع 12 الجينات التي تم تحديدها حتى الآن (BBS1-BBS12)، والتي BBS1، BBS10، وBBS12 وبشكل تراكمي تم العثور عليها تحور في أكثر من 50٪ من المرضى (1). السمنة هي سمة أساسية من هذا المرض، الذي لا يزال المرضية الهدبية إلى توضيح (8). فرضية وجود عيوب في مهدبة الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي (9 وقد تم اكتشاف) التي تنظم تخزين الدهون واكتسب الدعم الأخير من دراسات النماذج الحيوانية (10 ⇓ - 12). علاوة على ذلك، فقد وصفت خلية شحمية أن تكون خلية nonciliated (13) وليس المشار إليها في قائمة الخلايا المهدبة (http://www.bowserlab.org/primarycilia/cilialist.html)، آثار مباشرة من هذه الخلية في التسبب في السمنة BBS المصاحب تمت، حتى الآن، لم يتم التحقيق فيها.
وتستمد الخلايا الشحمية من خلايا السلائف الوسيطة التي، عندما تصبح ملتزمة preadipocyte النسب، إما أن تبقى نائمة أو الخضوع التمايز النهائي في الخلايا الشحمية ناضجة في عملية وصفت بأنها تكون الشحم (14). في هذا مفترق طرق، عدة مسارات تقلد بعضها البعض: لantiadipogenic WNT وسمو مسارات هي مثبطات قوية من تكون الشحم الذي الأنشطة تحتاج إلى قمع من قبل الخلايا يمكن الخضوع التمايز النهائي، في حين أن بيروكسية تنشيط ناشر مستقبلات γ (PPARγ) وCCAAT البروتينات -enhancer ملزم (ج / EBPα، -β) هي قوية العوامل المؤيدة للمكون الشحم (15 ⇓ - 17). في الواقع، فمن الواضح الآن أن PPARγ هو المنظم الرئيسي لتكون الشحم لأنها قادرة على تحفيز مستويات طبيعية من الدهون تمايز الخلايا في الخلايا التي تفتقر إلى C / EBPα، في حين C / EBPα ليس لديه القدرة على إحداث تكون الشحم في غياب PPARγ (18) . تحتفظ يشير WNT وpreadipocytes في حالة غير متمايزة، وتثبيطه كافية للتسبب عفوية تكون الشحم (19). سمو يشير أيضا يمنع خلية شحمية التمايز، ولكن على عكس القمع الكلي WNT، وقد وصفت سمو يشير إلى أن تخفض فقط خلال التمايز مكون الشحم مع المستويات التي يمكن اكتشافها موجودة في الخلايا الشحمية الناضجة (20، 21). هذا التنظيم إلى أسفل ليست كافية لتحريك التمايز خلية شحمية، الأمر الذي يجعل WNT يشير إلى مسار تنظيمي أكثر قوة من تكون الشحم مقارنة سمو الإشارات.
الجليكوجين سينسيز كيناز 3 (GSK3) هي أيضا المنظم الرئيسي لتكون الشحم (22)، وقمع من قبل WNT (19، 23). في الواقع، عندما مسار WNT نشطا، هو المعطل GSK3 من خلال الفسفرة وغير قادر على إضافة الفوسفات بيتا catenin. وهذا يؤدي إلى النبات النووي β-catenin، الذي يقمع التمايز. في المقابل، في حالة عدم وجود إشارات Wnt، شكل unphosphorylated من GSK3 يزداد، التي phosphorylates بيتا catenin استهدافها لتدهور بروتين (24). ويرتبط هذا الانخفاض في النووي β-catenin مع تراكم النووي PPARγ. على الرغم من أنها راسخة بأن WNT وسمو مسارات يلعبون الأدوار التنظيمية الرئيسية في تكون الشحم، و، على حد علمنا، لم تحدد توطين الخلوية الدقيق للمستقبلات يناظرها في preadipocytes.
اقتربنا من التسبب في السمنة في BBS من خلال التحقيق في دور المتعلقة أهداب البروتينات BBS في علم الأحياء خلية شحمية. في الواقع، وقد ذكرت والتنظيم يصل العديد من الجينات BBS خلال المرحلة المبكرة من التمايز مكون الشحم في الثقافة مؤخرا (25). في هذه الدراسة ركزنا على 2-مثل chaperonine البروتينات BBS التي حددناها في الآونة الأخيرة: BBS10 (26) وBBS12 (27). هذا أدى بنا إلى اكتشاف تشكيل عابرة من هدب الأساسي الذي يحمل WNT وسمو المستقبلات، خلال preadipocyte التمايز. تثبيط BBS10 وBBS12 التعبير يضعف هذا تكون الأهداب وينشط مسارات proadipogenic تورط GSK3 وPPARγ. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام الخلايا الشحمية المستمدة من الخلايا الليفية الجلدية BBS-المرضى، كنا قادرين على إظهار زيادة تراكم الدهون في الخلايا الشحمية ومستويات اللبتين أعلى يفرز مقارنة للسيطرة على الخلايا الليفية.

القسم السابق القسم التالي

النتائج

التعريب الخلوي للBBS10 وBBS12 البروتينات.

كما لم تتسم BBS10 وBBS12 البروتينات حتى الآن، أثيرت أرنب الأجسام المضادة التي تكشف في البقع الغربية العصابات واحدة من الحجم المتوقع (لا تظهر البيانات). كنا لهم لدراسة توطين الخلايا من البروتينات الذاتية 2. الكلى الخلايا الظهارية أنبوبي تمثل نموذجا محددة جيدا ومعترف بها لخلايا مهدبة (28، 29)، وعلاوة على ذلك، خلل في الكلى هو ميزة أساسية أخرى في المرضى الذين يعانون BBS (30، 31). اختبرنا توطين BBS10 وBBS12 في الخلايا البشرية الأولية الكلى الداني أنبوبي الظهارية (hRPTEC). عندما كانت تزرع هذه الخلايا لالتقاء، وimmunolabeled هدب بهم بسهولة باستخدام مكافحة الأسيتيل α تويولين، مع الجسم القاعدية رؤيتها بوضوح في قاعدة هدب (الشكل 1 A). أظهر مناعي من BBS10 وBBS12 البروتينات أن كلا من البروتينات المترجمة إلى الجسم القاعدية من هدب الأساسي. وهكذا، يبدو أن هذه البروتينات للمشاركة في نفس الترجمة كما ذكرت لBBS6 (32) الذي ينتمي إلى نفس العائلة الفقاريات معينة من البروتينات مثل chaperonin (27). هذا التعريب وبالتالي أكثر تقييدا ​​من تعريب من البروتينات BBS أخرى تابعة لمجمع BBSome، والتي توجد أيضا في هدب (33، 34). في الخلايا الشحمية ناضجة المستمدة من preadipocyte الإنسان الأبيض (HWP) [SI النص والشكل. S1]، وتركزت BBS10 وBBS12 البروتينات في 2 نقطة محورية colocalizing مع centrioles المسمى γ تويولين، كما هو مبين في الصور المدمجة (الشكل 1 B).

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 1.

توطين BBS10 وBBS12 البروتينات في الخلايا الظهارية الكلى والخلايا الشحمية ناضجة. (A) مهدبة hRPTEC الملون لهدب (الأسيتيل α تويولين، α-حوض) وBBS10 أو BBS12. هدب الابتدائي والجسم القاعدية (يسار). تم الكشف عن BBS10 وBBS12 البروتينات المجاور للنواة (الأوسط) والمترجمة في الجسم القاعدية (الحق، اندمجت الصور). (B) ناضجة الخلايا الشحمية الملون لcentrioles مع γ تويولين (γ-حوض) وإما BBS10 أو BBS12. BBS10 وBBS12 هي بروتينات مريكزي. (أشرطة النطاق، 5 ميكرون).

مهدب التفريق Preadipocytes.

لتحليل التعبير عن BBS10 وBBS12 البروتينات أثناء تكون الشحم، ونحن مثقف وHWP لالتقاء كامل (D0) في النمو preadipocyte المتوسطة، ثم تحولت إلى preadipocyte التمايز المتوسطة على مدى 3 أيام، يعقبه تغيير النهائية لمتوسطة خلية شحمية التغذية، مما يؤدي إلى أن تنضج الدهون تراكم الخلايا الشحمية. تم الكشف عن مستويات التعبير أقصاها BBS10 وBBS12 البروتينات في الأيام الأولى 2 التمايز مكون الشحم، يليه انخفاض صافي اعتبارا من يوم 4 للوصول إلى انخفاض مستويات التعبير القاعدية (الشكل 2 A). وtransporter4 الجلوكوز، GLUT4، وكان يستخدم كمؤشر مكون الشحم، أعرب فقط في الخلايا الشحمية ناضجة، لإظهار أن التعبير BBS انخفض تدريجيا مع الإجراء من تكون الشحم. ويبدو أن هذا نمط التعبير وبالتالي مماثل إلى الوضع مرنا التعبير التي سبق وصفها للجينات BBS أخرى (25). تعبير أعلى من البروتينات الهدبية أثناء تكون الشحم دفعتنا لاختبار وجود هدب في 3 مراحل مختلفة: subconfluent يقسم preadipocyte، متموجة preadipocyte الموافق التعبير الأقصى من BBS10 وBBS12، وخلية شحمية ناضجة مليئة قطرات الدهون (الشكل 2 B ). ومن المثير للاهتمام، تم الكشف عن أي هدب في preadipocytes subconfluent وخلية شحمية ناضجة، لكنه كان حاضرا في preadipocyte-التفريق متموجة. تم فحص نفس 3 مراحل الخلوية بواسطة المجهر الإلكتروني، مؤكدا أن النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق وضع العلامات المناعي (الشكل 2 C). كشف المجهر انتقال الإلكترون بنية نموذجية التركيبية من هدب الرئيسي في preadipocyte التفريق مع centrioles 2، 1 في قاعدة هدب في الجسم القاعدية (الشكل 2 D)، وجود قطرات الدهون. في أعلى التكبير، والخيط المحوري ينظر المنبثقة عن مريكز في الجسم القاعدية، التي يمكن عدها إلى 9 + 2 الحلل على المقطع العرضي للهدب (SI النص والشكل S2 C).

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 2.

يصل تنظيم BBS10 وBBS12 البروتينات وجود عابر هدب الأساسي في تكون الشحم في وقت مبكر. (A) BBS10 ومستويات البروتين BBS12 أثناء تكون الشحم. كانت HWP مثقف لD0 في النمو preadipocyte المتوسطة. وكان المستحث التمايز، وكانت immunoblotted مقتطفات الخلوية في النقاط الزمنية المشار إليها. يتم التعبير عن BBS10 وBBS12 البروتينات الحد الأقصى في التمايز في وقت مبكر. الجلوكوز الناقل 4 (GLUT4، 45kDa) بمثابة علامة مكون الشحم وβ تويولين بمثابة تحكم التحميل. (B) (من اليسار إلى اليمين) المتكاثرة preadipocytes، متموجة التفريق preadipocytes، الخلايا الشحمية ناضجة الملون لهدب. لوحظ هدب الأساسي حصرا في التفريق preadipocyte. (أشرطة النطاق، 5 ميكرون.) (C) الممثل الإلكتروني الماسح الصور المجهرية من نفس 3 مراحل. هدب يمكن ملاحظته على preadipocyte التفريق (الشرق، السهم) وتغيب في preadipocyte وخلية شحمية ناضجة بشكل واضح. (أشرطة النطاق، 10 ميكرومتر.) (D) الكترون صور مجهرية تظهر هدب مع مريكز في قاعدة (السهم)، axonemes داخل هدب. أستريكس يشير إلى قطرات الدهون داخل الخلايا. وتظهر اللوحة اليمنى اثنين من centrioles (السهام). واحد مريكز المعينين في الجسم القاعدية لدعم axonemes. (شريط مقياس، 1 ميكرون).

توصيف هدب الابتدائية أثناء تكون الشحم.

BBS1، واحدة من الجينات 2 تحور في أغلب الأحيان في المرضى، رموز وحدة فرعية من بروتين معقد BBS وصف مؤخرا، وBBSome، ويموضع داخل هدب الابتدائي (33). نحن التحقيق سواء BBS1 والبروتينات مثل chaperonin 2 درس هنا تتقاسم هذه نفس توطين الخلوية في preadipocyte التفريق. نحن costained في خلية شحمية التفريق للهدب وBBS1، BBS10، أو BBS12. تم الكشف عن BBS1 على طول هدب خلية شحمية (الشكل 3 أ) فيما احتفظ BBS10 وBBS12 وحظ توطين الخلوي في الخلية الدهون unciliated، تبقى مرتبطة إلى مريكز في الجسم القاعدية من هدب الأساسي (الشكل 3 B و C). في الظهارة الكلى، وهدب الأساسي المرافئ مستقبلات لمسارات مثل WNT وسمو (35)، الذي يشير تعتمد على النقل intraflagellar الأصيل (36). لذا نحن اختبار إذا كان التفريق هدب الأساسي preadipocyte يمكن أن المتورطين في هذه الممرات. أجرينا مناعي مستقبلات WNT استخدام أجسام مضادة ضد حاتمة المشتركة بين Fzzl مستقبلات 1-10 (3 الشكل D). تم العثور معين Fzzl immunolabeling في توطين في هدب. بطريقة مماثلة، لاحظنا وجود على هدب من مملس (SMO)، ومستقبلات المشاركة في سمو الإشارات (الشكل 3 E) وكذلك Patched1 (لا تظهر البيانات)، مما يشير إلى الدور المحوري للإشارة المرتبطة هدب في برنامج مكون الشحم.

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 3.

خلية شحمية البروتينات هدب المصاحب. و immunostained التفريق HWP لهدب وBBS1، BBS10، BBS12، Fzzl1-10، وSMO. تظهر لوحات غادر هدب، تظهر لوحات المتوسطة توطين البروتين والألواح الصحيحة الصور المدمجة. تم الكشف عن (A) BBS1 في جميع أنحاء هدب. يتم ترجمة BBS10 وBBS12 في الجسم القاعدية (B) و (C)، على التوالي. ترتبط البروتين Fzzl (D) وSMO (E) أيضا إلى هدب. (أشرطة النطاق، 5 ميكرون).

BBS10 وBBS12 تؤثر تكون الأهداب ومكون الشحم مسارات.

للتحقيق في الآثار المترتبة على BBS10 وBBS12 البروتينات في خلية شحمية تكون الأهداب عابرة، ونحن ترسيتها التعبير عنها باستخدام الخلوي تسليم الشبح رني. وقد حققت خفضا قويا من BBS10 وBBS12 محتويات البروتين في متموجة preadipocytes D0 بعد العلاج مع الكلمات المشتركة رني (مختلفين رني للأعطى كل الجينات نتائج مماثلة) (الشكل 4 أ و ب). أدى تثبيط BBS10 وBBS12 التعبير في انخفاض كبير في عدد الخلايا المهدبة مقارنة للسيطرة على الخلايا رني المعالجة (الشكل 4 C و D). لأن كلا BBS10 وBBS12 هي بروتينات chaperonine مثل وكلاهما المحلية في مريكز، تساءلنا ما إذا كان أحد في حاجة الآخر للتوطين في مريكزي. أجرينا المناعي للBBS12 في الخلايا BBS10 المحرومين وللBBS10 في الخلايا BBS12 حرمان (الشكل 4 E و F) ولا فرق في BBS10 توطين لوحظ بعد الحرمان BBS12 أو العكس بالعكس.

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 4.

تشكيل هدب ضعف أثناء تكون الشحم على BBS تدق إلى أسفل. (A) و transfected تسعين في المئة preadipocytes متموجة وتربيتها لمدة 4 أيام في نمو preadipocytes المتوسطة. بعد أربعة أيام، تم إجراء تحليل للطخة مناعية لBBS10 على السيطرة transfected الدوبلكس رني (متوسطة ومنخفضة سلبي تحكم العالمي الشبح رني) (حارات 1 و 2 على التوالي) وعلى BBS10 رني خلايا preadipocyte متموجة ضربة قاضية (BBS10 الدوبلكس 1 و 2) (SI طرق والممرات 3 و 4 على التوالي). تم الحصول على تخفيض كبير في BBS10 مستوى البروتين. كان يستخدم لمكافحة β-تويولين كما تحكم التحميل. والمعطل (B) BBS12 بطريقة وخلية مماثلة lyzates تحليلها من قبل immunoblotting (تم تحميلها الممرات 1 و 2 مع مقتطفات الخلوية من المتوسطة والمنخفضة الشبح تحكم العالمي رني الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل السلبية والحارات 3 و 4 تتوافق مع تلك من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع BBS12 الدوبلكس 2 و 3). وقد لوحظ أيضا انخفاض كبير في مستوى BBS12. (C) BBS10 أو BBS12 إسكات لمنع تكون الأهداب. بعد أربعة أيام رني ترنسفكأيشن، تم تقييم وجود أهداب. وتظهر الصور التمثيلية للBBS10، BBS12، والخلايا السيطرة رني transfected. السهام تشير إلى هدب الأساسي. تم احتساب هذا هو، (عدد أهداب / العدد الكلي للنواة) × 100٪ وتآمر ن = 550 لكل من 3 تجارب مستقلة: (شريط مقياس، 40 ميكرون.) (D) النسبة المئوية للخلايا مهدبة. تم الحصول على تخفيض كبير في الخلايا المهدبة (مراقبة مقارنة BBS10: P = 0.001 والسيطرة مقارنة BBS12: P = 0.003). أظهرت (E) Immunolocalization من BBS12 في preadipocytes BBS10 المحرومين التي التعريب مريكزي من البروتين BBS12 لم يتأثر في غياب BBS10. كان (مقياس شريط، 5 ميكرون.) (F) وبطريقة مماثلة BBS10 توطين مريكزي أيضا يتأثر في preadipoctes BBS12 المحرومين. (شريط مقياس، 5 ميكرون).

ثم اختبرنا ما إذا BBS10 وBBS12 نهدم تؤثر على المنظمين الرئيسيين لتكون الشحم كما GSK3، بيتا catenin، وPPARγ على أساس الإجراء التجريبي هو مبين في مخطط (SI النص والشكل S3). وأجري الكشف المناعي كل من الأشكال النشطة الخاملة وunphosphorylayed فسفرته من GSK3β الإسوي في preadipocytes بها. على BBS10 وBBS12 تعطيل، وزادت النموذج النشط unphosphorylated من GSK3 مقارنة السيطرة transfected الخلايا (الشكل 5 A و B لELISA الكمي). GSK3 نشط يقمع بيتا catenin تراكم النووي (24). ولذلك تم عزل حشوية وكسور النووية من preadipocytes متموجة بعد BBS10 وBBS12 تعطيل وتحميلها على جل للمناعي. تم الكشف عن المحتوى العالي من البروتين النووي β-catenin في حارة السيطرة مقارنة BBS10 والممرات BBS12 تدق إلى أسفل (الشكل 5 C، الحق). تم اختبار الفصل الفعال بين الكسور النووية وحشوية لطخة غربية باستخدام هيستون H3 كعلامة التحكم (SI النص، انظر الشكل S1 E و F.). في الواقع، تم الكشف عن هيستون H3 فقط في جزء النووي، مما يدل على فصل جيد من الكسور. يصاحب ذلك في الحد من النووي β-catenin، وتثبيط BBS10 وBBS12 التعبير التي يسببها تراكم النووي أعلى من PPARγ في التفريق preadipocytes مقارنة مع الخلايا السيطرة (الشكل 5 D). وقد أكد هذا التأثير عن طريق تحليل لطخة غربية (الشكل 5 E). ويرافق زيادة مستوى PPARγ بواسطة إعادة توزيعه في نوى، والتي تظهر أكثر تجانسا من الخلايا التي تعبر عن المستويات العادية من BBS10 وBBS12 البروتينات.

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 5.

ويفضل تكون الشحم في الخلايا الشحمية BBS المحرومين. (A) صور المناعي التمثيلية للكشف عن فسفرته GSK3β نشط (GSK3β-P) وunphosphorylated GSK3β تنشط في preadipocytes التفريق بعد العلاج رني المشار إليها. وقد لوحظ زيادة في unphosphorlated GSK3β بعد تعطيل أي من BBS10 أو BBS12. (أشرطة النطاق، 5 ميكرون.) (B) الكمي لالإسوي GSK3β النشط ELISA. وقد تم الحصول على الزيادات بين 20 و 35٪ في نشطة GSK3β بعد BBS10 (حارة 2) أو BBS12 (حارة 3) نهدم مقارنة للسيطرة على رني (حارة 1). (ن = 3؛ مراقبة مقارنة BBS10: P = 0.007 والسيطرة مقارنة BBS12: P = 0.013). (C) مناعي من حشوية والنووي β-catenin في preadipocytes متكدسة بعد 24 ساعة ترنسفكأيشن مع السيطرة، BBS10، وBBS12 رني. β-catenin تم الكشف عن بروتين في 94kDa. 1، رني السيطرة transfected. 2، BBS10 رني. 3، BBS12 رني. تم التحقق متجانسة البروتين تحميل (SI النص والشكل S1 D) (D) المناعي لPPARγ في preadipocyte transfected بعد 24 ساعة في التفريق المتوسطة. تم الكشف عن زيادة محتوى PPARγ في BBS10- والخلايا BBS12 رني المعاملة مقارنة بالمجموعة الضابطة. (E) والفرقة في 57 كيلو دالتون تم الكشف عنها من قبل لطخة غربية. 1، رني السيطرة transfected. 2، BBS10 رني. 3، BBS12 رني. وأكدت نتائج طخة غربية لزيادة التعبير PPARγ في الخلايا الشحمية بعد BBS المشار تدق إلى أسفل.

الليفية المستمدة خلية شحمية من المرضى الذين لديهم الميل العالي لتراكم الدهون الثلاثية.

كان المثقف الخلايا الليفية الجلدية من BBS10 وBBS12 المرضى والأصحاء في نمو الخلايا الليفية المتوسطة. لم يلاحظ أي فرق في التشكل بين BBS10- والخلايا BBS12 ناقصة مقارنة البرية من نوع الخلايا السيطرة (الشكل 6 A). في التقاء الكامل، والتفريق بين الخلايا إلى خلايا تراكم الدهون كما هو موضح في طرق SI والشكل. S4. بعد 14 يوما، تم تصور للفجوات الدهون في الخلايا الحية (الشكل 6 B). والدهون الثلاثية داخل الخلايا (37 تم قياس) مستويات في السيطرة والخلايا BBS التي تعاني من نقص وتم التخطيط لمستويات مضان المقابلة (الشكل 6 C). وقد لوحظ زيادة كبيرة في محتوى الدهون الثلاثية في خلايا المرضى BBS مقارنة مع الخلايا السيطرة. يصاحب ذلك إلى زيادة مستوى الدهون الثلاثية الموجودة في الخلايا مع بعضها BBS الجين المعطل، كان هناك مستوى اللبتين أعلى بكثير يفرز في مستنبت تقاس ELISA (الشكل 6 D).

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 6.

زيادة نسبة الدهون في الخلايا الشحمية المستمدة من الخلايا الليفية المرضى BBS ". (A) صور الممثل من الخلايا الليفية الجلدية الإنسان مع طفرة الجين المشار مثقف في ختان الإناث (SI النص، طرق) لالتقاء كامل قبل تحريض مكون الشحم. كانت ملطخة (مقياس شريط 20 ميكرون.) (B) تراكم الدهون الثلاثية بعد 14 يوما من الثقافة في FDAM مع Adipored الفحص الكاشف. وكانت زيادة الخلايا الفلورسنت ذات العلامات الملحوظة في الخلايا BBS10- وBBS12 تحور (الأوسط واليمين، على التوالي) مقارنة للسيطرة على الخلايا من النوع البري (يسار). (شريط مقياس، 60 ميكرون.) (C) وقد تم قياس مضان المستمدة من الدهون في 572 نانومتر لكل حالة (تابع لالبرية من نوع الخلايا الليفية صحية، BBS10-، والخلايا الليفية BBS12 تحور) وكنسبة مجموع مضان قياس لكل خلية. (ن = 3) (التحكم مقارنة BBS10: P = 0.001 والسيطرة مقارنة BBS12: P <0.001). وقد تم قياس (D) يفرز هرمون الليبتين في مستنبت بواسطة ELISA وأعرب باسم الامتصاصية الكلي في 450 نانومتر لكل خلية. بالتوازي مع زيادة محتوى الدهون الثلاثية داخل الخلايا، تم الكشف عن كميات أعلى من هرمون الليبتين في المتوسط ​​من الخلايا BBS تحور مقارنة بالمجموعة الضابطة الصحية (ن = 3) (التحكم مقارنة BBS10: P = 0.05 والتحكم مقارنة BBS12: P = 0.03).

القسم السابق القسم التالي

نقاش

توضح هذه الدراسة أن هدب الأساسي هو موجود على متكدسة التفريق preadipocyte (SI النص، انظر الشكل S2 ألف وباء). هذه تكون الأهداب هو عفوية عندما يتم التوصل إلى نقطة التقاء الخلوي الكامل و لا يتطلب سحب الدم. في هذا الصدد، وHWP يشبه الخلايا الظهارية الكلوية، والتي تظهر أيضا تكون الأهداب عفوية. ولكن في اختلاف monocilia الكلى، وهو 9 + 0، هدب الأساسي نقلته وpreadipocyte التفاضلي الإنسان لديه 9 + 2 (انظر SI النص والشكل S2 C) هيكل مثل الهدب المحرك امتحرك من خلايا الشعر في القوقعة (38، 39). عابرة 9 + 2 أهداب قد تعمل العضيات التنموية كما في النقاط الرئيسية في تمايز الخلايا في خلية شحمية والهدب المحرك. نماذج الماوس ذكرت لBBS تتكاثر في حالة زيادة الوزن الإنسان (10). علينا التحقق من أن مختلفا-tiating preadipocytes الماوس (خلايا 3T3-L1) ومهدبة أيضا (انظر SI النص والشكل S2 D)، مشيرا إلى أن هذا هو سمة مشتركة في تكون الشحم بين هذه الأنواع 2.
ويرافق الحالة مهدبة عابرة عن طريق التعبير زيادة تحديدها مؤخرا 2 الجينات BBS BBS10 وBBS12، بما يتفق مع النتائج السابقة أن الجينات BBS الأخرى هي أيضا التنظيم أثناء تكون الشحم في وقت مبكر (25). وBBS10 وتظهر BBS12 مريكزي / القاعدية الجسم توطين مثل chaperonine، في حين أن البروتين BBS الأخرى، والتي تشكل جزءا من BBSome، كما تم الكشف عن طول هدب كما يتضح من الكشف BBS1 (انظر الشكل 3). لذا يمكن للمرء أن تعتقد أن BBS10 وBBS12 مطلوبة، استنادا إلى وظيفتها المتوقعة للchaperonine، في المساعدة في تشكيل مكونات الهدبية ولا يشاركون مباشرة في مجال النقل intragellar. كلا BBS10 وBBS12 تظهر ضرورية لتكون الأهداب السليم أثناء تكون الشحم بسبب غيابهم يمنع تكون الأهداب، كما هو مبين في الشكل. 4. ومع ذلك، فإنها لا تحتاج إلى بعضها البعض لتوطين للcentrioles، كما تم الكشف عن أي تأثير على توطين كل منهما بعد ضربة قاضية واحدة أخرى (الشكل 4 E و F). هو سبب متلازمة Alström، وآخر حالة السمنة متلازمات تصنيفها مؤخرا باعتباره ciliopathy، من خلال الطفرات في الجين الترميز ALMS1 للبروتين الهدبية آخر. وقد تبين ALMS1 مؤخرا إلى أن تنظم خلال تكون الشحم (40)، مما يدل على ارتباط بارز بين البروتينات الهدبية وتكون الشحم.
وهدب الأساسي يحمل WNT وسمو المستقبلات، وهي مسارات الإشارات القديمة ومنظمات هامة معترف بها من تكون الشحم. على تثبيط BBS10 وBBS12 تعبير البروتين، وpreadipocyte التفريق يفقد هدب الذي يحمل WNT وسمو مستقبلات. هذا هو على الأرجح السبب في الزيادة الملحوظة في شكل نشط (unphosphorylated) من GSK3β، ويرتبط مع انخفاض في محتوى النووي β-catenin. التوازن GSK3β بوساطة بين β-catenin وتم PPARγ توثيقها مسبقا وتثبيط β-catenin قد يكون لصالح تنظيم ما يصل من PPARγ (17) أن لاحظنا. والمثير للدهشة، وPPARγ الكشف بسهولة سواء عن طريق المناعي وصمة عار الغربية سوى 24 ساعة بعد تحريض مكون الشحم بوساطة تغيير المتوسطة في هذه preadipocytes التفاضلي الإنسان، الذي يبدو أنه يتعارض مع التقارير السابقة التي تبين وجود PPARγ سوى 48 ساعة بعد تحريض تكون الشحم (15، 41، 42). التعبير عن PPARγ وقد درس على نطاق واسع في نماذج الفئران، وخصوصا preadipocytes 3T3-L1، التي تتطلب التوسع نسيلي الإنقسامية قبل أن يتمكنوا من البدء في التعبير عن الجينات المنتجة النمط الظاهري خلية شحمية بما في ذلك PPARγ (43). وهناك فرق كبير موجود بين درس على نطاق واسع 3T3-L1 نموذج preadipocyte وpreadipocyte الإنسان الأساسية المستخدمة في هذه الدراسة، كما preadipocytes الإنسان يمكن المضي قدما من خلال التمايز النهائي دون الانقسام postconfluence (44)، والتي قد تكون مسؤولة عن التعبير سابق من PPARγ بعد مكون الشحم الحث. للتأكد من تأثير proadipogenic من BBS10 والحرمان BBS12، ونحن ترسيتها BBS10 وBBS12 في preadipocytes متموجة وأبقى زرع لهم في وسط النمو preadipocyte والمتوسطة وضعت خصيصا لمنع تكون الشحم، لمدة 48 ساعة قبل تحليل PPARγ التعبير (انظر SI النص و الشكل S2 F). تم الكشف عن PPARγ بسهولة في مقتطف من BBS10- وpreadipocytes BBS12 المحرومين وبقيت لا يمكن الكشف عنها تقريبا في المحللة السيطرة. هذا يثبت أن غياب هدب التالية BBS10 أو BBS12 تعطيل غير كافية لإحداث تكون الشحم، ربما عن طريق تعطيل إشارات Wnt، التي لا يمكن الكشف عن بعد BBS نهدم (لا تظهر البيانات).
على الرغم من knockdowns الجينات مستقرة مفيدة، الخلايا الليفية الإنسان من المرضى الذين يعانون من الطفرات السمات التي تميزت في كثير من الأحيان تمثل أداة لا تقدر بثمن للتحقيق في الأمراض ذات الصلة. هنا، كنا قادرين على إعادة برمجة الخلايا الليفية الثقافة والجلدية من مريضين BBS لخلايا تراكم الدهون معربا عن PPARγ وGLUT4 (انظر SI النص، طرق، والشكل. S4). ومن المثير للاهتمام، خلال ثقافة هذه الخلايا، لم يلاحظ أي اختلاف في نمو الخلايا أو في الجوانب الخلوية الهيكلية (لا تظهر البيانات)، على الرغم من أن وصفت أن BBS6، وغيرها من البروتين مثل chaperonine الأسرة BBS، ومنعت الانقسام السيتوبلازمي ذات العوائد غير طبيعي خلايا متعدد النوى (32). ولذلك قد البروتين BBS6 تمتلك دورا محددا في انقسام الخلايا، التي لا تشارك على حد سواء BBS10 وBBS12. استنادا إلى تأثير وحظ على PPARγ التعبير بعد BBS محدد ضربة قاضية في preadipocytes التفريق، تم قياس محتوى الدهون الثلاثية داخل الخلايا ومستويات اللبتين يفرز، ولوحظ زيادة كبيرة في محتويات الدهون الثلاثية داخل الخلايا في الخلايا BBS تحور مقارنة مع الخلايا السيطرة (انظر الشكل. 6 B-D). ومن المعروف جيدا أن إفراز هرمون الليبتين يرتبط مباشرة إلى السمنة. وقد تم قياس زيادة في إفراز هرمون الليبتين في مستنبت من خلايا BBS تحور مقارنة مع الخلايا السيطرة، إعادة إنتاج النمط الظاهري-لوحظ البشرية من تركيزات عالية تعميم اللبتين.
وقد اقترحت مسارات الفيزيولوجية المرضية التي تؤدي إلى السمنة في المرضى BBS يجب أن تكون متصلة وسط سيطرة الجهاز العصبي من وزن الجسم. مطلوبة البروتينات BBS لتوطين الهدبية السليم في الخلايا العصبية من مستقبلات Mchr1، والمشاركة في تنظيم سلوك التغذية (12). قد تكون لهم علاقة الخلايا العصبية المهدبة طائي في مقاومة اللبتين وصفها مؤخرا في المرضى الذين يعانون BBS وBBS نماذج الماوس خروج المغلوب يعانون من السمنة المفرطة (10، 45). وقد تبين BBS تثبيط الجين في هذه الخلايا العصبية للحد من التعبير POMC، وهو الجين ينشط هرمون الليبتين عبر STAT3 (10). ومع ذلك، هذا التخفيض لا يمكن أن يفسر فقط الزيادة الشديدة في وزن الجسم لأن الفئران مع تعطيل محدد من STAT3 وانخفض لاحقا POMC المعرض التعبير زيادة خفيفة في وزن الجسم الكلي وسوى زيادة 2-أضعاف في لوحة كتلة الدهون (46). النتائج المقدمة في هذه المقالة تشير إلى أن السمنة BBS المصاحب قد يكون له أصل مزدوج: اقترح أصل الجهاز العصبي المركزي (10، 11) جنبا إلى جنب مع الأصل الطرفية عن طريق زيادة تكون الشحم عن طريق تثبيط إشارات Wnt.
المتلازمات الحثل الشحمي هي حتى الآن المتلازمات الوحيدة المتعلقة تشوهات الابتدائية في تكون الشحم. وحتى الآن، لم يتم الإبلاغ السمنة المرتبطة بضعف تكون الشحم، ويعتقد أن زيادة كتلة الجسم لا علاقة مباشرة لتمايز خلية شحمية. قريب جدا ومع ذلك، تساو وآخرون. (47) قدم أدلة لشبكة الغدد الصماء بوساطة الدهون حيث تستخدم الأنسجة الدهنية نفسها lipokines على التواصل مع الأجهزة الأخرى وتنظيم توازن التمثيل الغذائي النظامية. لذا نقترح أن تكون الشحم نفسه أن يشارك في التسبب في السمنة. هذه الفرضية تستدعي المزيد من التحقيقات في الجسم الحي. لمعالجة هذه المسألة، وأن تشريح المعلمات الجزيئية المرتبطة بها، وسوف تستخدم الفئران خروج المغلوب الشرطية لاستهداف تعطيل BBS محدد في الأنسجة الدهنية، والتي سوف تتيح لنا أن نفهم دور معزز تكون الشحم في السمنة BBS التي يسببها.

 

[رافت ابراهيم]

 

 

[رافت ابراهيم]

 

http://diabetes.diabetesjournals.org...5/10/2876.full

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب في النمو نادر مع الميزات الأساسية للالبدانة في منطقة البطن، واعتلال الشبكية، polydactyly وضعف الإدراك، الكلى والتشوهات القلبية وارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري. BBS غير المتجانسة وراثيا، مع تسعة الجينات التي تم تحديدها حتى الآن، والدليل على مواضع إضافية. في هذه الدراسة، أجرينا تحليل تحور في المناطق الترميز والحفاظ عليها من BBS1، BBS2، BBS4، وBBS6 في 48 الأفراد قوقازي الفرنسي. بين 36 المتغيرات التي تم تحديدها، وقد تم اختيار 12 ومرمزة في 1943 مواضيع الحالة الفرنسية القوقاز وnonobese 1299 الرعايا الفرنسيين القوقاز تحكم شخصا غير مصابين بالسكر. وأظهرت المتغيرات في BBS2، BBS4، وBBS6 دليل على ارتباط مع السمنة المشتركة بطريقة تعتمد على العمر، وBBS2 واحد النوكليوتيدات تعدد الأشكال (SNP) يجري المرتبطة بالسمنة الكبار المشترك (P = 0.0005) وBBS4 وBBS6 تعدد الأشكال ارتباطهم السمنة المشتركة مبكرة بداية الطفولة (P = 0.0003) والكبار المشترك السمنة المرضية (0.0003 <P <0.007). تم العثور على جمعية البديل rs7178130 BBS4 لتكون معتمدة من قبل الاختبار اختلال التوازن الإرسال (P = 0.006). كما أظهرت المتغيرات BBS6 الأدلة الاسمية للجمعية مع مكونات الكمية من متلازمة التمثيل الغذائي (على سبيل المثال، دسليبيدميا، ارتفاع السكر في الدم)، والمضاعفات التي سبق وصفها في المرضى الذين يعانون BBS. باختصار، تشير البيانات الأولية لدينا أن التغيرات في الجينات BBS ترتبط مع خطر السمنة المشتركة.

• BBS، متلازمة بارديه-بيدل
• MAF، تردد أليل طفيفة
• SNP، تعدد الأشكال النووية المنفردة
• TDT، اختبار اختلال التوازن انتقال

هو سبب السمنة الشائعة عن طريق التفاعل بين العديد من الجينات والبيئة، مع كل الجين ينتج سوى تأثير معتدل. وعلى الرغم من بعض النجاح باستخدام استراتيجيات الاستنساخ الموضعية (+1 - 3)، وتحديد الجينات قابلية جديدة تشارك في السمنة المشتركة لا تزال مهمة صعبة. متلازمة بارديه-بيدل (BBS؛ OMIM 209900) هو اضطراب في النمو النادر أن تفصل في الأسر على حد سواء وراثي جسمي مقهور الكلاسيكية وسمة digenic. BBS يسلك التجانس السريري كبير من الصفات الست الرئيسية التي تميز بها (4، 5)، والتي هي تقدمية (السمنة، ضمور شبكية العين، وصعوبات التعلم) أو الهيكلي (polydactyly، والتشوهات الكلى والقلب، ونقص الأعضاء التناسلية) (6، 7) . عدم التجانس الوراثي هو واضح من تحديد الطفرات المسببة للأمراض في تسعة جينات BBS، مع BBS1-6 (+8 - 14) وBBS9 (15) التي تم تحديدها من خلال دراسات الربط الوراثية و / أو تحليل الجينومي المقارن وBBS7 (16) وBBS8 (17 ) التي تم تحديدها على أساس التماثل لجينات BBS التي سبق تحديدها. على الرغم من أن الآليات الخلوية التي تكمن وراء BBS لا تزال غير واضحة، هو الآن واضحا أن كل من البروتينات BBS المعروفة هي مكونات الجسيم المركزي و / أو هيئة القاعدية ويكون لها تأثير على النقل الهدبية (18). ومن المثير للاهتمام، والاضطرابات الأخرى المنشأة centrosomal، مثل متلازمة Alstrom (19)، أو اضطرابات centrosomal المشتبه بهم، مثل متلازمة كوهين، مشاركة العديد من الجوانب المظهرية لBBS والسمنة على وجه الخصوص، مما يشير إلى دور هذه البروتينات والعضيات في التسبب في السمنة.
التحقيق من المتغيرات الجينية BBS يحتمل أن تكون مفيدة في تحديد ما إذا كانت تسهم أيضا في السمنة المشتركة لالمبكر بداية السمنة هي أعراض نموذجية من هذه المتلازمة. وقد تبين أن إلزام الناقلين من BBS الطفرات متخالف أكثر من يعانون من السمنة المفرطة noncarriers، دون عرض عديد المظاهر التنموي السمات المميزة لهذه المتلازمة (20). وبناء على هذه الفرضية، وكان مجموعة واحدة التحقيق سابقا مساهمة BBS6 إلى السمنة جينائي في عدد السكان الدنماركي، لكنهم فشلوا في تحديد دور هذا الجين مع السمنة المشتركة (21).
وقد نماذج الفئران جلبت مؤخرا رؤى جديدة في أصل السمنة في المرضى الذين يعانون BBS. وقد أثبتت الدراسات الحديثة أن Bbs2 - / - (22)، Bbs4 - / - (23)، وBbs6 - / - (15) الفئران لديها ملامح الفوضى البشرية وتطوير السمنة مرتبطة بزيادة الاستهلاك الغذائي. وقد لوحظت مستويات اللبتين مرتفعة في Bbs6 - / - الفئران قبل وبعد ظهور البدانة، مما يدل على أن النمط الظاهري السمنة قد تكون تعتمد على اللبتين إشارات الطريق (15).
في هذه الدراسة، ونحن اختبار الفرضية القائلة بأن الأشكال في BBS1، BBS2، BBS4، وBBS6 يشاركون في السمنة المشتركة. لتحديد الدور المحتمل للمتغيرات جينية BBS في السمنة جينائي، ونحن فحص الجينات الأربعة في 48 الفرنسية القوقازيين (24 موضوعا حالة السمنة و 24 nonobese الضابطة شخصا غير مصابين بالسكر). والأشكال الشائعة المتكررة النووية المنفردة (النيوكلوتايد)، أي تردد أليل القاصر (MAF)> 5٪، ومرمزة في القوقازيين الفرنسية السمنة التي تتكون من 627 البالغين البدناء، 694 البالغين البدانة المفرطة، و 622 أطفال يعانون من السمنة المفرطة. لتحليل الحالات والشواهد، وتمت مقارنة أليل، الوراثي، والترددات النمط الفرداني مع الترددات في nonobese الضابطة شخصا غير مصابين بالسكر 1299 الفرنسية-القوقازية.

القسم السابق القسم التالي

تصميم البحث وأساليبه

وكانت جميع المواد قوقازي الفرنسي وتم تعيينهم باستخدام حملة الوسائط المتعددة التي يديرها المركز الوطني الفرنسي للبحث العلمي (CNRS)، وقسم التغذية في مستشفى باريس أوتيل ديو، ومعهد باستور دي ليل و في قسم طب الأطفال والغدد الصماء مستشفى جين دي Flandres لل، وكذلك في مستشفى الأطفال في تولوز. لهذه الدراسة، لفيف من 627 فئة لا علاقة لها 1 و 2 البالغين يعانون من السمنة المفرطة (40> BMI> 30 كجم / م 2)، 694 فئة لا علاقة لها 3 البالغين يعانون من السمنة المفرطة (مؤشر كتلة الجسم> 40 كجم / م 2)، و 615 أطفال يعانون من السمنة المفرطة لا علاقة لها (العمر تم تجنيدهم <18 عاما مع BMI> المئين 97th بالنسبة للعمر والجنس)، أي ما مجموعه 1936 حالة المواد (الجدول الملحق الانترنت 1 [متاح في http://diabetes.diabetesjournals.org]). وكان جميع المواد تم فرزها من قبل لطفرات MC4R. بالإضافة إلى ذلك، تم توظيف ما مجموعه 1299 شخصا غير مصابين بالسكر nonobese المواضيع المراقبة الكبار لالتنميط الجيني لدراسة تكوين الجمعيات. وكانت الضابطة المجمعة الكبار لا علاقة لها nonobese غير المصابين بالسكري القوقازيين الفرنسية من ثلاث دراسات منفصلة: مجموعة من 266 فردا (يعني BMI 23.09 ± 2.16 كجم / م 2، متوسط ​​أعمارهم 42.52 ± 4.48 سنة، و 105 من الرجال و 161 من النساء) ومجموعة من 297 تم تجنيدهم الضابطة (BMI 22.93 ± 2.30 كجم / م 2 والعمر 60.70 ± 11.51 عاما، و 123 من الرجال و 174 من النساء) في CNRS ليل و من خلال فلوبايكس-لافينتي فيل سانتيه الدراسة (24). والمجموعة الثالثة 736 الأفراد (BMI 3.79 ± 1.80 كجم / م 2 والعمر 53.47 ± 5.65 سنوات، 293 من الرجال والنساء 443) مختارة من بيانات من دراسة وبائية على دراسة الأنسولين متلازمة مقاومة (دزير). لاختبار اختلال التوازن الإرسال (TDT)، قمنا بتحليل 638 ثلاثيات الفرنسية (اثنين من الآباء والأمهات والأطفال يعانون من السمنة المفرطة واحد) للسمنة الطفولة (الأطفال المتضررين: يعني BMI 4.58 ± 0.18 كجم / م 2، يعني سن 11.28 ± 3.16 سنة)، 435 ثلاثيات الفرنسية مع البدانة في مرحلة البلوغ (BMI 39.25 ± 7.97 كجم / م 2 والعمر 46.65 ± 14.94 عاما)، و 428 ثلاثيات الفرنسية مع الأطفال يتأثر (BMI 21.33 ± 6.64 كجم / م 2 والعمر 28.84 ± 10.18 سنة). وتمت الموافقة على دراسة وراثية من قبل اللجنة الأخلاقية للأوتيل ديو في باريس وCHRU (مركز HOSPITALIER الجهوي الجامعي) في ليل.

الظواهر.

وقد تم قياس الوزن في حالة nonpostprandial ومع المثانة فارغة، وتقرر لأقرب 0.1 كلغ على نطاق وشعاع طبيب القياسية مع موضوع يرتدي فقط في الملابس الداخلية خفيفة وبدون حذاء. وقد تم قياس الطول إلى أقرب 0.5 سم على لوحة الارتفاع القياسي، ومرة ​​أخرى من دون أحذية. تم حساب مؤشر كتلة الجسم كما الوزن بالكيلوغرام مقسوما على مربع الطول بالأمتار. تم الحصول على النتيجة ض BMI وفقا لطريقة كول (25).

عزل الحمض النووي.

تم استخراج الجينوم DNA من خلايا الدم الطرفية باستخدام الصرفة الجينات D50K عدة عزل الحمض النووي (نظم Gentra) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

التسلسل.

لتسلسل BBS1، BBS2، BBS4، وBBS6، مجموعة فرعية عشوائية من 24 لا علاقة البالغين البدناء الفرنسي من المهووسين مجموعة السمنة الكبار المذكورة أعلاه ومجموعة فرعية من 24 nonobese الفرنسية لا علاقة لها استخدمت الضابطة سوي سكر الدم. وقد صممت ما مجموعه 92 المتداخلة شظايا PCR لتغطية BBS1، BBS2، BBS4، والجينات BBS6، بما في ذلك الإكسونات، وهي منطقة المروج معقولة 1 كيلوبايت المنبع من بداية اكسون 1، ومنطقة 1 كيلو بايت المصب من نهاية اكسون الماضي. والتسلسل شظايا في الاتجاه الأمامي والعكسي. تم تصميم كبسولة تفجير عن هذه الشظايا، وذلك باستخدام Primer3 (www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html). والتسلسل الجينات باستخدام الآلي ABI بريزم 3700 المنظم DNA في توليفة مع الكبار صبغ المنهي دورة التسلسل استعداد مجموعة من ردود الفعل (النظم البيولوجية التطبيقية، فوستر سيتي، كاليفورنيا). وأكد تعدد الأشكال وجدت في اتجاه واحد التمهيدي عن طريق عرض حبلا المعاكس. حسبت SNP الترددات أليل من هذه البيانات التسلسل.

التنميط الجيني.

بين 36 المتغيرات التي تم تحديدها من خلال تحليل التسلسل، تم اختيار 12 النيوكلوتايد استنادا إلى نهج SNP علامات موضح أدناه ومرمزة في مجموعة مراقبة حالة وفي الأنساب السمنة، وذلك باستخدام TAQMAN أو SNPlex (النظم البيولوجية التطبيقية) المقايسات. نحن مرمزة 104 موضوعات حالة السمنة و 88 الضابطة شخصا غير مصابين بالسكر nonobese (6٪)، وذلك باستخدام كل من TAQMAN والمقايسات SNPlex، لتقييم مدى التطابق بين أساليب التنميط الجيني مختلفة، ولم نعثر على أي تناقضات.
واعتبر التنميط الجيني لعلامات النجاح إذا يمكن أن يسمى> 85٪ من المورثات. تم تجاهل أي التنميط الجيني لترددات الأليل المتوقعة اختلفت كثيرا عن هاردي واينبرغ، التوازن (P <0.05). لثلاثيات، لم تكن هناك أخطاء المندلية.

التحليل الاحصائي.

قارنا الترددات أليل بين القضية ومراقبة المواد باستخدام اختبار χ 2 واحتساب قيمة P تجريبيا مع أجمة البرنامج. تم ترددات الوراثي ثم تحليلها باستخدام النماذج السائدة والمتنحية. مقارنة النموذج السائد في مجموعة مشتركة من الزيجوت وأصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل لأليل نادر مع أصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل لأليل المشترك، ومقارنة نموذج المتنحية مجموعة أليل نادرة زيجوت متماثلة الألائل مقابل بقية. للتأكد من أن لم يكن هناك اختلاف بين المجموعات الثلاث التي تتألف المجموعة الضابطة، أليل وراثى الترددات لكل مجموعة كما تم مقارنة من اختبار χ 2 (الجدول 1).
نحن مصممون ترددات النمط الفرداني وقارنوها بين الجماعات، وذلك باستخدام برنامج UNPHASED. قمنا بتقييم تأثير النسخ المتنوعة على نوعي أو كمي الاختلاف سمة، وذلك باستخدام cocaphase البرامج الفرعية وكيو تي المرحلة من UNPHASED. اختبرنا استقلال بالتعاون مع THESIAS البرمجيات (26). كما تنفذ THESIAS خوارزمية توقع-تعظيم والتي تسمح للاختبار احتمال نماذج من تأثير النمط الفرداني في إطار خطي. استخدمنا هذا البرنامج لاختبار ما إذا كان تأثير كل SNP على حالة البدانة مستقلة عن تأثير المتغيرات المرتبطة بشكل كبير وحدها.
وقد تم تحليل الإرسال من الأليلات باستخدام برنامج فرعي Tdtphase من UNPHASED، الذي يقيم معدلات نقل الأليل في ثلاثيات والاختبارات للانحراف عن انتقال متوقع 50٪. وقد قدرت قوة لتحليل TDT من المتغيرات الأربعة المرتبطة باستخدام برنامج Quanto (27) (الجدول 2). ودرس هناك تأثير الجنس على المرتبطين تعدد الأشكال الأربعة ولم يتم العثور في الأسر.
وقدرت اختلال التوازن الربط باستخدام خوارزمية توقع-تعظيم كما نفذت في GOLD (28). وقد تم اختيار "النمط الفرداني العنونة" تعدد الأشكال باستخدام D 'وΔ 2. عندما كان اثنين من تعدد الأشكال وD '> 0.9 وΔ 2> 0.7، واحد فقط تم الاحتفاظ SNP وتحديدها على أنها SNP العنونة النمط الفرداني. مع الحد الأدنى من ص 2 قيمة 0.7، تم العثور على 12 النيوكلوتايد مرمزة للقبض على تعدد الأشكال العلامة المحددة، وذلك باستخدام بلغة مع قاعدة البيانات هاب ماب المرحلة الثانية.
أجريت التحليلات الإحصائية من تعدد الأشكال (التصحيحات والمقارنات وسائل) باستخدام SPSS البرمجيات (الإصدار 12؛ SPSS، شيكاغو، IL). تحليلات سمة الكمية لض درجة BMI، تنتعش، والسمنة البداية، والصفات lipid- والمتعلقة البروتين الدهني أجريت باستخدام ر الطالب اختبار، إلا إذا انخفض حجم العينة في مجموعة واحدة أقل من 30 أفراد، وفي هذه الحالة اختبار مان ويتني U تم استخدامها. أجري النموذج الخطي العام أحادي المتغير مع الأخذ بعين الاعتبار الجنس والعمر الحملي لوزن المواليد وتحليلات الوزني مؤشر النمط الظاهري. أجري النموذج الخطي العام أحادي المتغير مع الأخذ بعين الاعتبار الجنس، العمر، مرحلة البلوغ، ومؤشر كتلة الجسم للأنسولين المعلمات / الجلوكوز.
ووجهت التفاعلات المحتملة بين المتغيرات BBS في السكان، وذلك باستخدام الانحدار اللوجستي لحالة السمنة، مع مراعاة الجنس. الانحدار الخطي تحليل التفاعل بين الصفات الكمية بين المتغيرات BBS. أولا، قارنا المنحدر بين مجموعتين مرمزة لكل SNP من BBS1، BBS2، BBS4، وBBS6 من خلال التنبؤ النمط الظاهري المختارة لكل متغير. الثانية، ونحن ننظر إلى تحسين التنبؤ نموذج الانحدار مع وبدون المعلمة التفاعل.
وبالنظر إلى أن تعدد الأشكال مرمزة داخل كل الجينات هي في اختلال التوازن الروابط القوية مع بعضها البعض، وأنه كل اختبار SNP ليست مستقلة تماما، وقدمت القيم P غير المصححة في الجدول 1 والنص الرئيسي. وبالمثل، نظرا للعلاقة القوية القائمة بين الصفات الكمية مختلفة (على سبيل المثال، بين الدرجة ض مؤشر كتلة الجسم والنتيجة Z من ارتفاع أو ئي B، الصيام الدهون الثلاثية، وHDL-الإجمالية إلى نسبة الكوليسترول في الدم)، وتصحح يتم عرض القيم P في الجدول 3 والنص الرئيسي. في النظر في عدد من الاختبارات الإحصائية التي أجريت، تم تطبيق التصحيح Bonferroni المحافظ بسيط، وحددت ما تبقى من قيم P تصحيح كبيرة (P <0.05 بعد التصحيح) ضمن الجداول. في الجدول 3، نجا أية قيم P التصحيح Bonferroni المحافظ.

القسم السابق القسم التالي

النتائج

تحديد تعدد الأشكال عن التنميط الجيني.

تسلسل الجينات BBS1، BBS2، BBS4، وBBS6 في البدناء والهزيل (ن = 48) حددت 36 تعدد الأشكال. وتتلخص مواقع هذه النيوكلوتايد في الجينات في الشكل. 1، وصفها هو في التذييل الانترنت الجدول 2.

BBS1.

وقد تم تحديد اثنين من تعدد الأشكال في التسلسل المنبع وخمسة في إنترون تقاطعات / اكسون، هما الطفرات المرادفة، وحددت ثلاثة في 3 'تسلسل المنطقة غير مترجمة. ومن بين هذه الأشكال 12، كان 11 في MAF> 5٪. تحليل الربط اختلال التوازن (D ') من نزلات كشف (MAF> 5٪) تعدد الأشكال أن كل من تعدد الأشكال التي تم تحديدها في الربط القوي اختلال التوازن (D'> 0.8) (التين الملحق على الانترنت 1 و 2). واستنادا إلى قيمة Δ 2، وقد تم اختيار اثنين من تعدد الأشكال العنونة النمط الفرداني (rs2298806 وrs1791686) وكتبته في مجموعة كاملة من العينات.

BBS2.

وقد تم تحديد ثلاث النيوكلوتايد في تسلسل المنبع وخمسة في إنترون تقاطعات / اكسون، هما الطفرات مغلطة، والتي تم تحديدها واحد في تسلسل المصب. ومن بين هذه الأشكال 11، 10 كان لها MAF> 5٪. تم اختيار مجموعة من خمسة تعدد الأشكال العنونة المفردات وكتابتها في مجموعة كاملة من العينات.

BBS4.

وقد تم تحديد واحد SNP في تسلسل المنبع واثنين في تقاطعات إنترون / اكسون، كان واحدا طفرة مغلطة، والتي تم تحديدها واحد في تسلسل المصب. ومن بين هذه الأشكال الخمسة، وكان كل وMAF> 5٪. تم اختيار مجموعة من اثنين من تعدد الأشكال العنونة النمط الفرداني (rs730180 وrs7167076) وكتابتها في مجموعة كاملة من العينات.

BBS6.

وقد تم تحديد واحد SNP في تسلسل المنبع واحد في إنترون تقاطعات / اكسون، هما الطفرات مغلطة، هما الطفرات المرادفة، وتم التعرف على اثنين في تسلسل المصب. ومن بين هذه الأشكال ثمانية، وكان كل وMAF> 5٪. وقد تم اختيار مجموعة من ثلاثة تعدد الأشكال العنونة المفردات وكتابتها في مجموعة كاملة من العينات.

جمعية الوراثية مع السمنة.

يوصف أليلية والتحليل الوراثي من المتغيرات المرتبطة الطفولة و / أو السمنة الكبار في الجدول 1. ويصف الملحق على الانترنت الجدول 3 متغيرات لم يتم العثور على تترافق مع السمنة في سكاننا. في BBS1، لم يتم العثور على العنونة النمط الفرداني اثنين من rs2298806 تعدد الأشكال وrs1791686 أن تترافق مع السمنة في موقعنا فوج (التذييل الانترنت الجدول 3).
في BBS2، واحدة intronic SNP، rs4784675، فقد وجد أن تكون مختلفة بشكل ملحوظ في تواتر الصبغيات في كل من الدرجة 1 و 2 البالغين يعانون من السمنة المفرطة (نسبة الأرجحية [أو] 1.39 [95٪ CI 1،15-1،69]، P = 0.0005) وفي الدرجة 3 البدناء (1.30 [1،08-1،57]، P = 0.006) مقارنة مع المجموعة الضابطة. أظهر rs4784675 SNP أي ارتباط كبير مع البدانة في مرحلة الطفولة.
في BBS4، لوحظ وجود علاقة لاحد من اثنين من تعدد الأشكال مرمزة، rs7178130، مع الأطفال يعانون من السمنة المفرطة (OR 0.76 [95٪ CI 0،65-0،88]، P = 0.0003)، والطبقة 1 و 2 البالغين يعانون من السمنة المفرطة (0.86 [0،74-0،99] ، P = 0.04)، والطبقة 3 البالغين يعانون من السمنة المفرطة (0.84 [0،73-0،97]، P = 0.02).
في BBS6، تم العثور على اثنين من تعدد الأشكال أن تترافق مع البدانة في مرحلة الطفولة: rs6108572 (OR 1.21 [95٪ CI 1،05-1،39]، P = 0.007) وrs221667 (1.33 [1،13-1،56]، P = 0.0007). تم العثور على rs221667 SNP أيضا أن تكون مختلفة بشكل ملحوظ في تواتر الصبغيات في البالغين يعانون من السمنة المفرطة بشدة (1.23 [1،05-1،44]، P = 0.01).
وقد تم تحديد النسخ المتنوعة الكبرى (MAF> 5٪) في كل الجينات باستخدام المرحلة. لم يظهر أي ارتباط أقوى مع السمنة مقارنة مع تحليل SNP واحد. ثم أننا مرمزة المتغيرات المرتبطة أربعة في 638 ثلاثيات الفرنسية مع البدانة في مرحلة الطفولة. باستخدام TDTs، وجدنا أن كثرة G-أليل من rs7178130 وovertransmitted إلى حد كبير في ذرية يعانون من السمنة المفرطة (P = 0.006)، ودعم نتائج تحليل الحالات والشواهد (الجدول 2). ولوحظ overtransmission Nonsignificant من أليل المعرضين للخطر السمنة الكبار أيضا في 435 ثلاثيات الفرنسية. تم استبعاد تشويه انتقال في مجموعة من 428 ثلاثيات الفرنسية مع الأطفال يتأثر (الجدول 2).

تأثير rs221667 BBS6 تعدد الأشكال وrs6108572، rs4784675 BBS2 SNP، وrs7178130 BBS4 SNP على السمنة والصفات المرتبطة بالسمنة.

التأثير المحتمل لأربعة تعدد الأشكال المرتبطة بشكل كبير على الظواهر المرتبطة بالسمنة الكمية (ض درجة BMI، تنتعش العمر، ض درجة من الارتفاع، والصوم الانسولين والجلوكوز والدهون، والبروتينات الدهنية) تم تحليلها في 622 الأطفال البدناء الفرنسية قوقازي ( الجدول 3).
في هؤلاء الأطفال، لوحظ وجود علاقة لrs221667 BBS6 SNP مع سن ارتدت من السمنة (P = 0.008) وارتفاع (ض درجة من الارتفاع، P = 0.005) ولكن ليس مع ض درجة BMI (P> 0.05). الأطفال متماثل لنادر G-أليل أقصر وتظهر ارتفاعا الثاني 10 شهر سابق من السمنة في مرحلة الطفولة. الأطفال البدناء الذين هم متماثلة اللواقح بالنسبة للrs221667 البديل يكون أعلى بكثير سكر الدم بعد الأكل (سكر الدم 2 ح الحمل بعد الجلوكوز، P = 0.006). ثم تم دراسة تأثير البديل على الدهون والبروتينات الدهنية. الأطفال متماثل البديل لديهم زيادة كبيرة في الصيام الدهون الثلاثية (P = 0.004)، وانخفاض كبير في نسبة الكولسترول HDL-لمجموعه (P = 0.05)، وزيادة كبيرة في ئي B (P = 0.02). تحليل rs6108572 BBS6 كشفت أيضا زيادة مستويات الدهون الثلاثية الصيام (P = 0.02) وئي B (P = 0.03) في الأطفال متماثل للمتغير.
أظهر الأطفال متماثل للC-أليل المعرضين للخطر rs4784675 BBS2 اتجاه هام نحو الارتفاع الثاني في وقت سابق من السمنة في مرحلة الطفولة (P = 0.05). وأظهر تحليل لتأثير المتغير على الدهون والبروتينات الدهنية أي ارتباط كبير مع الدهون الثلاثية الصيام، HDL، أو HDL-الإجمالية إلى نسبة الكوليسترول، ولكنها كشفت عن وجود زيادة كبيرة في ئي B (P = 0.02) في ناقلات CC.
وكشف تحليل الظواهر المرتبطة بالسمنة في 1009 من البالغين يعانون من السمنة المفرطة الفرنسية قوقازي أيضا انتشار زيادة كبير من ارتفاع ضغط الدم الشرياني في ناقلات CC نادرة من rs221667 BBS6 (P = 0.006)، في ناقلات TT نادرة من rs6108572 BBS6 (P = 0.03) ، وشركات الطيران AA متكررة من rs7178130 BBS4 (P = 0.04). على الرغم من أن من المعروف أن الصفات الكمية لتكون مرتبطة بقوة، عندما تم تطبيق التصحيح Bonferroni بسيط، فإن أيا من الجمعيات بقي دلالة إحصائية.

القسم السابق القسم التالي

نقاش

تم إحراز تقدم كبير في فهم BBS في السنوات الأخيرة. على الرغم من تحديد الجينات المسببة التسعة قد كشفت أن وظيفة الأهداب والنقل intraflagellar قد تكون العناصر الرئيسية في BBS المرضية، فإنه يبقى أن نرى ما هو الدور الذي تلعبه هذه البروتينات في subphenotype السمنة.
نفيدكم أربعة تعدد الأشكال في ثلاثة جينات BBS تظهر أدلة على ارتباط مع السمنة المشتركة في الفرنسى قوقازي السكان. على الرغم من المتغيرات المشتركة BBS1 أظهرت عدم وجود علاقة مع السمنة، تم العثور على BBS4 وBBS6 أن تترافق مع كل من البدانة في مرحلة الطفولة وتعليم الكبار، وكان BBS2 يرتبط فقط مع البدانة عند البالغين. وأيد رابطة البديل BBS4 أيضا من خلال تحليل TDT في البدانة في مرحلة الطفولة (P = 0.006).
على الرغم من أن تقترح دراستنا أن الطفرات BBS قد تزيد من خطر السمنة لدى الأفراد غير BBS، فشلت دراسة BBS6 ترميز المتغيرات في السكان يعانون من السمنة المفرطة الدنماركي لتحديد دور لهذا الجين في البدانة شائعة (21). بناء على الفرضية القائلة بأن الاختلاف أقل شدة من الجينات BBS6 قد يكون متورطا في التسبب في السمنة المشتركة، كان أداء هذه المجموعة تحليل تحور في المناطق الترميز BBS6. كان قد سبق ووصف دور محتمل في الصفات معقدة من المتغيرات أقل حدة من الجينات المسؤولة عن أشكال أحادية المنشأ من السمنة في داء السكري من النوع 2 مع MODY1 أحادية المنشأ (السكري للاستحقاق بداية الشباب 1) الكبدية النووي عامل α (HNF4A) الجينات المعنية في القابلية للمرض عديدة الجينات (2، 29). وأيد تطبيق هذه الفرضية إلى BBS مزيد من النتائج التي تلزم شركات من BBS الطفرات متخالف أكثر من يعانون من السمنة المفرطة noncarriers، دون عرض الظواهر الأخرى المرتبطة BBS (20). ومع ذلك، لم يتم العثور على النمط الفرداني السائد الذي يمثله Arg517Cys (rs1547) البديل لتكون أكثر انتشارا في مواضيع السمنة الدنماركية مقارنة مع الأفراد العجاف. وتكرر هذه النتيجة في الأفواج لدينا والتي لم يتم العثور على جمعية لBBS1 / 2 / 4/6 الأشكال الترميز، في حين تم العثور على أربعة متغيرات غير المكودة لتكون بشكل ملحوظ أكثر انتشارا في السمنة مقارنة مع الأفراد العجاف. تأثير الاختلافات تسلسل غير المكودة لا يزال لا يمكن التنبؤ بها إلى حد كبير ويصعب تمييز (30)، وأنها يمكن أن ينظر إليها على أنها المسبب الأشكال أقل ضار السمنة وsubphenotype BBS ل. قد تكون المتغيرات المرتبطة بها أيضا في اختلال التوازن الربط مع المتغيرات الوظيفية الحقيقية ربما المنبع من المنطقة التسلسل.
أجاب فريق الذي درس الاختلافات المظهرية بين ثلاثة مواضع مختلفة بين BBS المرضى أن الجينات BBS تختلف في تأثيرها على السمنة فيما يتعلق حد، وربما تقدم (31). وقد وصفت BBS4 وجود تأثير كبير على الوزن، بدءا من مطلع في الحياة، وتتقدم إلى السمنة المفرطة وهي نتيجة تتفق مع الحقائق لدينا، مع جمعية BBS4 (وBBS6) المتغيرات كونها أقوى في البدانة في مرحلة الطفولة مما كانت عليه في البدانة في مرحلة البلوغ. كان تأثير متغير المسببة للأمراض في BBS2 خفيف الوزن الزائد أثناء الطفولة وسن المراهقين وزيادة الوزن في مرحلة البلوغ (31). هذه النتيجة هي متطابقة مع النتائج التي توصلنا التي تصف البديل BBS2 أن يرتبط فقط مع البدانة في مرحلة البلوغ، وأقوى رابطة بعد أن تم التعرف في البالغين البدناء بشكل معتدل.
يسمح تحليل الصفات الكمية بنا للتحقيق في الاختلافات أكثر دهاء في المظاهر السريرية لمختلف أنواع BBS. وتناقش قيم P غير المصححة بسبب ارتباط قوي المعروفة بين الصفات تحليلها واستمرار الجدل حول صلاحية تصحيح Bonferroni (32).
تم العثور على السمنة أو البدانة الجسم التي ترفض عادة في 5-6 سنوات من العمر عند نقطة تسمى انتعاش السمنة تحدث كثيرا في وقت سابق من الأطفال متماثل للأليل نادر من كل من rs4784675 BBS2 وBBS6 المتغيرات rs221667 (P = 0.05 و P = 0.008، على التوالي). وارتبط انتعاش السمنة في وقت مبكر مع زيادة خطر على حد سواء في مرحلة الطفولة (33) والبدانة عند البالغين (34)، مستقلة عن كل من السمنة الأم ومؤشر كتلة الجسم في انتعاش السمنة. كما ترافقت rs221667 BBS6 بشكل كبير مع ارتفاع (ض درجة من الارتفاع، P = 0.005 )، وهي سمة التي سبق وصفها كما تأثر الجينات BBS (35)، والأطفال متماثل للأليل متحولة كونه أقصر من ناقلات أليل أ-.
أظهر الأطفال متماثل لكلا الخيارين BBS6 ارتباط كبير مع العوامل المميزة لدسليبيدميا تصلب الشرايين (على سبيل المثال، وزيادة الدهون الثلاثية الصيام، وزيادة ئي B). كان الأطفال البدينين الذين كانوا متماثل للrs221667 BBS6 البديل أيضا أعلى بكثير سكر الدم بعد الأكل. وقد وصفت دسليبيدميا وارتفاع السكر في الدم عن عوامل الخطر الرئيسية لمتلازمة التمثيل الغذائي، وهو عنصر سبق وصفها والمضاعفات من BBS (36).
وكشف تحليل المتغيرات المرتبطة السمنة لدى البالغين يعانون من السمنة المفرطة وزيادة انتشار ارتفاع ضغط الدم الشرياني في ناقلات CC نادرة من rs221667 BBS6، في ناقلات TT نادرة من rs6108572 BBS6، وشركات الطيران AA متكررة من BBS4 rs7178130. وتتوافق هذه النتيجة مع تزايد خطر ارتفاع ضغط الدم لوحظت في مرضى BBS وBbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران (15).
وقد أفيد أن الطفرات في BBS1 يمكن أن تتفاعل وراثيا مع الطفرات في BBS2، BBS4، BBS6، وBBS7، وكذلك في مواضع غير معروف، لتسبب النمط الظاهري (37). حاولنا لاختبار فرضية أن الطفرات في واحدة BBS الجينات يمكن أن تتفاعل وراثيا مع الطفرات في مواضع أخرى BBS لزيادة معدل السمنة أو تسبب الظواهر أكثر ناقصة. تم تحديد أي تفاعل واضح بين المتغيرات BBS (لا تظهر البيانات)، على الرغم من أن هذا من المرجح أن يكون سبب من قبل عدد محدود من الموضوعات مع مزيج من اثنين من المعرضين للخطر الأليلات.
في الختام، تساهم الجينات BBS2، BBS4، وBBS6 إلى الأشكال الشائعة من السمنة بطريقة تعتمد على العمر، BBS2 ارتباطهم المشتركة السمنة الذي يصيب البالغين وBBS4 وBBS6 يجري المرتبطة بالسمنة المبكرة بداية المشتركة التي تتطور إلى الكبار المشترك المهووسين أظهر السمنة. BBS6 أيضا أدلة الاسمي تكوين الجمعيات مع النمط الظاهري هو موضح سابقا في المرضى الذين يعانون BBS (36)، ومتلازمة التمثيل الغذائي. هناك حاجة إلى مزيد من العمل لتحديد من تعدد الأشكال الفنية الحقيقية و / أو التأثير المحتمل للمتغيرات غير مكود المرتبطة بها.

القسم السابق القسم التالي

ملحق

معلومات قاعدة البيانات الإلكترونية: dbSNP (www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)، فرقة (www.ensembl.org)، المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (www.ncbi.nlm.nih.gov)، والبرمجيات PhredPhrap (شبكة الاتصالات العالمية. genome.washington.edu)، Primer3 (www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html)، وUCSC (جامعة كاليفورنيا سانتا كروز) متصفح الجينوم (http://genome.ucsc.edu/ ).

القسم السابق القسم التالي

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

تين. 1.

هيكل الجينات BBS1، BBS2، BBS4، وBBS6 والمكان من 36 الأشكال المشتركة التي حددت في 24 موضوعا من السمنة و 24 شخصا غير مصابين بالسكر المواضيع nonobese. وأظهرت تعدد الأشكال Exonic بالخط العريض.

عرض هذا الجدول:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

الجدول 1

الوراثي وأليلية توزيع BBS تعدد الأشكال المرتبطة الطفولة و / أو البدانة عند البالغين

عرض هذا الجدول:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

الجدول 2

جمعية الأسرية البدانة في 638 ثلاثيات السمنة (والدان واحدة الطفل المصاب) و 435 الكبار السمنة ثلاثيات

عرض هذا الجدول:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

الجدول 3

الدراسات الكمية سمة من rs4784675، rs7178130، rs6108572، وrs221667 البديل في 622 الأطفال البدناء الفرنسية قوقازي

 

[رافت ابراهيم]

 

http://www.nature.com/ejhg/journal/v.../5201372a.html

صل على 21 يوليو 2004. المنقحة 25 نوفمبر 2004؛ تقبل 2 ديسمبر 2004. نشرت على الانترنت 16 مارس 2005.

أعلى الصفحة ملخص

يتم تعريف النمط الظاهري من متلازمة بارديه-بيدل (BBS) من قبل جمعية التهاب الشبكية الصباغي، والسمنة، polydactyly، نقص الأعضاء التناسلية، وأمراض الكلى وimpairement المعرفي. ويدعم هذا التباين الوراثي كبير من هذا الشرط من تحديد الهوية، حتى الآن، من ثمانية جينات (BBS 1-8) ضمنية مع الجمعية أهداب أو وظيفة. وقد تم مؤخرا اقترح الميراث Triallelic على أساس تحديد ثلاثة الأليلات تحور في اثنين من الجينات مختلفة لنفس المريض. في لفيف من 27 أسرة، وقد تم دراسة ستة جينات BBS (وهي BBS1، BBS2، BBS4، BBS6، BBS7 وBBS8). وقد تم تحديد الطفرات في 14 عائلة. وقد تم تحديد اثنين من الطفرات في الجين نفسه في سبع عائلات. وأكثر ما يعني ضمنا BBS1 مع استبدال M390R المشترك في الدولة متماثلة اللواقح (ن = 2)، أو المرتبطة طفرة أخرى في BBS1 (ن = 3). تم العثور على الطفرات متخالف مجمع في BBS2 (عائلة واحدة) وBBS6 (عائلة واحدة). في سبع عائلات أخرى، وقد تم تحديد واحد فقط تحور متخالف (مرة واحدة في BBS1، مرتين لBBS2 وثلاث مرات في BBS6). على الرغم من أن الدراسة لم تكشف عن أي الأسر التي لديها طفرات بحسن نية في اثنين من الجينات BBS، بما يتفق مع فرضية triallelic، وجدنا وجود فائض من الطفرات واحدة متخالف. وتؤكد هذه الدراسة عدم التجانس الوراثي للBBS وإشراك الجينات ربما مجهولة.
الكلمات الدالة:

بارديه-بيدل متلازمة، triallelism والجينات BBS

أعلى الصفحة مقدمة

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هي واحدة من متلازمات الأكثر شيوعا المرتبطة التهاب الشبكية الصباغي، وسبب الكلاسيكية من الموروث السمنة المتلازمات في مرحلة الطفولة. 1، 2 يتميز BBS من قبل الجمعيات التالية: المبكر يصيب التهاب الشبكية الصباغي، والسمنة، polydactyly، قصور الغدد التناسلية، صعوبات التعلم والكلى والتشوهات. 3، 4 كم هائل من المعرفة حول BBS قد تراكمت في الآونة الأخيرة، مما يدل على عدم التجانس الوراثي واسعة وإعطاء أدلة عن التسبب الهدبية هذه الحالة المعقدة. وأشير أيضا إلى أن الميراث لها قد تحيد عن راثي الميراث المتنحية الكلاسيكية ويمكن أن تنطوي، في بعض العائلات، ثلاثة الأليلات تحور في اثنين من الجينات (الميراث triallelic). 5، 6، 7، 8، 9
حتى الآن، كانت ثمانية جينات BBSidentified: BBS1 (11q13); 10 BBS2 (16q21); 11 BBS3 (3p12–13); 12 , 13 BBS4 (15q22.3–q23); 14 BBS5 (2q31); 15 BBS6 (20p12); 16 , 17 , 18 BBS7 (4q27); 19 BBS8 (14q32.11). 20 The BBS6 gene كما تم العثور على تحور في متلازمة McKusick كوفمان سريريا ارتباطا وثيقا. 21، 22 الطفرات نقطة في الجينات الثمانية المعروفة تمثل فقط حوالي 50٪ من المرضى BBS، مما يشير إلى أن هناك العديد من أكثر من الجينات التي يمكن العثور عليها.
تحديد BBS8، وبروتين المعنية على مستوى الجسم القاعدية من الخلايا المهدبة مع أي دور في تكون الأهداب أو التوسط التواصل بين هدب والداخلية للخلية، وفتحت الطريق إلى فهم عام من الفوضى خاصة وقد برز تداخل وظيفي كما بين بعض الجينات BBS. 20 وقد تم مؤخرا أظهرت BBS4 لاستهداف البروتينات للمنطقة محيط بالمريكز، وأن تشارك مع رسو أنيبيب وcyle خلية التقدم. 23 الفئران Bbs4 الصفرية يكشف ملامح مشتركة مع النمط الظاهري البشري و يؤكد اتصال مع خلايا مهدبة BBS4. 24 وفي هذه الدراسة، قمنا بتحليل 27 أسرة لمدة ستة جينات BBS (BBS1، BBS2، BBS4، BBS6، BBS7 وBBS8). نحن نؤكد ذلك، وبصرف النظر عن BBS1 وإلى حد أقل BBS6، الجينات الأخرى (بما في ذلك BBS7 حددت مؤخرا وBBS8) تساهم في نسبة صغيرة من المرضى BBS. نعالج أيضا مسألة إمكانية الميراث triallelic digenic في هذه المجموعة.

أعلى الصفحة المرضى والطرق

المرضى BBS

وقد تم اختيار المرضى الذين يعانون من المعايير التشخيصية التي يحددها وجود ثلاثة على الأقل من السمات الرئيسية: التهاب الشبكية الصباغي، والسمنة، polydactyly، قصور الغدد التناسلية، صعوبات التعلم وتشوه الكلى أو الفشل 4
تم تجنيد عائلات 27 (33 مريضا) التي تم تحليلها في هذه الدراسة من الوراثة الطبية الإدارات والأقسام طب العيون الموجودة في جميع أنحاء فرنسا. بين الأسر 27، 19 كانت حالات متفرقة والباقي كان اثنين على الأقل من أفراد المتضررين.
يتم تصنيف الأصل العرقي للعائلات حيث كانت ثلاث عائلات من شمال أفريقيا، وكانت ثلاثة الغجر والباقي (21 أسرة) كانت من أصل قوقازي.

PCR التضخيم من الجينات BBS

تم إجراء استخراج الحمض النووي من عينات الدم عن طريق إجراء المالحة القياسية. تحققت PCR التضخيم من الإكسونات والحدود اكسون-إنترون مع 50 نانوغرام من قالب الحمض النووي الجيني. تم تعديل تسلسل التمهيدي وفقا للأدب. 5، 7، 14، 18، 20، 22 هي PCR البروتوكولات وتسلسل التمهيدي متوفرة عند الطلب.

الكشف عن والمتكررة M390R طفرة BBS1 المتكررة

قمنا بتطوير اختبار تقييد لفحص سريع للمرضى لM390R طفرة المتكررة من BBS1، كما T G تبدال في اكسون 12 يعطل الموقع انشقاق عن جيش التحرير الوطني الليبي III تقييد انزيم (CATG /) (الشكل 1). تم إجراء تحليل PCR من اكسون 12 من BBS1 مع التمهيدي إلى الأمام 5'-CCATCCCCTGTCTTGCTTTC-3 "و التمهيدي العكسي 5'-CATGCTTCATTTCCACCTCC-3" باستخدام 50 نانوغرام من الحمض النووي و10 بمول من كل التمهيدي في معيار 25 ل التفاعل. تم تنفيذ PCR التضخيم في thermocycler هتما Biometra وفقا للشروط التالية: 3 دقيقة عند 94 درجة مئوية، 35 دورة في 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 59 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، وخطوة التمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. 10 تم هضمها لتر من المنتج PCR مع 2 U من جيش التحرير الوطني الليبي الثالث في العازلة المناسبة عند 37 درجة مئوية خلال 3 ساعات.
الشكل 1.

تم تضخيمه الكشف عن المتكررة M390R طفرة BBS1 من قبل جيش التحرير الوطني الليبي III هضم. BBS1 اكسون 12 كما هو موضح وهضم PCR من قبل جيش التحرير الوطني الليبي III تقييد انزيم (CATG /). وT G النتائج طفرة في فقدان الانقسام الطبيعي للPCR جزء 229-BP إلى 121- وشظية 104-BP (والمتبقي 4 بي بي nonvisualized). ملخص من السلطات الوطنية المعينة من الوالدين متخالف يثير العادي 121 و 104 العصابات وعسر الهضم الفرقة 229-BP؛ لم يهضم DNA من الأطفال المتضررين. C هو السيطرة الطبيعية.

الرقم الكامل وأسطورة (44 K)

طفرة فحص من BBS1، BBS2، BBS4، BBS6، BBS7 وBBS8 الجينات

تم إجراء فحص تحور الجينات ستة BBS عن طريق تحليل DHPLC باستخدام ثلاثة على الأقل درجات الحرارة وذوبان لكل amplicon، تليها التسلسل المباشر لمتغير شظايا PCR. للكشف عن الطفرات متماثل، تم إجراء تحليل لاحق من SSCP و / أو عن طريق خلط المنتجات PCR لDHPLC. لوجد المرضى أن تحور في جين BBS، تم تحليل تسلسل الترميز بأكمله المواقع بما في ذلك لصق عن طريق التسلسل المباشر.
تم إجراء التحليل DHPLC على WAVE نوكليك حمض قطعة نظام تحليل (Transgenomic، وشركة). تم تحديد درجات الحرارة وذوبان المثلى (T م) لكل جزء PCR التي كتبها الفردية من كل مجال تمسخ باستخدام البرمجيات WaveMaker 3.3.3 (Trangenomics شركة). لBBS7 وBBS8، كانت مختلطة عينات PCR من اثنين من المرضى لا علاقة لتشكيل heteroduplexes في ما يقرب من نسبة 1: 1 (بعد التحقق من حجم وكمية من المنتجات PCR على 2٪ هلام الاغاروز) عن طريق تسخين العينات المختلطة في 95 درجة مئوية لمدة 8 دقائق ثم التبريد إلى 25 درجة مئوية خلال خفض 0.5 ° C كل 19 ثانية.
SSCP (واحد حبلا تعدد الأشكال التشكل) أجري تحليل (فارماسيا في مجال التكنولوجيا الحيوية Genephor وفارماسيا في مجال التكنولوجيا الحيوية الآلي هلام الملطخ) من BBS1، BBS2، BBS4 وBBS6 في 15 ° C باستخدام الإجراء العادي.
تم إجراء تسلسل ثنائي الاتجاه للمنتجات PCR المنقى استخدام عدة ABI الكبير صبغ المنهي التسلسل على ABI3100 المنظم الشعرية الآلي (النظم البيولوجية التطبيقية). متوفرة عند الطلب بروتوكولات مفصلة.
مواقع لصق التهديف برامج (http://l25.itba.mi.cnr.it/~web
الجينات / wwwspliceview.html، http://www.fruitfly.org/seq_to
شريان الحياة / splice.html استخدمت) لتقييم تأثير الطفرات التي تؤثر على المواقع لصق وللكشف عن العواقب المحتملة صامتة، أو التغييرات مغلطة والاختلافات intronic على الربط. برنامج التنبؤي، والإنقاذ ESE خادم الويب (http://genes.mit.edu/burgelab/rescue-ese)، وكان يستخدم للبحث عن الأكسون exonic splicing enhancers المحتملة في المتغيرات exonic متعددة الأشكال (المتغيرات الصامتة أو مغلطة).

تحليل الحمض النووي مع الواسمات الوراثية

تم تنفيذ الفصل العائلي من الواسمات الوراثية الفلورسنت STRPs عبر BBS1، BBS2، BBS4 وBBS6 مواضع. متوفرة عند الطلب الظروف التجريبية. تم إنشاء النسخ المتنوعة لكل مريض أو الأقارب ذات الصلة.
وقد تم الحصول على تسلسل الصغرية من موقع UCSC متصفح الجينوم المعلوماتية الحيوية (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway): للمكان BBS1 (D11S4076، D11S1883، D11S1889)، لمكان BBS2 (D16S3140، D16S408، D16S3071، D16S673)، لمكان BBS4 (D15S1050، D15S204، D15S980، D15S1026) وموضع BBS6 (D20S162، D20S901، D20S160، D20S894).
اثنين الصغرية إضافية، D11S0887 وD11S0406 مترجمة على التوالي 60 كيلوبايت المنبع والمصب 75 كيلو بايت من الجين BBS1 استخدمت (S بهرام وH Inoko اتصال شخصي). A BBS4 داخل الجين (إنترون 4) STRP الصغرية، MIG4، تم استخدام (تانيا Attié، اتصال شخصي). نحن تتميز رواية BBS6 الصغرية داخل الجين STRP (MIG6) مترجمة في إنترون 1 و إجراء التحليل الفلورسنت مع الاشعال التالية 5'-CTCCAACCTGACAGCTAGG-3 "و5'-CCTGCACTTCCTGATAGCC-3".

تحليل كدنا]

تم إجراء تسلسل [كدنا التالية استخراج الحمض النووي الريبي مع RNeasy البسيطة مجموعة (QIAGEN). كان التسلسل الحمض النووي الريبي من المستلفت من I.3 عائلة مع ثلاث مجموعات من الاشعال تغطي BBS1 الترميز بأكمله تسلسل (التفاصيل حسب الطلب).

وصمة عار الجنوبية

تم إجراء تحليل لطخة الجنوبي من الحمض النووي وفقا لبروتوكول الكلاسيكية متوفرة عند الطلب. تم هضم الحمض النووي للالمستلفت من I.5 الأسرة مع الانزيمات تقييد التالية: ECOR I، هين dIII وXba I. استخدمت تحقيقين [كدنا المشعة التي تغطي تسلسل الترميز كامل BBS4 عن التهجين (التفاصيل المتاحة حسب الطلب).

أعلى الصفحة النتائج

تم الكشف عن الطفرات في 14 عائلة، ويمكن أن يتم الكشف عن أي طفرات ل13 عائلة المتبقية (الجدول 1، الشكل 2). تم العثور على سبع عائلات (50٪ من الأسر التي لديها طفرات الكشف) للقيام اثنين من طفرات في الجين نفسه: خمسة لBBS1 (اثنين من أصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل وثلاثة الزيجوت المركب)، واحدة للBBS2 (مجمع متغايرة) واحد لBBS6 (مجمع متغايرة). لسبع عائلات، تم العثور على واحد فقط طفرة واضحة أو المفترضة في حالة متخالف: واحد للBBS1، واثنين من لBBS4، ثلاث لBBS6 واحد لBBS7.
الرقم 2.

الأنساب من العائلات المشاركة في الدراسة مع الطفرات المقابلة.

الرقم الكامل وأسطورة (122 K)

الجدول 1 - الطفرات التي تم تحديدها في هذه السلسلة من 27 أسرة.

الجدول الكامل

الطفرات BBS1

وكانت الطفرات BBS1 الحالية في ست من الأسر 27. خمسة من أصل ستة المقابلة الطفرات probant حملت طفرة M390R (تردد أليل في probands BBS = 0.13). هما فقط probands (I.4 وI.6) متماثلة اللواقح بالنسبة للأليل M390R (7.4 مقابل 10.4٪ لدراسة سابقة). 27 في هذه السلسلة، تم تحديد أربع طفرات BBS1 إضافية، منها ثلاث لم يتم تسجيلها سابقا : E384X، R160Q وR429X. التوائم ثنائي الزيجوت المتضررة من عائلة I.15 تحمل كل من M390R وE549X الطفرات. الأخوة يتأثر هو متخالف لطفرة M390R. وأفادت التقارير طفرة E549X سابقا في ولاية متماثل في بويرتو ريكو-الأسر وأيضا في ولاية متخالف مجمع مع الطفرة M390R. 10، 25 يرتبط الطفرة M390R مع E384X في اكسون 12 في الأسرة I.22. والمستلفت الأسرة I.23 يحمل طفرة M390R وc.479G> والتغيير الذي يتوقع طفرة مغلطة (R160Q) التي تؤثر على بقايا الحفظ جدا، ولكنها أيضا الأكثر احتمالا يغير موقع لصق المانحة من اكسون 5، كما أنه يؤثر وG الأخير من اكسون (CG / gtgaga لCA / gtgaga) (الشكل 3). عضوان المتضررين من الأسرة I.3 تحمل طفرة R429X في اكسون 13، والتي من المتوقع أن يؤدي إلى اقتطاع البروتين N-المحطة، ولكن يمكن تحديد أية طفرة ثانية في BBS1، حتى الآن، لهذه الأسرة. وقد ورثت هذه الطفرة من الأب. وأظهر تحليل الواسمات الوراثية في موضع BBS1 أن اثنين من الفتيان المتضررين على حد سواء تتقاسم نفس النمط الفرداني الأمهات. هذه النتيجة يمكن أن تشير إلى وجود طفرة BBS1 التي لم يتم كشفها على أليل الأمهات على الرغم من تحليل RT-PCR وتسلسل الحمض النووي الكامل للتسلسل ترميز BBS1.
الرقم 3.

الحفاظ على تسلسل الأحماض الأمينية حول بقايا تتأثر بالتغيرات مغلطة جديدة في BBS1، BBS4، BBS6 وBBS7، التي تم تحديدها في هذه الدراسة. وقد تم مقارنة تسلسل من البروتينات BBS / أو المنتجات ترجمة توقع من العديد من الأنواع والانحياز. الأحماض الأمينية ذات الصلة هي في جريئة، وشددت عندما مختلفة من هومو الصورة. مرجع؛ يتم تمثيل الهويات الأخرى التي خلفية رمادية. بدائل التطورية في BBS1 (R K) وBBS7 (I V) محافظون. لاحظ التغير في تسلسل في الأنواع بعيدة حول موقف 237 في BBS6. ويظهر الانتقال 480G> A في النوكليوتيدات الأخيرة من exon5 في BBS1 على اليمين. ومن المتوقع أن تغيير موقع لصق المانحة من exon5.

الرقم الكامل وأسطورة (300 K)

الطفرات BBS2

وقد تم تحديد اثنين من الطفرات BBS2 وصف حديثا في نفس المريض (متغايرة المركبة) من عائلة I.8: 627delTT (L209fsX229) و402delT (P134fsX200). تم الكشف عن أية طفرات BBS2 أخرى للمرضى آخرين في هذه السلسلة.

الطفرات BBS4

تغيير L351R في اكسون 13 من BBS4، التي لم يبلغ عنها سابقا، وجد في حالة متخالف في الأسرة I.5 المنشأ السنتي الغجر. تؤثر هذه الطفرة بقايا الحفظ جدا أثناء التطور (الشكل 3)، ويتوقع أن تؤثر على بنية و / أو وظيفة البروتين بسبب استبدال حمض أميني اقطبي من الأحماض الأمينية موجبة الشحنة. على مقربة من كودون 351، وقد وصفت تعدد الأشكال I354T تكرارا أن يؤثر على موقف أقل الحفظ (الشكل 3). وقد ورثت طفرة L351R من الأب، وكان شقيقة تتأثر متخالف لهذه الطفرة. وأظهر تحليل الصغرية في موضع BBS4 أن sibs اثنين ورثت النمط الفرداني الأمهات مختلفة، بالاتفاق مع احتمال تحور BBS4 التي لم يتم كشفها في أليل الأمهات. وكان تحليل لطخة الجنوبي من الحمض النووي للمريض العادي باستثناء لإعادة ترتيب الأهمية على مستوى التسلسل الجيني لBBS4.
لالمستلفت الأسرة I.21، طفرة BBS4 رواية، 1450 + 2delTAGG، تم التعرف على حالة متخالف. ومن المتوقع هذه الطفرة لإلغاء الربط من اكسون 15 من BBS4.

الطفرات BBS6

وقد لوحظت الطفرات متخالف مجمع في BBS6 لالمستلفت (حالة متفرقة) من عائلة I.27 الجمع بين طفرة انزياح الإطار هو موضح سابقا وهي 429delCT433delAG (D143fsX157) وطفرة جديدة S479X. ومن المثير للاهتمام، هذه الطفرة 429delCT433delAG فقط تم ذكر سابقا في المرضى الذين يعانون نيوفاوندلاند في حالة متخالف أو متماثل. 18، 21
الثلاثة الأخرى الطفرات مغلطة BBS6 أو المتغيرات نادرة تم العثور عليها في حالة متخالف لثلاث عائلات إضافية.
تم العثور على مغلطة I339V في المريض الفرنسي متفرقة (الأسرة I.25). هذه الطفرة التي تؤدي إلى تغيير الأحماض الأمينية المحافظ ذكرت سابقا، ولكن pathogenecity لها على ما يبدو مشكوك فيه. 21 تم العثور على أليل واحد تحور في اكسون 3 في موقف 237 (T237P) في الجنين (الأسرة I.20) مع عرض الموجات فوق الصوتية قبل الولادة من المرض مع تشوهات في الكلى وpolydactyly خلف المحور. على الرغم من أن بقايا T237 لا الحفظ جدا أثناء التطور، ومن المرجح أن يكون لها تأثير ضار على الهيكل ثلاثي الأبعاد للبروتين BBS6 (استبدال البرولين الشكل 3). ومن المثير للاهتمام، وهذا الاختلاف هو مجاور للطفرة S236P ذكرت سابقا. 26، 27 لم يتم العثور على طفرة T237P في 48 الضوابط عرقيا يقابل (96 الكروموسومات) أو في 163 probands BBS تحليلها من قبل تسلسل إطار القراءة المفتوح من BBS6. 26
والمستلفت من I.17 الأسرة لديه طفرة T237A الموروثة من الأب ولم يتم تحديدها في السيب تتأثر الثاني. وأظهر تحليل الصغرية أن اثنين من sibs المتضررة تحمل مختلف النسخ المتنوعة الأمهات، باستثناء طفرة ثانية مماثلة في الجين BBS6. تحليل الصغرية في BBS1، كشف BBS2 وBBS4 مواضع أن اثنين من sibs المتضررة لم تشترك في نفس النسخ المتنوعة في كل من هذه الامكنه، باستثناء لهم كما الجينات المرشحة للطفرات biallelic. لم يتم العثور على طفرة T237A في 48 الضوابط عرقيا يقابل (96 الكروموسومات) أو في 163 probands BBS سبق تحليلها. 26

الطفرات BBS7

لBBS7، تم العثور على طفرة I66F واحدة لحالة متفرقة من عائلة I.12، الذي لم يكن لوحظ في 48 الضوابط عرقيا مطابقة أو في 84 مريضا تم تحليلها من قبل الآخرين. 19 ومن المرجح أن يغير من بنية البروتين وهذا التغيير يؤثر على بقايا الحفظ جدا، مثل يسوليوكيني أو حمض أميني أساسي، والأحماض الأمينية مسعور مشابهة جدا توجد في هذا الموقف من الثدييات إلى الخيطية C. ايليجانس (الشكل 3). تأثير هذا الاختلاف الأقرب إلى منطقة بيتا المروحة توقع يبقى، مع ذلك، إلى أن ثبت كما العزل لا يمكن اختبارها في هذه الحالة متفرقة.

الطفرات BBS8

تم الكشف عن أية طفرة لBBS8 لأي من 27 أسرة درس في هذه الوثيقة.

المتغيرات الصامتة يفترض أو الأشكال في جينات BBS

تم الكشف عن العديد من المتغيرات الصامتة يفترض في الإكسونات أو الإنترونات وتلخيصها في الجدول 2. هذه المتغيرات أو لا توقع الأشكال لإنشاء مواقع لصق جديدة، كما تم اختبارها باستخدام مواقع لصق يحرز البرامج.
الجدول 2 - الطفرات exonic صامت والاختلافات intronic لكل الجينات BBS في الأسر المعنية من الفوج.

الجدول الكامل

تم اختبار الطفرات الصامتة exonic والطفرات مغلطة التي كتبها محسن موقع لصق برامج التنبؤية. واحد منهم، المقابلة لتعدد الأشكال المعروفة في اكسون 3 من BBS2 (I123V)، وكان من المتوقع إلغاء موقعا محتملا محسن لصق. ومع ذلك، فإن الدراسات RNA وظيفية يكون ضروريا لاختبار النتائج الفعالة لهذا الاختلاف في RNA الربط. تحديد الأشكال متخالف في المرضى الذين يحملون طفرات متخالف سمح لنا لاستبعاد الحذف في المنطقة الجينومية المقابلة.

أعلى الصفحة نقاش

المرضى الذين يعانون من BBS الحالي مع جمعية فريدة من المظاهر السريرية وتكشف عن عدم التجانس الوراثي ملحوظا. في هذه الدراسة، أجرينا، على سلسلة من 27 أسرة، وفحص الطفرة المنهجي لستة جينات BBS، وهي: BBS1، BBS2، BBS4، BBS6، BBS7 وBBS8. نتائجنا تتفق مع الأدب ملحوظ للتردد تحور BBS1 والكشف المفرط للمرضى حيث تم الكشف عن أليل واحد تحور. على الرغم من عدم المريض في هذه السلسلة أثبتت فصل ثلاثة أليل متحولة، ونحن تقديم أدلة دامغة على وجود نمط digenic (diallelic أو triallelic) من الميراث.

BBS1 والطفرة M390R BBS1

تم الإبلاغ عن BBS1 أن يكون الجين المتحور أكثر في كثير من الأحيان في BBS. وذكر مساهمة واحدة على الأقل BBS1 أليل متحولة سابقا في 23.2٪ من المرضى. 27 هذا هو في تناقض واضح مع دراسات الربط تقدير مساهمة BBS1 مكان لتكون من 32-56٪ من الأسر BBS. 25 في هذه السلسلة، تأسست مساهمة الطفرات BBS1 عن 26٪ من الأسر.
وM390R الطفرة الكبرى (الموجود على اكسون 12 من BBS1) هو BBS1 الأكثر شيوعا تحور أليل لوحظ سابقا في 78-80٪ من الأسر التي لديها طفرات BBS1. 25، 27 وهنا، بالاتفاق مع التقارير السابقة، 5/6 (80٪ ) أسرة، مع الطفرات BBS1 تم العثور على لحمل طفرة M390R (أليلين متماثل كما وثلاثة كما الأليلات متخالف) الذي يمثل طفرة الأكثر شيوعا وجدت في هذه السلسلة من المرضى BBS. يعتبر طفرة M390R أن يكون طفرة القديمة على النحو الذي اقترحه تحليل النمط الفرداني وصفها حصرا في المرضى الذين يعانون من أصل أوروبي. 27 وكان المصدر الرئيسي للأسر التي لديها طفرة M390R الواقع الأوروبي وجميعهم من أصل فرنسي. في هذه الورقة، ونحن تصف ثلاث طفرات BBS1 جديدة وفقا لانخفاض تكرار العائلي أمور من الطفرات "غير M390R BBS1. وقد احدة طفرة BBS1 (E549X) وجدت هنا في عائلة فرنسية الموصوفة سابقا في المرضى الذين يعانون من أصل بويرتو ريكو-ويمكن أن تتوافق مع الحدث الساخنة متكرر. 25، 27

لا طفرة في BBS8

وقد تم تحديد BBS8 مساهمة كبيرة في فهم الآلية المرضية للمتلازمة. ومع ذلك، يمكن أن يتم الكشف عن أية طفرة في سلسلة لدينا. وقد تم تحديد الطفرات متماثل في BBS8 حتى الآن في عائلتين من المملكة العربية السعودية وعائلة باكستانية واحدة. 20

قلة من عائلات أخرى ثنائية أليلية

وقد تم تحديد اثنين فقط من أسر أخرى بشكل واضح مع اثنين من الأليلات تحور في نفس الجين (على التوالي لBBS2 وBBS6). كشفت عائلة واحدة مجمع تغاير لمدة الطفرات هراء في BBS2 (الشكل 1). ومن المثير للاهتمام، والمستلفت هو المريض من الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 20، الذين قدموا مع BBS المظاهر التقليدية (السمنة، في وقت مبكر بداية التهاب الشبكية الصباغي، والتخلف العقلي، وقصور الغدد التناسلية وpolydactyly). ومع ذلك، توفي البكر أخته، منذ أكثر من 25 عاما، في سن 3 أسابيع بسبب موه رحمي مهبلي واسع، مما يشير إلى تشخيص متلازمة مولودية Kusick-كوفمان (MKKS: OMIM 236700) (يمكن إجراء أي تحقيقات الجزيئية لDNA غير متاح). MKKS هو حالة نادرة (كما هو موضح في جمعية polydactyly خلف المحور، موه رحمي مهبلي وتشوه خلقي في القلب)، ذكرت حتى الآن أن يرتبط فقط مع الطفرات BBS6. 16، 22، 28
وأظهرت عائلة أخرى تغاير مركب لمدة اقتطاع الطفرات BBS6. طفرة 429delCT433delAG، وجدت هنا في أسرة فرنسية، إلا أنه قد تم ذكر سابقا في المرضى الذين يعانون نيوفاوندلاند، والتي اقترح لها تأثير مؤسس في هذه الفئة من السكان. المنطقة المعنية هي المتناوب A CT ترينيداد وتوباغو AG T مع احتمال حدوث الاقتران قاعدة القصيرة التي يمكن أن تؤدي إلى إعادة التركيب داخل الجين وحذف AT وAG dinucleotides دون التأثير على النوكليوتيدات TT. 18 هذا التحور يمكن أن تكون الطفرات المتكررة، موضحا من الممكن دي تكرار طفرة نوفو في عائلة فرنسية. المزيد من التحليل باستخدام مرتبطة BBS6 علامات متعددة الأشكال يمكن إنشاء أو استبعاد أحد مؤسسي مشترك محتمل بين الأسر نيوفاوندلاند ولعائلتنا.

متغايرة فائض كشف والميراث قليل الجينات

وعموما، تم العثور على سبعة من 14 عائلة مع طفرات للقيام أليل تحور واحد: ثلاث عائلات لBBS6، عائلتين لBBS4، عائلة واحدة لBBS1 وعائلة واحدة لBBS7. لكل منهما، تم الكشف عن أية طفرة أخرى عن طريق ترتيب تسلسل الترميز بأكمله بما في ذلك مواقع لصق من الجينات المقابلة، ولم يتم اكتشاف أي طفرة أخرى عن طريق فحص الجينات BBS أخرى. ومع ذلك، فإن الطفرة في تنظيم و / أو منطقة غير المكودة، أو الحذف كبير أو غيرها من إعادة ترتيب كبير لا يمكن دائما أن تستبعد من الأساليب المستخدمة في هذه الدراسة على الرغم من أننا القيام بها، عند الاقتضاء، تحليل RT-PCR، تحليل لطخة الجنوبي والصغرية تحديد المفردات. وأثارت هذه النتائج في مسألة تسببها طفرات واحدة: هما واضح (واحد اقتطاع طفرة في BBS1، طفرة لصق واحدة في BBS4)، وثلاثة هي محتملة للغاية (ثلاثة الطفرات مغلطة التي تؤثر على بقايا الحفظ جدا و / أو ينتج عنها غير محافظ الأحماض الأمينية التغيير: واحدة في BBS4، واحدة في BBS6 واحدة في BBS7) وهما المشكوك فيه (I339V وT237A في BBS6).
لهذه الطفرة الماضية، المستلفت الأسرة I.17 كشف طفرة T237A التي كانت، ومع ذلك، لم يتم تحديدها في السيب تتأثر الثاني، مستبعدا تسببها هذه الطفرة إذا اعتبرنا الإرث أحادي الجين الكلاسيكية. سيظل المفترضة الأليلات الأولى والثانية ليتم الكشف عن عائلة I.17. تماما أظهر تحليل الصغرية بالمعلومات أن اثنين من sibs المتضررة لم يحصلوا على نفس مجموعة من الصبغيات الأبوية في موضع BBS6. لم تحليل الطفرة لم تكشف عن أي طفرة في تسلسل الترميز ولصق تقاطع الجينات BBS أخرى اختبارها في هذه الوثيقة. وعلاوة على ذلك، وتحليل الصغرية في BBS1، BBS2 وBBS4 مواضع استبعاد لهم كما الجينات المرشحة للطفرات biallelic.
ومن المثير للاهتمام، فإن المريض يحمل طفرة T237A BBS6 قدم مع ميزات BBS نموذجية بالإضافة إلى نقص تنسج الخلقية من قوس الأبهر خلافا لالسيب المتضررين الآخرين الذين كشف ملامح BBS الكلاسيكية وقوس الأبهر العادي.
دراسات أخرى ومع ذلك، فقد أظهرت أن الأشقاء يمكن أن يكون مخالف للأليل الثالث تحت فرضية triallelic. على سبيل المثال، Badano وآخرون 7 وصف عائلتين مع الطفرات في BBS1 فيها بعض وليس كل sibs المتضررة تحمل طفرة ثالثة في أي BBS2 أو BBS6، الذي يبدو لتعديل النمط الظاهري. وفي الآونة الأخيرة، فان وآخرون 12 وصف تأثير التعديل بسبب طفرة مغلطة للBBS3 في واحدة شقيقة المتضررين من شقيقتين تحمل طفرة M390R في ولاية متماثل. وقد تم تحديد الطفرات واحدة متخالف في BBS5 في الأنساب القوقازية، مما يشير أيضا مشاركة هذا الجين في الميراث معقدة. 15
وقد اعترف كل من الميراث راثي متنحي (الميراث مكان واحد) والميراث قليل الجينات (الأليلات محددة في مكان واحد أو أكثر التي تؤثر على سمة وراثية) تحدث في BBS. وقد شكك جسمية التقليدي الميراث المتنحية كما Katsanis آخرون وصفت مؤخرا أنه بالنسبة لبعض الأسر BBS، ما مجموعه ثلاثة طفرات في اثنين من الجينات ضرورية للتعبير السريرية. 5، 8، 9، 25، 27
تم الإبلاغ عن BBS6، BBS2، BBS3، BBS5، BBS4، BBS1 وBBS7 أن تشارك في triallelism مع ميل للBBS6 وBBS2. 27 والأليلات الثالثة التي أعلن عنها في الأدب و، ومع ذلك، والطفرات في كثير من الأحيان مغلطة التي المرضية يمكن أن يكون في بعض الأحيان من الصعب التأكد.
في الواقع، في سلسلة من 96 الكروموسومات السيطرة، حددنا طفرة مغلطة، A242S، التي تم وصفها سابقا في أسرة بالتعاون مع طفرة BBS2 متماثل. 5، 26 تم العثور على هذه مغلطة أيضا مرة واحدة في 330 الكروموسومات السيطرة اختبارها. 26
في هذه السلسلة، لم نتمكن من تحديد الأشقاء تتأثر الأفراد المتضررين الذين يحملون طفرات اثنين في واحد BBS مكان. يمكن إثبات أي من 27 أسرة تحليلها هنا لمدة ستة جينات BBS عن تقديم الميراث قليل الجينات الكامنة وراء حقيقة أن هذا النمط من الميراث ليس هو القاعدة لBBS. ومع ذلك، لا يمكن استبعاد الميراث triallelic في سبع عائلات مع أليل تحور واحد المكتشفة في هذه السلسلة. وعلاوة على ذلك، لدينا فوج من 27 أسرة صغيرة بالمقارنة مع 259 أسرة من مختلف الأعراق درس حتى الآن من قبل الآخرين. 26 التعرف على الجينات BBS في عداد المفقودين، وتحليل الفصل في الأسر إضافية وتطوير الاختبارات الوظيفية للتأكد من تأثيرات التغيرات مغلطة ستكون ضرورية لتوضيح مسألة التردد في الميراث triallelic في BBS. البيانات المتوفرة لدينا هي paradoxal في الطريقة التي تزيد من الزيجوت هو موح من الميراث قليل الجينات في عدد ملحوظ من الأسر. ولكن، مع ذلك، في هذه السلسلة، وقد تم تحديد أي مريض triallelic واضح. مع الأخذ بعين الاعتبار أن نصف عائلاتنا لا تحمل طفرات في الجينات المعروفة BBS (باستثناء BBS5 وBBS3 حددت مؤخرا)، وأدلة دامغة لtriallelism، فإننا نقترح أن تظل مواضع BBS إضافي ا لكشف عن هويته.

 

[رافت ابراهيم]

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/17/13/1956.full

قبلت 18 مارس 2008.

القسم التالي

ملخص

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو عديد المظاهر، واضطراب غير المتجانسة وراثيا تتميز البدانة، اعتلال الشبكية، polydactyly وضعف الإدراك، الكلى والتشوهات القلبية، فضلا عن ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري. ومن المعروف أن الجينات متعددة لتسبب بشكل مستقل BBS. لا تظهر هذه الجينات إلى رمز لنفس الفئة الوظيفية للبروتينات. بعد، تحور كل النتائج في النمط الظاهري مماثلة. الجينات ضربة قاضية للجينات BBS المختلفة في الزرد تبين الظواهر المتداخلة لافت للنظر بما في ذلك النقل جسيم ميلانيني خلل واضطراب في الحويصلة المهدبة كوبفر. هنا، علينا أن نبرهن على ضربة قاضية الفردية bbs1 وbbs3 النتائج في نفس الظواهر نموذجية كما ذكرت سابقا للجينات BBS أخرى. نحن الاستفادة من نظام الزرد لتحديد ما إذا كانت شاملة في وقت واحد الزوج الحكيم ضربة قاضية للجينات BBS تكشف التفاعلات بين الجينات الوراثية BBS. باستخدام هذا النهج، علينا أن نظهر ثمانية التفاعلات الوراثية بين مجموعة فرعية من الجينات BBS. العلاقات التآزر بين مزيج متميز ليست بسبب التكرار وظيفية ولكن تشير تفاعلات معينة داخل مجمع BBS متعددة الوحيدات. بالإضافة إلى ذلك، نحن الاستفادة من النظام النموذجي الزرد للتحقيق في تنامي الأطراف. polydactyly البشري هو سمة أساسية من BBS لا يرد في نماذج BBS-الماوس. قمنا بتقييم الزرد زعنفة برعم الزخرفة و نظرن تغيير القنفذ الصوتي (SHH) التعبير وتغييرات لاحقة إلى fin عناصر الهيكل العظمي. تم استخدام برعم النمط الظاهري SHH زعنفة أيضا لتأكيد التفاعلات الجينية المحددة بين الجينات BBS. وتكشف هذه الدراسة شرط في الجسم الحي من أجل وظيفة BBS في برعم الطرف الزخرفة. نتائجنا توفر رؤى جديدة هامة في آلية والأهمية البيولوجية للBBS.

القسم السابق القسم التالي

مقدمة

متلازمة بارديه-بيدل (BBS، OMIM 209900) هي جسمية اضطراب المتنحية غير المتجانسة وراثيا تتميز السمنة، وتنكس الشبكية، polydactyly بعد المحوري، الادراكي، نقص الأعضاء التناسلية، وتشوهات الكلى والقلب والأوعية الدموية وارتفاع نسبة مرض السكري وارتفاع ضغط الدم (1 - 3). حتى الآن، تم تحديد 12 جينات BBS (4 - +15). وعلى الرغم من بعد إلى توضيح وظيفة محددة من البروتينات الفردية BBS، والأدوار دعم البيانات في وظيفة الأهداب والنقل داخل الخلايا.
من اجل الحصول على نظرة ثاقبة الفيزيولوجيا المرضية لBBS، وضعنا BBS نماذج الزرد وأثبتت أن ضربة قاضية لأي من سبعة orthologs الزرد BBS (bbs2، 4، 5، 6، 7، 8 و 11) النتائج في الظواهر المماثلة. وتشمل هذه الظواهر تعطل حويصلة المهدبة يسمى الحويصلة كوبفر (KV)، الاستعداد لعيوب تجانب الجهاز وتأخر نقل إلى الوراء بين الخلايا (16). تحور BBS1 في البشر يؤدي إلى الشكل الأكثر شيوعا من BBS. وظيفة BBS1 غير معروف. يحتوي هذا البروتين مجال بيتا المروحة، مشيرا إلى أنه يتفاعل مع البروتينات الأخرى. نحن في الآونة الأخيرة أنه BBS1، بالتزامن مع BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8 وBBS9، هو جزء من مجمع مستقرة متعددة البروتين المعروف باسم BBSome (17). BBS3، عاملا ADP-ribosylation (ARF) تشبه بروتين يعرف باسم ARL6 (18 تم التعرف)، عن طريق الاستنساخ الموضعية واستخدام علم الجينوم الحسابية (10). ويقترح البروتينات ARL أن يكون لها دور في حويصلة داخل الخلايا والاتجار الغشاء والتجمع أنيبيب (18، 19). باستخدام الزرد، ونحن اختبار ما إذا كان bbs1 وbbs3 الخسارة من وظيفة يلخص نموذجية BBS الظواهر ضربة قاضية بما في ذلك عيب KV وتأخير النقل داخل الخلايا. نحن أيضا تقييم التفاعل الوراثي الزوج الحكيم بين ثمانية جينات BBS الزرد (bbs1-bbs8). يسمح النظام النموذجي الزرد لفي وقت واحد الزوج الحكيم ضربة قاضية من مجموعات متعددة من الجينات BBS، بما في ذلك الجينات BBS هذا الرمز للبروتينات التي هي جزء من مجمع BBSome، وكذلك البروتينات التي ليست جزءا من المجمع. تركيبات الزوج الحكيم من أليغنوكليوتيد مكافحة الشعور تثبت ثمانية تفاعلات تعاونية هامة بين جينات معينة BBS. من المذكرة هو دور مركزي للbbs1 في خمس من هذه التفاعلات الوراثية. التفاعلات الوراثية في الجسم الحي المحددة في هذه الدراسة تكشف أن البروتينات BBS التي هي جزء من المجمع يمكن أن يؤدي إلى التفاعل الوراثي التآزر، والبروتينات يمكن أن ليست جزءا من مجمع BBSome.
polydactyly البشري هي واحدة من السمات الأساسية للBBS لا يرد في BBS نماذج الماوس خروج المغلوب (+20 - 23). وبالنظر إلى أن يتم التعبير عن العديد من الجينات BBS الزرد في مهدها زعنفة تطوير (16)، قمنا بتقييم زعنفة الزخرفة برعم في morphants BBS. ركزنا على منطقة النشاط الاستقطاب (ZPA) بسبب الدور الحاسم والحفظ تطويريا في الزخرفة في الطرف رباعي الأرجل / برعم الزعنفة. علينا أن نبرهن على ضربة قاضية الفردية الجينات BBS في الزرد، وكذلك الزوج الحكيم ضربة قاضية للجينات BBS، والنتائج في توسيع القنفذ الصوتي (SHH) التعبير، وهو مكون الجزيئي للZPA، وكذلك تغييرات على عناصر الهيكل العظمي لاحقة.

القسم السابق القسم التالي

النتائج

عرض الزرد bbs1 وbbs3 knockdowns BBS الظواهر نموذجية

في السابق، أثبتنا أن ضربة قاضية الفردية bbs2، bbs4 - bbs8 وbbs11 (9، 16) يولد الظواهر نموذجية في الزرد. من أجل تحديد ما إذا كان knockdowns من bbs1 وbbs3 تؤدي إلى الظواهر المماثلة، كنا morpholinos العقاقير لاسقاط هذه الجينات. وقد صممت oligonucleitides العقاقير morpholino (موس) لاستهداف bbs1 تقع على الصبغي 21 وbbs3 تقع على الصبغي 1 في الجينوم الزرد (معهد ويلكوم ترست سانجر، http://www.ensembl.org). المنظمات الأعضاء الموسومة فلوريسئين استهداف ميثيونين البادئ (أغسطس-MO) أو لصق موقع من exon2 تم microinjected (exon2-MO) في الأجنة. وقد وزعت على المنظمات الأعضاء بشكل موحد في 12-14 ساعة بعد الإخصاب (HPF) ولم الأجنة morphant لا تظهر أية تغييرات جسيمة في حجم الجسم العام ومورفولوجية مقارنة مع الضوابط. Bbs1 وقيمت morphants bbs3 المقبل لإجراء تعديلات نموذجية بما في ذلك الحد أو فقدان حويصلة مهدبة، والمعروفة باسم حويصلة كوبفر (KV)، الاستعداد لعيوب تجانب والتأخير في النقل جسيم ميلانيني الوراء (9، 16). الأسلاف KV تنشأ في خط الوسط الظهرية وتشكل حويصلة المهدبة في منطقة الذيل برعم خلال مراحل الجسيدة (+24 - +30). في البرية من نوع ومراقبة الأجنة المحقونة MO في مرحلة 10-13 الجسيدة، وKV على شكل دائرة يبلغ متوسط ​​حجم 50 ميكرون (الشكل 1 A و B). وقد لوحظت عيوب KV (خفض حجم ثلث أقل من المعتاد أو الكلي من غياب KV) بطريقة تعتمد على الجرعة في bbs1 MO وbbs3 حقن MO الأجنة (الشكل 1، الجدول 1). وتمشيا مع وظيفة المقترحة للKV في اليسار واليمين التماثل محور (+24 - +30)، وأظهرت ضربة قاضية الزرد من bbs3 العيوب تجانب الجهاز تظهر الأجنة Bbs3 MO حقن التعديلات الركض هامة في 22-24 HPF (عكس أو لا هرول) و. حلقات العيوب في 36 HPF (31)، في حين أن جرعة منخفضة من bbs3 MO أو مراقبة الأجنة المحقونة MO لا تظهر KV كبير أو التعديلات تجانب (الشكل 1 E، الجدول 1).

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الشكل 1.

bbs3 ضربة قاضية الظواهر في الزرد. (A - C) صور الأجنة الزرد حية في مرحلة 10-13 الجسيدة. (A) KV (مربع متقطع) هو حويصلة مهدبة تقع في منطقة الذيل برعم في البرية من نوع الجنين. (B) التكبير العالي للسيطرة KV (رأس السهم). (C) bbs3 حقن MO الجنين مع انخفاض KV (رأس السهم). التكبير: (A) 5 ×؛ (B و C) 10 ×. (D) نسبة العيوب KV الزرد (انخفاض أو غائبة) ولدت في MO ومجموعات التحكم. (E) نسبة العيوب تجانب القلب لوحظ في morphants bbs3 والضوابط. (F - H) التي يسببها ادرينالين جسيم ميلانيني النقل إلى الوراء، نظرا الأمامي الظهري من اليرقات البالغة من العمر 5 أيام. (F) من النوع البري اليرقات قبل العلاج ادرينالين و (G) عند نقطة 1.5 دقيقة بعد العلاج الادرينالين. (H) bbs3 morphant اليرقات يبدون استجابة تأخير بعد 3.0 دقيقة من العلاج الادرينالين. (I) التمثيل البياني للجسيم ميلانيني إلى الوراء مرة النقل التي يسببها الأدرينالين مما يدل على تأخير تعتمد على الجرعة في bbs3 ضربة قاضية بالمقارنة مع من النوع البري والأجنة حقن السيطرة. وأشارت العلاج وحجم العينة على X -axis وأشارت نسبة في الجزء العلوي من العارضة. * P <0.001.

عرض هذا الجدول:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

الجدول 1.

وتشمل bbs1 وbbs3 ضربة قاضية الظواهر تعطيل تشكيل KV، عيوب تجانب القلب (الركض وحلقات) وتأخير كبير في جسيم ميلانيني النقل إلى الوراء

أثبتنا سابقا تورط ظيفة BBS في مجال النقل داخل الخلايا العام. وأسفرت - (bbs8 وbbs11 bbs2، bbs4) في تأخير ذات دلالة إحصائية في النقل إلى الوراء (ضربة قاضية للجينات BBS الزرد 9، 16). مكوك الزرد الأجسام الصباغية داخل melanophores ردا على الإشارات البصرية والمحفزات الهرمونية (32 - 35). في الزرد تكييفها الظلام، وفرقوا الأجسام الصباغية (الشكل 1 F). جسيم ميلانيني التجميع (إلى الوراء النقل) يتم تحفيز على العلاج مع ادرينالين (الشكل 1 G) (16، 36). من النوع البري والأجنة حقن السيطرة تتراجع بسرعة الأجسام الصباغية (الشكل 1 الأول؛ الجدول 1). في المقابل، وجرعة عالية من bbs3 الأجنة المحقونة MO تأخر كثيرا جسيم ميلانيني التراجع (الشكل 1 H) (P <0.001)، في حين تظهر جرعة منخفضة من bbs3 الأجنة المحقونة MO معدل مماثل لأجنة التحكم (P> 0.05) ( الجدول 1). لوحظ نتائج مماثلة مع الأجنة المحقونة MO bbs1. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن الزرد bbs1 وbbs3 knockdowns تؤدي إلى الظواهر نموذجية مماثلة لغيرها من knockdowns BBS الجينات، بما في ذلك العيوب KV، الاستعداد لعيوب تجانب وإلى الوراء تأخير النقل داخل الخلايا.

التفاعل الجيني بين orthologs BBS الزرد

تحور أي من تحديد 12 جينات BBS الإنسان تسبب الظواهر المماثلة، بعد تحليل التنبؤ مجال البروتين تشير إلى أن البروتينات BBS لا تنتمي إلى أي فئة وظيفية واحدة (المواد التكميلية، الشكل S1). وقد اقترح أن التباين المظهري بين المرضى BBS ربما يعود إلى التفاعلات بين الجينات الوراثية BBS (37). لذا نحن اختبار الزوج الحكيم ضربة قاضية من bbs1-bbs8 في الزرد لتقييم التآزر بين هذه الجينات في الجسم الحي. حددنا أول جرعة subphenotypic لكل الثمانية BBS المنظمات الأعضاء. تم تحديد جرعة subphenotypic بوصفها أعلى جرعة MO الذي لا ينتج النمط الظاهري كبير عندما تم حقنها بشكل فردي في الأجنة الزرد (المشار إليها باسم '-'، الشكل 2 A؛ الجدول 2). نحن المقبل شارك حقن 28 مجموعات الزوج الحكيم المحتملة لجرعة subphenotypic-bbs1 bbs8 المنظمات الأعضاء. واعتبرت تفاعلات كبيرة (المشار إليها باسم '+'، الشكل 2 أ) إذا لوحظت في تغيير دلالة إحصائية في العيوب KV وزيادة جسيم ميلانيني النقل إلى الوراء بالمقارنة مع العلاج مع انخفاض جرعة واحدة MO. ثمانية من 28 حقن الزوج الحكيم الممكنة أدى إلى تفاعلات تعاونية. كل هذه التفاعلات المعنية إما bbs1 أو bbs2 كأحد مكونات التفاعل. حددنا خمسة bbs1 التفاعل المتآزرة (مع bbs2، bbs3، bbs4، bbs6 وbbs7 موس) وأربعة bbs2 التفاعل المتآزرة (مع bbs1، bbs3، bbs4 وbbs6 موس). Bbs3، bbs4 وbbs6 تفاعلت مع كل bbs1 وbbs2. تفاعلت Bbs7 فقط مع bbs1. أظهر Bbs5 وbbs8 لا التفاعلات الجينية مع أي الجينات BBS الآخرين. تركيبات التآزر ثمانية، وbbs1 مع مزيج bbs7 الزوج الحكيم أظهر الخلل KV أشد (الشكل 2 B) وتأخير النقل إلى الوراء (الشكل 2 C؛ الجدول 2). سبع مجموعات تعاونية أخرى، من أجل زيادة شدة،are bbs2 with bbs4 , bbs2 with bbs3 , bbs1 with bbs2 , bbs1 with bbs4 , bbs1 with bbs6 , bbs1 with bbs3 and bbs2 with bbs6 (Table 2 ). لتأكيد التفاعل المتآزرة، ونحن أجنة مع مجموعات الزوج الحكيم من جرعة عالية من bbs1 MO مع bbs7 MO شارك حقن. نحن أيضا تقييم جرعة عالية من مزيج من bbs3 MO مع bbs7 MO، وزوج غير متناغم. وجنبا إلى جنب جرعة عالية من bbs1 MO مع bbs7 MO إنشاء عيوب مثيرة، في حين أن جرعة عالية من الزوج الحكيم مزيج من bbs3 MO مع bbs7 MO أسفرت عن الظواهر مماثلة لتلك التي تم إنشاؤها بواسطة bbs3 MO جرعة عالية من حقن وحده، وbbs7 حقن جرعة عالية وحده (الشكل 3 أ و ب). توفر البيانات التآزر في أدلة الجسم الحي للتفاعل بين الجينات الوراثية المحددة BBS. هذه التفاعلات الوراثية يمكن أن تشير إلى التكرار وظيفية بين التفاعل الجينات و / أو رياضيات الكيمياء المطلوبة ضمن مجمع مهمة لوظيفة المناسبة من المجمع.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 2.

التفاعل الجيني بين ثمانية جينات BBS (bbs1 - bbs8). (A) ثمانية وعشرون تركيبات الزوج الحكيم subphenotypic من BBS MO أظهرت ثمانية فقط تفاعلات تعاونية، كما لاحظ علامة "+". التفاعلات الوراثية تؤدي إلى (B) اضطراب KV و (C) التي يسببها ادرينالين جسيم ميلانيني تأخير النقل إلى الوراء بالمقارنة مع الرقابة والأجنة جرعة منخفضة من BBS MO حقن. RNA محددة يمكن انقاذ تعطيل KV وجسيم ميلانيني تأخير النقل إلى الوراء. أضيفت مراقبة المنظمات الأعضاء عند الضرورة للحفاظ على التركيز النهائي موحد للMO في مزيج الحقن. * P <0.001؛ تابع والسيطرة.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 3.

جرعة متوسطة ضربة قاضية للوراثيا التفاعل BBS الجينات النتائج في زيادة شدة وانتفاذ من BBS الظواهر ضربة قاضية، بما في ذلك (A) اضطراب KV و (B) التي يسببها ادرينالين جسيم ميلانيني النقل إلى الوراء بالمقارنة مع من النوع البري، ضخت السيطرة والأجنة حقن مع مجموعات MO من BBS الجينات التي لا تتفاعل وراثيا. وأشارت العلاج وعدد الأجنة على المحور س والقيم على الجزء العلوي من القضبان. * P <0.001؛ تابع والسيطرة.

عرض هذا الجدول:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

الجدول 2.

ملخص التفاعل الوراثي تقييمها من قبل BBS ضربة قاضية الجينات

خصوصية BBS ضربة قاضية

تم إجراء الانقاذ من الظواهر الناتجة MO-لتأكيد خصوصية ضربة قاضية الجينات. ركزنا هذا الجزء من الدراسة على bbs1 وbbs7 لسببين. أولا، لوحظ والجمع الأكثر أهمية التفاعل الجيني مع bbs1 وbbs7. ثانيا، تظهر bbs1 وbbs7 البروتينات تناظر كبير مع بعضها البعض. شارك في حقن في المختبر -transcribed bbs1 RNA مع جرعة عالية من bbs1 MO، وكذلك شارك في حقن bbs7 RNA مع جرعة عالية من bbs7 MO، النتائج في إنقاذ كل من KV والظواهر النقل إلى الوراء (الشكل 2 B و C ؛ الجدول 3). وهكذا، والإنقاذ RNA يدعم خصوصية bbs1 وbbs7 الظواهر التي يسببها MO. للتحقيق في ما إذا كان هو التفاعل بين الجينات الوراثية BBS يرجع إلى التكرار وظيفية، شاركنا في حقن جرعة عالية من bbs7 MO مع bbs1 RNA. لا يمكن انقاذ النمط الظاهري جرعة عالية من bbs7 يسببها MO مع bbs1 RNA. وبالمثل، جرعة عالية من bbs1 MO وجرعة عالية من الظواهر bbs3 MO لا يمكن انقاذ مع bbs7 RNA (الشكل 3 أ و ب). وتوفر هذه البيانات الإنقاذ RNA والجمع بين الزوج الحكيم في دليل فيفو للتفاعلات جينية محددة بين الجينات BBS وتشير إلى أن هذه التفاعلات الوراثية ليست بسبب التكرار وظيفية. في المقابل، إلى جرعة عالية من حقن MO التي تؤدي إلى الظواهر، وجرعة منخفضة من الحقن MO الفردية BBS المنظمات الأعضاء لا تولد الظواهر، ما لم يكن جنبا إلى جنب مع ثاني جرعة منخفضة محددة BBS MO. وعلاوة على ذلك، تم تقييم الإنقاذ RNA التفاعلات التآزر. وتم انقاذ الظواهر الناتجة عن الجمع بين حقن جرعة منخفضة من bbs1 MO مع bbs7 MO مع RNA bbs7 وحدها، وكذلك مع bbs1 RNA وحدها (الجدول 3). قدرة RNA bbs1 أو bbs7 RNA لانقاذ جرعة منخفضة جنبا إلى جنب ضربة قاضية إلى أن ضربة قاضية الجزئية إما bbs1 أو bbs7 وحده لا يؤدي إلى فقدان كامل للوظيفة مجمع BBSome.

عرض هذا الجدول:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

الجدول 3.

BBS الجينات ضربة قاضية الإنقاذ واختبار وظيفة زائدة

الزخرفة تغيير في مهدها الزعنفة الصدرية الزرد

منذ polydactyly هي واحدة من السمات الأساسية للBBS البشري، وبحثنا إمكانية العيوب الزخرفة برعم الزعنفة في morphants BBS. في الواقع، يتم التعبير عن الجينات BBS على نطاق واسع، ولكن بنسبة 36 HPF bbs7 يظهر تخصيب الأمامي، مع التعبير ملحوظ في برعم الزعنفة النامية (16). في morphants BBS، كان حجم الزعانف عموما يمكن تمييزه من النوع البري، مما يشير إلى نمو زعانف عادية نسبيا وقدرتها على البقاء. وقد تطورت الزعانف الصدرية الزرد والأمامية رباعي الأرجل من أطرافهم الأجداد المشترك وتبادل التشكل مماثلة والآليات الجزيئية الكامنة مماثلة (+38 - 43)، بما في ذلك ZPA (44، 45) والتي يتم ترجمتها في اللحمة المتوسطة الخلفي من برعم الزعنفة / أطرافهم ( الشكل 4 A). ويشير ZPA المعلومات الموضعية هامة للمواصفات وأرقام. في الفرخ برعم الطرف، تطعيم لZPA الأمامي إضافي للZPA الأصلي أسفرت عن تشكيل ارقام اضافية تشبه polydactyly البشري (44). وأعرب عن القنفذ الصوتي (Shh على) في الخلفية الفقارية برعم الطرف اللحمة المتوسطة ويتوسط وظائف ZPA، بطريقة تعتمد على التركيز في كل براعم الزعنفة الزرد وبراعم الأطراف رباعي الأرجل (46). منذ زيادة ZPA وظيفة أو SHH النشاط قد يؤدي إلى polydactyly، قمنا بتقييم SHH التعبير. في البرية من نوع الأجنة، وأعرب عن الصورة صاحب السمو في مجال على شكل هلال في المنطقة الخلفية لبرعم الزعنفة الصدرية (الشكل 4 B). هذا مجال التعبير دون تغيير في السيطرة وجرعة منخفضة من الأجنة MO حقن (bbs1، bbs3 وbbs7). والزعنفة الصدرية SHH مجال التعبير في جرعة عالية من bbs1 أو bbs7 morphants يدل على التوسع الأمامي، في حين أن التعبير SHH في خط الوسط ظهري لم يتغير (الشكل 4 C). وتمشيا مع التفاعلات الوراثية التي سبق تحديدها، الزوج الحكيم مزيج من جرعة منخفضة من MO من bbs1 مع bbs7 أيضا أثبتت موسعة التعبير SHH (الشكل 4 D)، في حين أن الزوج الحكيم مزيج من جرعة منخفضة من MO من bbs3 مع bbs7 يظهر نفسه كما البرية من نوع (لا تظهر البيانات). تم قياس متوسط ​​مساحة التعبير SHH في مهدها الزعنفة الصدرية باستخدام برنامج يماغيج (47)، وأكد ذات دلالة إحصائية (P <0.001) يزيد في جرعة عالية من bbs1 MO، جرعة عالية من bbs7 MO وbbs1 مع bbs7 مزيج جرعة منخفضة في مقارنة مع البرية من نوع الأجنة (الشكل 4 E). وهكذا، في برعم الزعنفة النامية، نلاحظ زيادة نطاق ZPA / SHH دون تكدير أطرافهم / نمو زعانف العام.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 4.

منطقة النشاط الاستقطاب (ZPA) من برعم الزعنفة الصدرية والقنفذ الصوتي (SHH). (A) تمثيل تخطيطي من برعم الزعنفة الزرد قبل 48 HPF ZPA المترجمة الخلف، ويمكن أن يكون المسمى مع التعبير SHH. جبل بأكمله التهجين الموضعي باستخدام SHH باعتباره التحقيق في مهدها الزعنفة الصدرية من 42 HPF (B) من النوع البري، (C) morphant bbs7 و (D) جرعة منخفضة من bbs1 MO مع مزيج bbs7 MO. رأس السهم يدل SHH التعبير في برعم الطرف على جانب واحد، ويرد مجال التعبير على الجانب الآخر. (E) التمثيل البياني للمنطقة قياس (ميكرون 2) المجال التعبير SHH في مهدها الزعنفة الصدرية من morphants BBS والنوع البري. * P <0.001.

منذ طفرات وراثية لSHH تظهر خسارة أو الحد من عناصر الهيكل العظمي من الزعانف الصدرية (46)، ونحن مصممون المقبل ما إذا كان -signaling SHH توسعت في مهدها زعنفة من morphants BBS يدفع توسيع الصدرية الهياكل الزعانف. في الزعنفة الصدرية من اليرقات البالغة من العمر 6-7 يوما، العنصر الهيكل العظمي أكثر الداني هو cleithrum (الكلور)، الذي يمتد dorsoventrally (الشكل 5 A). المرافقة الكلورين هو كتفي غرابي (SC)، الذي يمتد على طول قاعدة الزعنفة، والعنصر الأكثر القاصي هي الزعنفة. تلطيخ الأزرق الألسيان في البرية من نوع يحدد مثل قضيب الكلورين (الشكل 5 B، السهم) والشوري المجاور (الشكل 5 B، رأس السهم). BBS الأجنة morphant إثبات وجود الشوري الموسع (الشكل 5 C، رأس السهم)، حيث تظهر نهاية الخلفي البعيدة للالشوري لطبقات الخلايا غير منظمة و / أو إضافية مقارنة مع من النوع البري (الشكل 5 B). بما يتفق مع البيانات الجينية التفاعل، bbs1 مع bbs3 وbbs1 مع مجموعات جرعة bbs7 subphenotypic تظهر أيضا سميكة الشوري (الشكل 5 D، رأس السهم)، في حين bbs3 مع bbs7، التي لا يوجد لها تأثير متناغم على KV أو النقل إلى الوراء، يوضح هيكل برأسية مماثلة إلى البرية من نوع (لا تظهر البيانات). وهكذا، خطر ظيفة BBS التي كتبها النتائج حقن MO في توسيع التعبير SHH والزخرفة في وقت لاحق تغييرات في عناصر الهيكل العظمي للزعنفة الصدرية. وعلى الرغم من الزرد لا تشكل الأرقام، فإن هذه النتائج تشير إلى أن العيوب أطرافهم الزخرفة لوحظت في مرضى BBS ناتجة عن تشوهات SHH التعبير.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 5.

الصدرية الزرد زعنفة الغضروف تلطيخ. (A) التمثيل التخطيطي للهياكل زعنفة: الكلورين كخط ظهري بطني (السهم). الشوري البعيدة لالكلورين والأقرب إلى زعنفة. (B - D) الألسيان الأزرق تلطيخ الزعنفة الصدرية يوضح هيكل نموذج أولي للغضروف في العمر 6 ايام (B) من النوع البري اليرقات، في حين أن (C) يرقات bbs7 morphant و (D) جرعة منخفضة من الجمع بين bbs1 MO مع bbs7 MO تظهر بنية الشوري الموسع مع 2-3 خطوط الخلايا في المنطقة الخلفية القريبة من الشوري (رأس السهم).

القسم السابق القسم التالي

نقاش

وقد ثبت اثني عشر الجينات تسبب بشكل مستقل BBS في البشر. عرض المرضى BBS البشري ميزات مشابهة مستقلة عن تحور الجين الأساسي. لقد أظهرنا في وقت سابق ان ضربة قاضية الفردية من عدة جينات BBS الزرد (bbs2، bbs4-bbs8 وbbs11) النتائج في الظواهر الزرد المشتركة بما في ذلك تشكيل KV غير طبيعي، تشوهات أهداب وجسيم ميلانيني عيوب النقل (9، 16). في هذه الدراسة، علينا أن نظهر أن الخسارة من وظيفة الفردية bbs1 أو bbs3 في النتائج الزرد في نفس الظواهر كما ضربة قاضية أخرى الجينات BBS الزرد. بالإضافة إلى ذلك، فقد استخدمنا الآن في النظام النموذجي الزرد لتحديد التفاعلات بين الجينات الوراثية BBS عن طريق ضرب في وقت واحد أسفل تركيبات الزوج الحكيم من الجينات. لهذا التحليل في الجسم الحي من التفاعلات الوراثية، تم اختبار 28 مجموعات الزوج الحكيم الممكنة من الجينات BBS (bbs1-bbs8) في الجرعات التي لا تنتج النمط الظاهري عندما يتم استخدام morpholino الفردية (جرعة subphenotypic). في جرعات subphenotypic المستخدمة في هذه الدراسة، تم تحديد ثمانية الزوج الحكيم تفاعلات تعاونية. قبل هذه الدراسة، تم إنشاء أي نموذج حيواني لBBS polydactyly. باستخدام نظام نموذجي الزرد، حددنا الزخرفة غيرت من المهد الزعانف وتغييرات لاحقة لعناصر الهيكل العظمي الزعانف. منذ برعم الزعنفة الزرد هو orthologous لبرعم الطرف البشري، وتشير هذه الدراسة وجود صلة بين polydactyly بعد المحوري لوحظت في مرضى BBS وغيرت التعبير SHH في تطوير أطرافهم / برعم الزعنفة.
وظيفة BBS3 المطلوبة من أجل وظيفة الأهداب والنقل حويصلي داخل الخلايا

BBS3 (ARL6) هو ARF مثل البروتين (10). تدعم البيانات الأدوار الوظيفية المختلفة للبروتينات ARL، بما في ذلك تنظيم حويصلة داخل الخلايا والاتجار الغشاء والتجمع أنيبيب (18، 19). يوضح لنا فقدان البيانات من وظيفة أن النتائج bbs3 في نفس الظواهر الزرد كما knockdowns BBS الأخرى، بما في ذلك العيوب KV والخلايا تأخير النقل إلى الوراء. العثور على أهداب في KV يبدو أن تشكلت في البداية في bbs3 ضربة قاضية الزرد، ولكن يتم فقدان أهداب قبل الأوان، ولا تعمل في تشكيل KV العادي. وقد تم مؤخرا تبين أن سبعة البروتينات BBS (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8 و 9) شكل مجمع المعروفة باسم BBSome (17). وBBSome يبدو أن تلعب دورا في تكون الأهداب، على الأقل جزئيا، من خلال التفاعل مع / الناتج المحلي الإجمالي عامل الصرف Rab8 GTP (Rabin8). Rab8GTP يدخل أهداب الابتدائي ويعزز تمديد الغشاء الهدبي. منع Rab8GTP إنتاج كتل ciliation وعوائد الظواهر BBS مميزة في الزرد (17). وإن لم يكن جزءا من BBSome، والبيانات المقدمة هنا مما يدل على أن bbs3 ضربة قاضية النتائج في عيوب في KV وأهداب العقدي، وكذلك في جسيم ميلانيني (يحلول عضيات ذات الصلة) النقل، ودعم دور للBBS3 والبروتينات BBS أخرى في مجال النقل الحويصلي ل وهدب (9، 16).

التفاعل بين الجينات الوراثية BBS

تظهر المرضى BBS الإنسان مجموعة واسعة من التباين المظهري. ويعتبر الاختلاف بين المرضى حتى ضمن العائلة الواحدة (وبالتالي مع نفس الطفرات BBS الأولية)، مشيرا إلى المعدلات الوراثية و / أو البيئة من النمط الظاهري. التباين المظهري والتباين الوراثي واسعة من BBS يرفع احتمال وجود تفاعلات معقدة بين الجينات BBS (37). في هذه الدراسة، حددنا ثمانية التفاعلات الوراثية من مجموع 28 التفاعلات الوراثية الزوج الحكيم الممكنة اختبارها. وتجدر الإشارة، كل واحد من ثمانية التفاعل المتآزرة أسفرت عن عيوب KV وتأخر نقل جسيم ميلانيني. لم يلاحظ أي تفاعلات تعاونية التي أثرت فقط مجموعة فرعية من الظواهر. في كل حالة، وزيادة الجرعة كل من morpholinos فوق جرعة subphenotypic أدى إلى زيادة شدة الظواهر ضربة قاضية BBS أبعد من ذلك لوحظ لالفردية ضربة قاضية جرعة عالية، ودعم الفرضية القائلة بأن الجينات BBS يمكن تعديل الظواهر بعضها البعض.
BBS التفاعلات المعقدة يمكن أن يعزى إلى أدوار زائدة عن الحاجة، وظيفة مسار مواز أو شرط stoichometric داخل مجمع البروتين مثل BBSome، على سبيل المثال عدد قليل من الاحتمالات. في هذه الدراسة، أثبتنا أن جرعة عالية من العيوب التي يسببها MO الفردية يمكن انقاذ من قبل المشارك حقن شكل من النوع البري من مرنا الجينات المحددة (أي bbs7 مرنا ينقذ جرعة عالية من bbs7 MO النمط الظاهري)، ولكن ليس عن طريق زيادة مستويات البروتينات BBS أخرى. على سبيل المثال، bbs1 مرنا لا إنقاذ جرعة عالية من العيوب التي يسببها MO-bbs7 والعكس بالعكس، يجادل ضد التكرار وظيفية. في المقابل، مرنا الفردية كافية لانقاذ subphenotypic المنظمات الأعضاء ضربة قاضية مجتمعة (أي bbs7 مرنا يمكن إنقاذ جرعة منخفضة من bbs7 جنبا إلى جنب مع bbs1 العيوب التي يسببها MO)، مما يشير إلى رياضيات الكيمياء المطلوبة داخل المجمع. دراسة حديثة أجرتها Nachury وآخرون. (17) وقد حددت BBS معقدة (وBBSome) وذكرت أن عناصر من مجمع موجودة بكميات متكافئة.
التعرف على مجمع BBSome تتألف من سبعة من 12 البروتينات المعروفة BBS (BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8 وBBS9) (17) يمكن استخدامها لتصنيف البروتينات BBS تعرف إلى تلك التي هي جزء من BBSome وتلك التي ليست جزءا من هذا المجمع (BBS3، BBS6، BBS10، BBS11 وBBS12). هذه المعلومات، جنبا إلى جنب مع البيانات التفاعل الوراثي من الدراسة الحالية، يسمح تحديد ما إذا كان BBS الزوج الحكيم التفاعلات الوراثية تنتج عن انخفاض قيمة اثنين من البروتينات BBSome، وضعف مكون من BBSome وعنصر عدم BBSome و / أو في وقت واحد انخفاض قيمة اثنين من البروتينات غير BBSome. وقد لوحظت أنواع الأولين من التفاعلات. على سبيل المثال، كان ينظر إلى أقوى التفاعل بين عنصرين BBSome (BBS1 وBBS7). بالإضافة إلى ذلك، اثنين من البروتينات غير BBSome التي درست (BBS3 وBBS6) عرضت كل من التفاعل وراثيا مع مكونات محددة من BBSome (BBS3 مع BBS1 وBBS2؛ BBS6 مع BBS1 وBBS2)، ولكن ليس مع مكونات BBSome الأخرى وليس مع بعضها البعض. وعلاوة على ذلك، والتفاعلات المادية المباشرة داخل المجمع BBSome لا يتوقع التفاعلات الوراثية. على سبيل المثال، BBS7 يتفاعل جسديا مباشرة مع BBS2 وليس مع BBS1 (17). ومع ذلك، BBS7 يتفاعل وراثيا مع BBS1، ولكن ليس مع BBS2.
على أساس من العثور على البديل متخالف في MGC1203 في عدد قليل من المرضى BBS، Badano وآخرون. (48) تستخدم الزرد لتقييم تأثير روكبي من mgc1203 على الجينات BBS وذكرت أن قمع متواضع من mgc1203 يمارس تأثير روكبي على النمط الظاهري التنموي للmorphants BBS. وبالمثل، knockdowns subphenotypic لدينا جينات معينة BBS الزرد إلى أن بعض الجينات BBS لها تأثير روكبي على النمط الظاهري من الجينات BBS أخرى. ومن الجدير بالذكر أن اثنين من الدراسات المستقلة استخدمت نهج subphenotypic مماثل في الزرد لتقييم التفاعلات الوراثية للbbs10 وbbs12 الجينات (12، 15). وتجدر الإشارة إلى أن واضعي ذكرت العيوب تكون المعيدة باعتباره النمط الظاهري BBS MO التي يسببها (12، 15، 48) وتستخدم هذه النمط الظاهري لتحديد التفاعلات المحتملة بين الجينات BBS. الأجنة morphant في دراستنا لا تظهر أية تغييرات جسيمة في حجم الجسم العام والتشكل. الظواهر عيب أهداب وتأخير النقل لوحظ في الدراسة الحالية هي ذات الصلة بيولوجيا إلى اضطراب البشري.
ذات أهمية سريرية، وتوفير البيانات لدينا نظرة ثاقبة وسائط غير المندلية من BBS الميراث. تم الإبلاغ عن الميراث Triallelic في مجموعة فرعية صغيرة من الحالات BBS (49 - 54). وتشير البيانات المتوفرة لدينا الزرد أن جرعة عالية من ضربة قاضية الفردية BBS الجينات النتائج في أهداب KV والظواهر النقل حويصلة (9، 16). هذه البيانات بيانات دعم الماوس خروج المغلوب أن خسارة كاملة للوظيفة البروتين BBS واحدة كافية للحث على الظواهر BBS (20 - +22). البيانات التفاعل الوراثية المقدمة هنا تشير إلى أن الأليلات hypomorphic وظيفيا من اثنين من البروتينات المحددة BBS يمكن أن تتضافر لتؤدي في الميراث digenic من BBS. على أساس البيانات الزرد يدل الظواهر ذات الصلة الناجمة عن ضربة قاضية في وقت واحد من اثنين من الجينات BBS، فمن المغري أن نفترض أن تغاير في اثنين من الجينات BBS (تغاير مزدوج) يمكن أن تكون كافية لإظهار بعض الظواهر BBS. لم يتم الإبلاغ عن حدوث ذلك. سوف توفر عدة نماذج الماوس BBS تسهيل اختبار هذه الفرضية.

ارتباط بين SSH والعيوب أطرافهم BBS

وقد تم ربط BBS الفيزيولوجيا المرضية لعيوب في وظيفة الأهداب والنقل داخل الخلايا. ومع ذلك، فإن لم يبلغ عنها polydactyly باستمرار في الأمراض الهدبية (+55 - 58). لذلك، وصلات الآلية بين وظيفة الأهداب وpolydactyly لا تزال غير واضحة. منذ الزرد الاقتران الزعانف والأطراف رباعي الأرجل ترتبط phylogenetically، شكليا مماثلة (42، 43، 59) وعرض مماثلة أنماط التعبير الجيني في تطوير أطرافهم / براعم الزعانف، يمكننا استخدام هذا النظام لتحليل الآليات الجزيئية التي تكمن وراء تطورها المبكرة (+38 - 43). BBS الخسارة من وظيفة يدل على توسيع SHH التعبير في مهدها الزعنفة الصدرية دون أن يؤثر ذلك SHH العصبي أنبوب التعبير. وعلاوة على ذلك، هناك حاجة SHH للتنمية داخل الهيكل زعنفة / أطرافه (43)، وأظهر متحولة الزرد SHH (سيو) فقدان الصدرية حزام عناصر الهيكل العظمي (46، 60)، في حين أن التعبير خارج الرحم من Shh على الدجاج في الثقافة برعم الطرف MICROMASS يسببها الغضاريف رواية عقيدات (61). تحليل للعناصر الهيكلية في BBS اليرقات ضربة قاضية كشف كتفي غرابي سميكة من الزعنفة الصدرية بما يتفق مع زيادة التعبير SHH في مهدها الزعنفة الصدرية. على الرغم من أن تم الإبلاغ عن وظيفة الأهداب وIFT للعب دور في SHH الإشارات (56، 62، 63)، وتستخدم الدراسة الحالية لدينا SHH كعلامات لZPA. بالإضافة إلى ذلك، SHH التعبير في خط الوسط هو رابط الجأش. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسة لمعالجة مباشرة لدور أهداب أو نقل الخلايا في تنظيم SHH في morhpants BBS.ومع ذلك، توفر البيانات المتوفرة لدينا في الجسم الحي دليلا على وجود دور وظيفة BBS في أطرافهم / زعنفة برعم الزخرفة مما أدى إلى زيادة SHH الإشارات.

القسم السابق القسم التالي

المواد والأساليب

MO العقاقير

وقد صممت المنظمات الأعضاء العقاقير والتي تم شراؤها من أدوات الجينات، LLC. تم microinjected المنظمات الأعضاء في ما يقرب من 3 مجلدات نانولتر في 07:59 الأجنة الخلية بتركيزات تتراوح بين 125-500 م م. تسلسل MO الزرد هي bbs1 _aug (GGGAACAGATGACATGGTTGTTTTG)؛ bbs1 _ exon2 (TGAAACTCACCAATGCATGAGGAGA)؛ السيطرة MO bbs1 _5mis (TAAGaGTGAtGATGGcCACTtGCAT)؛ bbs3 _aug (AGCTTGTCAAAAAGCCCCA TTTGCT)؛ bbs3 _exon2 (TACATCTTTTATTTTCACCTTGAGG) والسيطرة MO bbs3 _5mis (AGgTTcTCAAAAAaCCCgATTTcCT).

الزوج الحكيم مزيج من BBS morpholinos

اثنين من المنظمات الأعضاء BBS مختلفة تستهدف bbs1-bbs8 كانت مجتمعة في الجرعات المنخفضة subphenotypic (125 μ M لكل منهما) وmicroinjected في 07:59 الأجنة الخلية. وكانت الضوابط لهذه التجارب مجموعات من جرعة منخفضة من كل BBS MO والتحكم MO (125 μ M لكل منهما). التركيز النهائي من المنظمات الأعضاء حقنه في أي الجنين في هذه التجربة كانت دائما ثابتة (250 μ م).

تحليل KV

والحويصلات في الأجنة التي يبلغ قطرها أقل من ثلث أن من النوع البري يعتبر انخفاض وتم سجل الأجنة التي الحويصلات لا يمكن تحديد شكليا كما تغيب. تم تصوير الأجنة الحية مع زايس Axiocam على المجسام.

فحص النقل جسيم ميلانيني

تعرض يوم 5 اليرقات إلى ادرينالين (50 ملغ / مل، سيجما، E4375) تضاف إلى الجنين المتوسطة (64) لتركيز النهائي من 500 ميكروغرام / مل. تم رصد جسيم ميلانيني تراجع باستمرار تحت المجهر وسجل نقطة النهاية عندما كانت جميع الأجسام الصباغية في الرأس والجذع محيط بالنواة.

إنقاذ النمط الظاهري ضربة قاضية

وsubcloned مقاومة للMorpholino BBS RNA إلى pCS2 + ناقلات التعبير (65). وقدم RNA الاصطناعية مع mMessage mMachine (AMBION). مرنا (50 نانوغرام / ميكرولتر bbs1 و 100 نانوغرام / ميكرولتر bbs7 كان) شارك في حقن MO المناسب.

جبل بأكمله، في الموقع التهجين من SHH في براعم الزعانف الصدرية

الأجنة، وتعامل مع الصباغ المانع في 12 HPF، كان المثقف إلى 42 HPF وثابتة مع بارافورمالدهيد 4٪ / الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). SHH تم توليفها تحقيقات RNA (روش) من القوالب خطي، العقاقير (digoxigenin-UTP جمعية مهندسي البترول I ، T7 RNA البلمرة) والمعنى (ليس أنا، البلمرة SP6 RNA). جبل بأكمله، في الموقع التهجين أنجز كما وصفها الين وآخرون. (16). مجال SHH تم قياس التعبير عن الرأي 1.37v يماغيج (47). الطالب ر استخدمت -test افتراض عدم المساواة التباين لتقييم فروق ذات دلالة إحصائية في متوسط ​​مساحة SHH التعبير (P <0.001). تم تصوير الأجنة في 50 × التكبير.

الغضروف تلطيخ

تم إجراء الغضروف تلطيخ كما هو موضح في تايلور وفان دايك (66). لفترة وجيزة، اليرقات في 6 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) كانت ثابتة بين عشية وضحاها مع بارافورمالدهيد 4٪ / برنامج تلفزيوني، المجففة تدريجيا مع الايثانول المطلق وملطخة بين عشية وضحاها مع الألسيان الأزرق (30 ملغ في 8: 2 الايثانول: حامض الخليك الجليدي). واليرقات ثم ابيض مع 1٪ هيدروكسيد البوتاسيوم (1 M) / 3٪ بيروكسيد الهيدروجين، مسح مع 0.5٪ trypsine / المشبعة tetraborate الصوديوم، ودرجة الحموضة 9.1، لمدة 2 ساعة والمخزنة في 7: 3 الجلسرين: (1X) PBS. تم تصويرها يتصاعد الغضروف في 50 × التكبير.

 

[رافت ابراهيم]

 

http://www.pnas.org/content/104/44/17524.full

استقبال وتفسير المحفزات البيئية هو أمر حاسم لبقاء جميع الكائنات الحية. هنا، وتبين لنا أن الاجتثاث من BBS1 وBBS4، اثنين من الجينات الطافرة في متلازمة بارديه-بيدل وأن البروتينات ترميز أن توطين بالقرب من centrioles من الخلايا العصبية الحسية، يؤدي إلى تغيرات في تعصيب الحسي SC والاتجار في TRPV1 قناة thermosensory وميكانيكية حسية قناة STOML3، مع ما يصاحب ذلك من العيوب في thermosensation الطرفية وmechanosensation. ولخص النمط الظاهري thermosensory في ايليجانس انواع معينة، لأن ردود thermosensory نقص المسوخ BBS اضح في كل من درجات الحرارة الفسيولوجية ومسبب للألم وخلل الاتجار OSM-9، وهو بروتين قناة الحسي polymodal وhomolog الوظيفي للTRPV1 أو TRPV4. وتشير النتائج التي توصلنا إليها وغير معترف بها حتى الآن، ولكن من الضروري، دور الثدييات بروتينات الجسم القاعدية في الحصول على المحفزات mechano- وthermosensory وتسليط الضوء على الميزات يحتمل السريرية للciliopathies في البشر.

• الهيئات القاعدية
• أهداب
• thermosensation

كشفت دراسة الحواس في كل من الفقاريات واللافقاريات دور للأهداب في chemosensation، mechanosensation، وphotosensation. في ذبابة الفاكهة، chemosensation وmechanosensation تعتمد بشكل خاص على الخلايا العصبية التي مهدبة (1). وبالمثل، راسخة دور للأهداب في chemosensation في ايليجانس انواع معينة، حيث المسوخ مع وظيفة للخطر أو هيكل من العيوب عرض أهداب في الاستشعار عن عطر أو الاختلافات في الأسمولية (+2 - 4). في الثدييات، مستقبلات الرائحة توطين لأهداب الشم (5)، وأجهزة phototransduction الخلايا قضيب ومخروط في الفقاريات يموضع إلى الجزء الخارجي، وهدب المعدلة (6). وأخيرا، فإن الهدب المحرك شرط أساسي للتنمية القوقعة، وبالتالي السمع بسبب دورها في stereociliary التشكل حزمة (7).
نحن وغيرنا قد أظهرت أن الخسارة من وظيفة الطفرات في الجينات الكامنة وراء عديد المظاهر بارديه-بيدل النمط الظاهري (8) تسبب العجز الحسية التي تشمل فقدان الرؤية، الشم، السمع ومعيب (5، 7، 9، 10). جميع البروتينات BBS تتسم حتى الآن توطين بالقرب أو داخل الهيئات القاعدية وأهداب في كل خلايا الثدييات (11 - 13) وفي C. ايليجانس الخلايا العصبية الحسية (+14 - 16).
هنا، وتبين لنا أن الثدييات الخلايا العصبية الحسية المحيطية ومهدبة وأن المسوخ الماوس مع المستهدفة الخسارة من وظيفة الطفرات في أي Bbs1 أو Bbs4 المعرض thermosensory الظواهر التي تتميز زيادات كبيرة في الإختفاء استجابة سلوكية. من غير المرجح أن يكون سبب العليا القشرية أو اختلال وظيفي محرك هذه العيوب ولكن ترافقها تغيرات في تعصيب الحسي الجلدي وخلل توزيع الجزيئات المستجيب في سوما الخلايا العصبية الحسية. هذه الظواهر ليست فريدة من نوعها للثدييات، لأن BBS الخيطية المسوخ هي أيضا thermosensory معيب. وأخيرا، والبشر مع BBS أيضا البيان بعض أعراض مشابهة لتلك التي لوحظت في الفئران، مثل انخفاض درجة الحرارة والاهتزاز الإحساس. وتشير دراساتنا دورا حاسما من الجسم الهدبي والقاعدية البروتينات عن وظيفة الثدييات الخلايا العصبية الحسية الطرفية وتنبيغ كفاءة من المحفزات extraorganismal.

القسم السابق القسم التالي

النتائج

الظهرية جذر العقد هي مهدبة.

في الثدييات، وقد لوحظ أهداب الابتدائي في معظم الخلايا تالية للتفتل. ومع ذلك، فإنها لم يتم الإبلاغ عنها في الخلايا العصبية الحسية الطرفية. وبالنظر إلى أن أهداب الابتدائية أداء المهام الحيوية في الخلايا العصبية الحسية اللافقارية، ونحن التحقيق ما إذا كانت هذه الخلايا يمكن أيضا المهدبة في الثدييات. تلطيخ العقد الجذرية الظهرية (DRG) المقاطع مع الأجسام المضادة ضد IFT88 البروتين axonemal (بولاريس) (17 اقترح) وجود أهداب (لا تظهر البيانات)، الذي كان مدعوما من جراء انتقال المجهر الإلكتروني (الشكل 1 A، F، وG). لتحقيق هذا الاحتمال أكثر شمولا، وخصوصا بسبب أقسام DRG تحتوي على السكان غير متجانسة من أنواع الخلايا، ونحن مثقف الخلايا العصبية DRG من الفئران البالغة WT وخلايا ملطخة أجسام مضادة ضد سلسلة من البروتينات axonemal المعروفة ومكافحة NeuN لتمييز الخلايا العصبية من أنواع الخلايا الأخرى . لاحظنا تلطيخ محددة على طول أهداب الخلايا العصبية لIFT88 (الشكل 1 B)، وكذلك IFT57 (لا تظهر البيانات). لنؤكد أيضا أن هذه ليست قطعة أثرية عبر التفاعل، ونحن transfected الثقافات DRG مع ترميز البلازميد و(V5) البروتين الموسومة حاتمة axonemal، IFT81 (18). Costaining مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للV5، وكذلك المرتبطة أنيبيب بروتين 2 (MAP2؛ الشكل 1 C)، علامة الجذعية العصبية، أيد كذلك وجود هدب على سوما الخلايا العصبية DRG.

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 1.

الخلايا العصبية DRG لها أهداب الابتدائي. (A، F، G و) الفئران DRGs الموافق قطني المناطق تم تشريح L3-L5 وتعرض لالمجهر الإلكتروني. التكبير، × 60000 (يسار)؛ × 8000 (مركز)؛ × 15000 (يمين). كانت تزرع (B و C) DRGs الفئران فصل، في الثقافة لمدة 3-7 أيام، تليها مناعية باستخدام علامة النقل intraflagellar بولاريس (IFT88) (B) جنبا إلى جنب مع علامة العصبية NeuN. كانت ملطخة A 72-ح ترنسفكأيشن من IFT81 الموسومة ب V5 أيضا مع الأجسام المضادة لمكافحة V5 وMAP2 (C)، علامة الجذعية. تشير الأسهم الصفراء للأهداب. عرض (أقحم) التكبير من هدب تلطيخ الخلايا العصبية. (D و E) سيتولوجية مناعية من الخلايا العصبية DRG مثقف مع الأجسام المضادة ضد BBS1 (D) وBBS4 (E)، costained مع علامة العصبية NeuN. السهام الخضراء تشير إلى إيجابي توطين الجسم القاعدية.

الفئران BBS المسخ وقد حراري وميكانيكية حسية المعيبة الظواهر.

وقد ارتبطت طفرات فارغة في البروتينات BBS مع عيوب وظيفية، ولكن ليس الهيكلية، من هدب سواء بصورة مباشرة، كما يتضح من تنكس الشبكية (9، 10) والشم (5)، وبشكل غير مباشر، من خلال نقل عيب محتمل للإشارة WNT (7). لذا تساءلنا عما إذا كان وجود أهداب في الخلايا العصبية الحسية التي يعصب الجلد قد تؤكد أخرى، تأخذ حقها حتى الآن، والعجز الحسي في المسوخ ciliopathy.
أولا، لإقامة وجود هدب في DRGs من BBS فئرانا معدلة وراثيا، أجرينا مناعية على DRGs فصلها نمت في الثقافة التي تم الحصول عليها من Bbs1 - / - وBbs4 - / - الفئران. Costaining مع أي أدينيليل محلقة 3 (AC3) أو أظهر IFT88 وNeuN أهداب العادي بشكل صارخ في كل من سلالات متحولة [المعلومات الداعمة (SI) الشكل. 6 A]، في حين أن توزيع γ تويولين كان تمييزه عن الضوابط WT، مما يشير إلى أن العمارة الإجمالية من الجسم القاعدية هي أيضا طبيعية (SI الشكل 6 B). ثم لإنشاء توزيع البروتينات في الخلايا العصبية DRG BBS، أجرينا مناعية على DRGs فصلها من فئران بالغة. والجدير بالذكر أن هذه الخلايا العصبية تبدي الهيئات القاعدية التي هي منفصلة مكانيا من centrosomes، وكما يتضح من تلطيخ مع MAP-2 و γ تويولين (19) (SI الشكل 6 B)، وهو نمط تذكرنا IMCD3 خلايا القناة جمع الكلوي (11) ربما كان هذا هو انعكاس للدولة تالية للتفتل الاستقطاب من هذه الخلايا. وكان توزيع البروتينات BBS في WT أيضا مطابقة للأنماط المحددة سابقا في هذه الخلايا (+11 - 13)، مع كل من BBS1 وBBS4 توطين بالقرب centrosomal منفصلة أزواج (محيط بالمريكز أو مريكزي) من النقاط في كل عصبون (الشكل 1 D وE).
ونظرا لهذه الملاحظات، أجرينا فحوصات السلوكية على Bbs1 - / - الفئران كوسيلة أولية لاستكشاف دور (ق) من هذه البروتينات في وظيفة الخلايا العصبية الحسية. وكان أول اختبار الغمر فحص الذيل، الذي قمنا بقياس الكمون الانسحاب ذيل عبر مجموعة من درجات الحرارة. في مجموعة من التجارب أجريت في ثلاث نسخ والطرف عن التركيب الوراثي، وجدنا أن Bbs1 - / - كان المسوخ يعد الإختفاء مقارنة مع تتزاحم WT، مما يشير إلى أن هذا المسخ كان له المعيبة، ولكن لا تضيع والاستجابة thermosensory (الشكل 2. أ) .

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 2.

Bbs1 - / - الفئران لها ردود ناقصة للمؤثرات الحرارية والميكانيكية وكذلك تقليل نقل الإشارة إلى الحبل الشوكي ردا على التحفيز الحراري. (A) نتائج من فحص ذيل الغمر التي المستمر التحفيز في 46 ° C، +48 ° C، 50 درجة مئوية، أو 52 ° C يطبق، ويتم تسجيل الوقت للرد. عموما، Bbs1 - / - فى الحيوانات الإختفاء أكبر من نظرائهم WT. (ب) فحص فون فراي على Bbs1 - / - أظهرت الفئران قدرا أكبر من القوة اللازمة للحث على الاستجابة الميكانيكية مقارنة مع WT. (C) أقسام التمثيلية للL3 / L4 / L5 الظهرية منطقة القرن Bbs1 + / + وBbs1 - / - الفئران ملطخة المضادة للج-FOS بعد التحفيز من واحد مخلب هند في 48 ° C أو 52 ° C حمام الماء . (D) قطعة أرض لعدد من ج-فو نوى -positive في القرن الظهري المماثل مقابل القرن الظهري المقابل بعد التحفيز من واحد مخلب هند في 48 ° C أو 52 ° C حمام الماء (ن = 4 الفئران في التركيب الوراثي). (التكبير، × 10).

تساءلنا المقبل ما إذا كانت هذه المسوخ قد يكون أيضا العيوب الحسية الأخرى. وبالتالي فإننا اختبار لنقص محتمل في mechanoception مع اختبار فون فراي، الذي وكميا الحواس من حيث استجابة لضغوط عبر مجموعة من القوى الميكانيكية التطبيقية. وجدنا أن Bbs1 - / - فى الحيوانات عتبة استجابة انخفضت إلى نقط المحفزات تطبيقها على قوات أقل مقارنة مع الفئران WT (الشكل 2 B). الأهم من ذلك، لم يكونوا على thermosensory ولا الظواهر ميكانيكية حسية فريدة من نوعها لBbs1 - / - الفئران، لأن التحاليل متطابقة من Bbs4 - / - كشفت المسوخ نفس العيوب (لا تظهر البيانات).
لتفسير هذه الظواهر، رأيناها ثلاثة احتمالات: أن الحيوانات كانت الاستجابات الحركية المعيبة، أن الحيوانات قد يثير الشبهة أعلى وظيفة القشرية وبالتالي فقد تحدت لتفسير الإشارات الحسية. أو أن العيب نشأ في تعصيب لها الطرفية. كما استبعدت الاحتمال الأول عن طريق اختبار التنسيق الحركي مع rotarod متسارع. على الرغم من أن بعض المسوخ BBS كانت أثقل من تتزاحم WT، وعدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين Bbs1 - / - الفئران وWT عبر أربع التجارب التي أجريت أعمى إلى التركيب الوراثي (P = 0.13؛ SI الشكل 7.).
المقبل، للتمييز بين العيوب الطرفية وتشوهات في أعلى وظيفة القشرية، درسنا قراءات thermosensory دون مستوى الدماغ، وهي الاستقراء أثار حرارة فوري الجيني المبكر ج-فو في الدرجة الثانية الخلايا العصبية الحسية من النخاع الشوكي القرن الظهري (20). A تخفيض يسببها حراريا ج-فو في القرن الظهري، كما تم قياسها عن طريق حساب عدد من نوى ج-فو-إيجابية، تشير إلى أن وجود خلل ما لا يقل يحدث في تعصيب الطرفية أو تفعيل الخلايا العصبية من الدرجة الثانية. إذا يبقى ج-فو الاستقراء العادي في القرن الظهري، ثم عيب يمكن أن تحدث في مراكز المعالجة CNS أعلى (20). نحن حفز مخلب واحد من ثلاثة المسوخ وثلاثة تتزاحم WT إما في 48 ° C أو 52 ° C وكميا النووي التعبير ج-فو في القرن الظهري المماثل عبر المقاطع المسلسل الى منطقة أسفل الظهر (L3-L5)، أعمى إلى التركيب الوراثي. وعلى النقيض من تفعيل قوي من الظهرية الخلايا العصبية قرن في الحيوانات WT تتعرض ل48 ° C التحفيز، لاحظنا تفعيل ضئيلة أو معدومة من ج-فو في الخلايا العصبية القرن الظهري المسوخ Bbs1 "في نفس درجة الحرارة (الشكل 2 C و D). ظلت استجابة من المسوخ والحيوانات WT مختلفة إلى حد كبير عند 52 ° C، على الرغم من درجة الحرارة هذه، المسوخ تظهر بعض الاستجابة، مما يشير إلى وجود الشذوذ الحسي المحيطي.

العيوب التشريحية في التعصيب الشوري في الفئران BBS المسخ.

لتحديد ما إذا كانت التغيرات في الغدد العرقية الطرفية قد تساهم في العجز الحسي المرصودة، قمنا بتحليل المشعر هند مخلب (GHP) أقسام الجلد immunolabeled لPGP 9.5، علامة panneuronal، وCGRP، علامة من تعصيب ببتيدي المفعول (الشكل 3، SI الجدول 2 ). وكشف التحليل النوعي تخفيضات في CGRP مناعية (IR) بين ألياف داخل الجلد الحلمية كل المسوخ BBS (الشكل 3 أ و ب). كريات ميسنر، التي تعبر عادة عن انخفاض مستويات CGRP-IR (21)، لم تتأثر بشكل ملحوظ. تم تغيير توزيع النهايات الحسية داخل البشرة وحجم الجلد الحلمية أيضا في كل من المسوخ BBS. في منصات WT، تعصيب لديه توزيع موحد نسبيا في جميع أنحاء البشرة بينما في المسوخ BBS، فهي تتركز بشكل غير متناسب في الجلد الحليمات (الشكل 3 C). الكمي التي أجريت على GHP الأنسجة المسمى لPGP 9.5 والفأر مكافحة Cy2 لترسيم الحدود بين الجلد ابيديرمي epidermal أكد أن كلا من المسوخ BBS زادت النهايات الحسية أعلاه وعلى الحدود بين الحليمات، والتي كانت أيضا أوسع من WT (الشكل 3 F وH). لم يتم تغيير كثافة البشرة إنهاء الشاملة عبر لوحة بالكامل انخفض بدرجة كبيرة في أي من المسوخ BBS.

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 3.

الاختلافات في بنية البشرة والغدد العرقية في BBS - / - الفئران. (A و B) صور منصات البعيدة من الكفوف الخلفيتين المشعر تظهر CGRP (الحمراء) مع PGP (الأخضر) (A) وCGRP (B) immunolabeling وحده BBS - / - قد الحيوانات خفضت مناعية CGRP في الألياف العصبية داخل الجلد الحليمات ( الأسهم الصفراء)، في حين لم تكن هناك اختلافات واضحة في نسبة-CGRP إيجابي النهايات البشرة (النجوم الصفراء). الأسهم الخضراء والنجوم تشير ألياف الجلد العصبي PGP الإيجابي والنهايات البشرة، على التوالي. يشار إلى الحدود البشرة الجلدية خط متقطع. (C) الصور من منصات البعيدة من WT وBBS - / - الفئران المسمى لPGP 9.5. ومتباعدة تعصيب بالتساوي في جميع أنحاء البشرة لوحة WT ولكنها تتركز في الحليمات الجلدية في المسوخ BBS. (D) عن قرب من منطقة لوحة البعيدة اختيارها يدل على تصنيف شخصي من النهايات الحسية على أساس موقفهم في البشرة قريبة الحليمات الجلدية (بين أعلاه، أو على الحدود بين حليمة). وصفت النهايات التي تغطي مناطق متعددة في كل منطقة مروا من خلال (على سبيل المثال، النهايات interpapilla الحدود). (E) صور منصات البعيدة المسمى مع مكافحة فأر Cy2 لترسيم الحدود بين الجلد ابيديرمي epidermal تبين أن المسوخ BBS لها كبير، شوه الحليمات الجلدية (السهام البيضاء). الحليمات (خطوط بيضاء صلبة) والأمثلة على المناطق تحديدها بشكل غير موضوعي أعلاه (تبددت خطوط بيضاء) وعلى الحدود بين حليمة (منقط خطوط بيضاء) وتتبع. (F-H) الكمي لتعصيب البشرة وهيكل حليمة الجلد أجريت على أقسام الأنسجة المسمى مع PGP 9.5 والفأر مكافحة Cy2. (F) كل BBS - / - المسوخ كان أكثر بكثير النهايات أعلاه وعلى الحدود بين الحليمات مقارنة مع WT، وBbs1 - / - الفئران كان أكثر بكثير مجموع النهايات الحليمات من Bbs4 - / - الفئران. وبلغ مجموع النهايات الحليمات مجموع كل النهايات التي مرت عبر المناطق المذكورة أعلاه أو على الحدود بين الحليمات. (G) Bbs1 - / - زيارتها الفئران كثافة أكبر بكثير من النهايات فوق الحلمية الخاصة بهم، وBbs4 - / - زيارتها الفئران أقل بكثير النهايات بين الحليمات بهم، مشيرا إلى أن عددا أكبر من النهايات المرتبطة الحليمات في هذه الحيوانات لم يكن بسبب مجرد التغيرات في حجم الحليمات. لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية لإنهاء الكثافة خارج المنطقة الحلمية (من بداية ونهاية لوحة لحليمة الأولى) أو على لوحة كاملة. حسبت البشرة الكثافة إنهاء بقسمة عدد من النهايات في المنطقة من خلال طوله. كان المسوخ (H) كل من BBS لفترة أطول كثيرا الحليمات الاعراض لكن ليس المرتفعات. وقد تم قياس ارتفاع حليمة من قاعدتها المقدرة على الارتفاع ذروته في البشرة، وحسبت عرض بتقسيم منطقة الحليمة التي كتبها ذروتها. موانئ دبي، حليمة الجلد، سان جرمان، الغدد العرقية. ه، البشرة. د، الأدمة.

C. ايليجانس BBS المسوخ هل Thermosensory المعيبة.

على الرغم من أن البيانات الثدييات دينا أنشأت الظواهر thermodefective عن المسوخ لدينا، تعصيب الثدييات معقدة بطبيعتها، ويمكن أن الظواهر الحسية تكون متغيرة. علاوة على ذلك، الخلايا العصبية الحسية الثدييات أيضا التفاعلات المعقدة مع أنواع الخلايا الأخرى التي مهدبة أيضا، مثل خلايا شوان والخلايا الكيراتينية (22، 23). لهذه الأسباب، لجأنا إلى كائن مهدبة بساطة، C. ايليجانس، حيث يمكننا أن التحقيق في عواقب القاعدية ضعف الجسم / الهدبية في thermosensory استجابة حصرا في الخلايا العصبية الحسية المهدبة.
لاختبار الدور المحتمل للC. البروتينات ايليجانس BBS في thermosensation، ونحن أول مقارنة سلوك اثنين وصفت سابقا BBS المسوخ (14)، (المعروف أيضا باسم OSM-12) BBS-7 و BBS-8، مع أن من نظرائهم WT في مقايسة تكيف حراري (24) . عند وضعه على التدرج الحراري الطولي الضحلة تتراوح ما بين 18.5 درجة مئوية إلى 21.5 درجة مئوية (في 8 سم)، انتقلت الحيوانات WT بشكل فعال في درجة الحرارة تربية الخاصة من 20 درجة مئوية خلال مدة 1 ساعة (الشكل 4 A). على النقيض من ذلك، BBS-7 و BBS-8 المسوخ عرض عيوب كبيرة إحصائيا (P <0.00001) في تكيف حراري لمنطقة C 20 ° (الشكل 4 A). وقد أجريت على عدد متساو من تكيف حراري فحوصات عن طريق وضع الحيوانات على الجانب الساخن أو البارد من بلاطة آغار، وضمنا النتائج التي المسوخ الهدبية كانت معيبة في thermosensation العام، تبين عدم وجود تفضيل لدرجات حرارة دافئة أو باردة. لا يمكن أن يعزى هذا النمط الظاهري لالحركي العيوب، لأن عرض حركة الحيوانات متحولة (أي الانحناءات في الدقيقة) لا يمكن تمييزها من WT (لا تظهر البيانات). بالإضافة إلى ذلك، أظهرت BBS-7 و BBS-8 سلالات متحولة انقاذ مع الجينات WT كل منها استعادة تكيف حراري السلوكيات (الشكل 4. A؛ BBS-7 الإنقاذ = 0.5307 ± 0.073؛ BBS-8 الإنقاذ = 0.4925 ± 0.063). الأهم من ذلك، وهذه العيوب لا يقتصر على المسوخ BBS، لأن المسوخ الهدبية الأخرى، بما في ذلك OSM-5، والتي بترميز ortholog من IFT52 (25)، وOSM-3، الذي يشفر كينيسين homodimeric اللازمة لبناء الجزء الأعلى من C . ايليجانس أهداب (26)، عرض أيضا تكيف حراري العيوب (P <0.00001) التي كانت قابلة للمقارنة مع تلك التي BBS المسوخ (الشكل 4 A). أيضا من الفائدة، كان التشكل العام للتزيين زغيبات AFD thermosensory الخلايا العصبية هدب سليمة، مما يوحي بأن العيوب فقط في هدب الأساسي تسببت في النمط الظاهري (لا تظهر البيانات).

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 4.

C. ايليجانس تظهر طفرات الهدبية تكيف حراري والعيوب تجنب الحرارية وكذلك mislocalized OSM-9. (A) تكيف حراري وتجنب الحراري للWT (N2)، BBS المسوخ، وOSM-3 كينيسين المسوخ. تكيف حراري يتصل جيدا كيف تتحرك الديدان لمن منطقة درجة الحرارة تربية (20 ° C). (B) تجنب Nonthermal هي نسبة الديدان التي لا تجنب درجات الحرارة الضارة قدم بالقرب من رأس الحيوان. لA و B، *، P <0.00001. (C) GFP الموسومة OSM-9 mislocalizes في BBS-8 الحيوانات متحولة. TZ، منطقة انتقالية / الجسم القاعدية. *، تراكمات غير طبيعية لم تشهدها من النوع البري الحيوانات.

المقبل، لاختبار ما إذا كانت العيوب thermosensory تمتد إلى درجات الحرارة الضارة، أجرينا فحص تجنب الحراري، والتي تم قياس استجابة الديدان الفردية إلى درجة حرارة مسبب للألم (≈50 ° C) وضعها مباشرة في مسار حركتهم قرب رؤوسهم ( 27). الحيوانات WT (ن> 400) تتوقف حركتها إلى الأمام وبدء متميزة، عكس انعكاسية استنساخه في 94.9٪ من الحالات (الشكل 4. B؛ انظر أيضا المرجع 27). على النقيض من ذلك، BBS-7 و BBS-8 المسوخ (ن> 400) على حد سواء أظهر الظواهر تجنب الفقيرة (P <0.00001)، مع تجنب الاستجابات المناسبة لوحظ في فقط 73.1٪ و 73.3٪ من الحالات، على التوالي. وبالمثل، عرض على OSM-3 وOSM-5 المسوخ تجنب في 78.3٪ و 73.4٪ من الحالات (P <0.00001)، على التوالي (الشكل 4 A). للتأكد من أن الظواهر التي تعاني من نقص الحرارية على وجه التحديد بسبب طفرات في BBS، أكدنا أن BBS-7 و BBS-8 المسوخ التعبير عن الجينات المحورة WT كانوا قد الردود تجنب الحرارية مقارنة مع تلك الحيوانات WT (BBS-7 الإنقاذ = 95.0٪ ± 3.2 ٪، BBS-8 الإنقاذ = 94.5٪ ± 0.4٪، الشكل 4 B).
سعينا المقبل لمواصلة التحقيق الأساس الكيميائي الحيوي لهذا النمط الظاهري. وكان أحد الاحتمالات أن وظيفة الهدبية المعيبة قد التشويش على حركة الجزيئات المستجيب، منها مستقبلات TRP سيمثل المرشحين المثالي. ولذلك درسنا حركة OSM-9 في المسوخ لدينا. لأنه لا يوجد C. وحتى الآن تم ربط قناة ايليجانس TRP خصيصا لthermosensation، ركزنا على OSM-9، وهو بروتين axonemal يعرف ما هو مطلوب لالكيميائي ويمثل homolog الوظيفي المحتمل للTRPV1 الثدييات أو TRPV4 (28، 29). وجدنا أن إصدار GFP الموسومة من OSM-9، والذي يموضع بشكل صحيح إلى الخيط المحوري الهدبية في الحيوانات WT، يظهر mislocalization متغير ولكن ثابت في خلفية BBS متحولة. على وجه التحديد، عرض BBS-8 الحيوانات تراكمات / mislocalization لم أر في الحيوانات WT أو في BBS-8 الحيوانات الإنقاذ، على طول التغصنات، داخل أو على مقربة من الجسم القاعدية، وعلى طول الخيط المحوري الهدبية (الشكل 4 C). على الرغم من أن OSM-9 ليس C. ايليجانس thermosensory مستقبلات في حد ذاته، وتشير النتائج التي توصلنا إليها أن التفسير الجزيئي واحدة على الأقل في النمط الظاهري thermosensory هو أن جهاز thermosensory القائم على هدب (على سبيل المثال، TRP-نوع مستقبلات) mislocalizes أو غير فعال عندما تتعطل BBS ظيفة البروتين.

عيب توزيع مستقبلات الخلايا العصبية في الفئران DRG.

على الرغم من أن تشريح C. ايليجانس الخلايا العصبية الحسية تختلف بشكل ملحوظ عن تلك الخلايا العصبية الحسية الطرفية في الثدييات (لأسباب ليس أقلها الموقف من هدب النسبي لموقع المدخلات الحسية)، أثارت بيانات دينا إمكانية المتميزة التي mistrafficking أو misregulation من حراري والبروتينات قناة ميكانيكية حسية قد تسهم في الظواهر التي لوحظت في الماوس. لدراسة هذا الاحتمال، ركزنا على TRPV1 مستقبلات الثدييات، ينشط في نطاق حيث لوحظ أن النمط الظاهري في المقام الأول (30) وSTOML3، وهو بروتين مثل stomatin أن ثبت مؤخرا أنها ضرورية لmechanosensation (31)، والتي لقد وجدنا سابقا أن mislocalized في الظهارة الشمية من BBS المسوخ الماوس (5).
نحن تقييمها أولا توزيع TRPV1 في أقسام GHP من كل بلد من بلداننا المسوخ وتتزاحم WT. نحن لم نلاحظ أي اختلافات ملحوظة بين تلطيخ النهايات (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، عند اختبار مقصورة آخر من هذه الخلايا العصبية، ونحن لم نلاحظ تغير TRPV1 مناعية في سوما على النحو الذي يحدده التهديف أعمى من أقسام متتالية عبر DRG. أربعة من ستة Bbs1 - / - الحيوانات قد الاكتئاب إشارة TRPV1 كما تقرره متوسط ​​كثافة الخلايا العصبية الملون بشكل إيجابي، في حين أن Bbs4 - / - أظهرت الحيوانات زيادة في كثافة-TRPV1 إيجابي somata (SI الشكل 8 A و B.). كان هذا يذكرنا العيوب وحظ سابقا من الخلايا العصبية الشمية، حيث Bbs1 - / - وBbs4 - / - أظهرت الحيوانات الظواهر الخلوية متناقضة، وكلاهما توج في نفس الخلل الوظيفي (32). نحن لا نعرف ما إذا كان هذا الاكتشاف يعكس مواصفات العصبية غير الطبيعية (يحتمل أن تكون نتيجة لهدب عيب) أو ما إذا كان أقلقت الاتجار مستقبلات.
وجدنا اضطرابات مماثلة في توزيع STOML3. في حين تم الكشف عن كميات متواضعة في السيتوبلازم (وربما غشاء البلازما) من الخلايا في الفروع عبر DRG في الحيوانات WT، لاحظنا وضوحا تراكم STOML3 في نوى على حد سواء Bbs1 - / - وBbs4 - / - الحيوانات (الشكل 5 )، والتنبؤية توزيع عيب ميكانيكية حسية.

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 5.

توزيع STOML3 في الخلايا العصبية DRG. وعلى النقيض من الحيوانات WT، وزعزع STOML3 تلطيخ في المسوخ BBS، حيث يبدو أن mistrafficked إلى النواة. الصور هي في التكبير، × 40.

العيوب الحسية في BBS المرضى.

إنشاء thermosensory المعيبة / ردود مسبب للألم في الجسم الهدبي والقاعدية المسوخ في الماوس وC. أثار ايليجانس إمكانية واضحة أن المرضى BBS قد أيضا يحمل أوجه القصور الحسية غير معروف حتى الآن. لاختبار هذه الفرضية مباشرة، قمنا بتعيين تسعة مرضى BBS لا علاقة لها فوق سن ال 17، وبناء على موافقة مستنيرة، يعاير عليهم سبع لطرائق الحسية باستخدام اختبار عصبي القياسية. كان جميع المرضى تناقص ملحوظ في قدرتها على كشف الاهتزاز عندما تم تطبيق الشوكة إلى اللقم الإنسي والجانبية على ظهر المعصم وكل عرض الفقراء التمييز بفارق نقطتين على النخيل وظهر اليد. سبعة من التسعة (78٪) لديهم الحس العميق تضاءلت (الشعور موقف مشترك)، وأربعة من تسعة (44٪) قد تضاءلت حساسية درجة الحرارة، وسبعة من تسعة (78٪) لم يتمكنوا من تحديد دقيق لوزن أو شكل الجسم وضعها في كف (الجدول 1).

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

الجدول 1.

الظواهر الحسية في المرضى الذين لا علاقة BBS

القسم السابق القسم التالي

نقاش

هنا، لقد أظهرنا أن somata من الخلايا العصبية الحسية الثدييات ومهدبة وأن الخسارة من وظيفة الطفرات في الهدبية والبروتينات الجسم القاعدية تؤثر على وظيفة هذه الخلايا، التي تترجم إلى عيوب في تصور thermosensation في الماوس، واسعة الظواهر الحسية لدى البشر. على حد علمنا، هذا الارتباط في الثدييات بين الجسم القاعدية / البروتينات الهدبية وthermosensation هي غير المبلغ عنها سابقا، ويحتمل أن تكون لها آثار كبيرة على فهمنا لتطور وظيفة الخلايا العصبية الحسية الطرفية.
على الرغم من أن الأساس الخلوي الدقيق لهذا النمط الظاهري سوف تحتاج إلى مزيد من التحقيق، وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن اضطراب الجسم القاعدية يمكن ربما يؤدي إلى mislocalization يصاحب ذلك من TRPV1 وSTOML3 في العقد الجذرية الظهرية، ملمحا إلى أن الاتجار معيب والتعبير، أو توطين الخلوية من هذه القناة البروتينات، أو في الواقع مواصفات العصبية، قد تساهم في الظواهر المرصودة. اكتشافنا أن C. ايليجانس OSM-9 جزئيا mislocalizes في BBS المسوخ تدعم هذه الفرضية. يتسق أيضا مع نموذج النقل، وأشارت بيانات حديثة أن PKD2 heterodimerizes مع واحد على الأقل من قنوات thermoTRP، TRPV4، ويبدو أن هناك حاجة لوظيفة الصحيحة لها (M. Köttgen وG. والز، اتصال شخصي)، وتقدم ميكانيكي الصلة بين البروتينات الهدبية والعجز thermosensory. ومع ذلك، العيوب التخلق إضافية قد تسهم أيضا، كما يتضح من تعصيب الجلدي الشاذة من كل من المسوخ ciliopathy فحصها. تم ترجمة مستقبلات مثل SSTR3 و 5 HT6 لأهداب الابتدائي الخلايا العصبية في الدماغ (33، 34)، وعلى الرغم من أنها لم أظهر في DRG أهداب، وأعربت SSTR3 مرنا في الخلايا DRG (35). ومن الملاحظ أيضا أن بعض الناقلات العصبية ونيوروببتيد ويعتقد أن يصدر من سوما DRG (36، 37). أخذت معا، هذه الملاحظات تؤدي بنا إلى التكهن قد يكون متورطا أن أهداب DRG في العوامل الإنمائية الرئيسية الاستشعار، التي يمكن بدورها تنظيم توطين وظيفة تعصيب الحسي المحيطي.
في الوقت نفسه، فمن الممكن أن اختلال وظيفي الهدبي على الخلايا nonneuronal في محيط يمكن أن تسهم في هذه التغيرات في الغدد العرقية. على سبيل المثال، ومن المعروف أن الخلايا الكيراتينية أن مهدبة (22)، وكذلك خلايا شوان (23). وبالتالي يمكن لمزيج من العيوب الهدبية في كل من هذين النوعين من الخلايا يساهم في موقعنا thermosensory وحظ والظواهر ميكانيكية حسية. وبالتالي تكون هناك حاجة الاجتثاث المشروط من البروتينات الهدبية في الخلايا العصبية الحسية، طبقات الخلايا الكيراتينية منفصلة والخلايا الدبقية فضلا عن المسوخ الكبار محددة لتشريح المساهمة النسبية الزمانية المكانية لكل الأنسجة.
وأخيرا، تشير البيانات المتوفرة لدينا مريض BBS أن اضطراب الخلايا العصبية الحسية المحيطية قد لا تقتصر على thermosensation لكن قد عقد ينطبق أيضا على طرائق أخرى. وسيكون من المهم لتحديد مدى وطبيعة هذه العيوب، وما إذا كانت تقتصر على الجلد. في موازاة ذلك، فإنه من الأهمية بمكان لتحديد ما إذا كانت هذه الظواهر موجودة في متلازمات الهدبية أخرى. وقد أبرز الأعمال الأخيرة للciliopathies كمجموعة من الاضطرابات مع تداخل، وإن كان، الخصائص السريرية متغير مثل تنكس الشبكية وأمراض الكلى الكيسي، والشم (38). فمن المعقول أن نفترض أن العجز الحسي المحيطي قد تمثل بعد آخر، مكون underrecognized هذه الاضطرابات السريرية.

القسم السابق القسم التالي

إجراءات تجريبية

الماوس السلوكية طرق التجريبية.

ذيل غمر الفحص.

تم مغمورة الثلث الأعلى من ذيل فأر في حمام الماء الساخن الذي عقد في 46 ° C، +48 ° C، 50 درجة مئوية، و 52 درجة مئوية. وكان مقدار الوقت اللازم لذيل الماوس للنقر على استجابة المسجلة. وضعت قطع مرات في كل درجة حرارة (1 دقيقة 46 ° C و 48 ° C، و 10 ثانية لمدة 50 ° C و 52 ° C) لمنع الضرر للحيوان. تم اختبار عشرة إلى 15 الفئران في التركيب الوراثي، وأجريت ثلاث تجارب في درجة الحرارة.

فون فراي الفحص.

وقد تأقلم الفئران لمدة 30 دقيقة على الأقل في غرف زجاجي قمة سلكية. تم تطبيق القوة الميكانيكية منقط إلى مخلب هند الصحيح باستخدام الإلكترونية فون فراي anesthesiometer (IITC، وودلاند هيلز، كاليفورنيا). كانت القوات التي انسحبت الحيوان مخلب الذي اتخذته ثلاث مرات حيث بلغ متوسط ​​الاستجابة. تم اختبار عشرة إلى 15 الفئران في التركيب الوراثي، وأجريت ثلاث تجارب.

فحص Rotarod.

وبدأ العمل في فترة التدريب حيث وضعت الفئران على rotarod تسريع (كولومبوس الآلات، كولومبوس، OH) بسرعة ثابتة من 4 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق متتالية. إذا سقط الماوس، وضعت مرة أخرى على rotarod حتى 5 دقائق قد انقضت. ثم سمح الفئران للراحة في أقفاصها الفردية لا يقل عن 1 ساعة. تم الفئران ثم توضع مرة أخرى على rotarod في سرعة التعجيل من 4-40 دورة في الدقيقة مع التسارع التدريجي الذي يحدث كل 30 ثانية. وسجلت الوقت اللازم للماوس لتسقط على rotarod كرد. تم اختبار عشرة إلى 15 الفئران في التركيب الوراثي، وأجريت أربع تجارب.

الماوس تشريحية طرق التجريبية.

Immunolabeling من الماوس GHP أقسام الأنسجة باستخدام مكافحة PGP 9.5 (1: 800؛ Ultraclone) ومكافحة CGRP (1: 400؛ حدة طرفية مختبرات)، الأجسام المضادة الأولية مع المضادة للأرنب اليكسا فلور 488 (1: 500؛ المسابر الجزيئية)، ومكافحة -guinea pig Cy3 (1:500; Jackson ImmunoResearch) secondary antibodies was conducted as previously described ( 21 ).من أجل ترسيم واضح البشرة من الأدمة، ومكافحة فأر Cy2 (1: 250؛ جاكسون InnumoResearch) تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية لتسمية المناعية الذاتية التي تتركز بشكل تفضيلي في الأدمة. كان إعداد الأنسجة من القرن الظهري DRG وفقا لبروتوكولات موحدة، كما تلطيخ وتقدير من الظواهر. للحصول على طرق مفصلة، ​​انظر طرق SI.

C. ايليجانس التحليلات.

جيل من الحيوانات والإنقاذ المعدلة وراثيا وكما وصفها (14). أجريت فحوصات السلوكية كما هو مفصل سابقا؛ لمزيد من التفاصيل التجريبية، انظر طرق SI.

 

[رافت ابراهيم]

 

http://www.pnas.org/content/108/15/6276.full

المرضى الذين يعانون من متلازمة بارديه-بيدل (BBS) تجربة تنكس الشبكية الشديد نتيجة لعمليات النقل مبصرة ضعاف التي لا تزال غير مفهومة تماما. حتى الآن، لا يوجد علاج فعال لBBS المرتبطة تنكس الشبكية والعمى وشيك من قبل العقد الثاني من العمر. نحن هنا تقرير وضع الغدة المرتبطة الفيروسي (AAV) المتجه أن ينقذ رودوبسين mislocalization، ويحافظ على قضيب قطاعات الخارجي العادية، التي تظهر تقريبا، ويمنع موت مستقبلة للضوء في Bbs4 نموذج الفأر -null. تحليل مخطط كهربية على الموجة يشير إلى أن الخلايا قضيب انقاذ لا يمكن تمييزها وظيفيا من النوع البري قضبان. وتبين هذه النتائج أن العلاج الجيني يمكن أن تمنع تنكس الشبكية في النموذج BBS الثدييات.

• ciliopathies
• النقل داخل سوطي
• تخطيط كهربية الشبكية

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) يتم تشخيص سريريا من خلال وجود أربعة على الأقل من العلامات التالية: ضمور شبكية العين، polydactyly، والسمنة، وصعوبات التعلم، قصور الغدد التناسلية الذكور، والشذوذ الكلوي (1). من هذه، والنمط الظاهري البصرية مدمر على وجه الخصوص: فإن متوسط ​​BBS المريض التقدم إلى العمى القانوني قبل له أو عيد ميلادها ال16. يوجد حاليا 15 المواضع الجينية (أون لاين الوراثة مندلية في مان # 209900) التي هي معروفة لتترافق مع BBS، وعلى الرغم من وراثة هذا المرض كان يعتقد مرة واحدة لمتابعة جسمية نمط المتنحية الكلاسيكية، وتشير الأدلة مؤخرا أن نمطا أكثر تعقيدا، ووصف "الميراث triallelic"، ويشارك في بعض مواضع BBS (2). وقد ظهرت أدلة فقط خلال العقد الماضي أن البروتينات BBS تلعب دورا في وظيفة الهدبية (3). وبشكل أكثر تحديدا، Bbs4 ومكونات BBSome أخرى يبدو أن تشارك في كل من تجنيد البضائع نحو الجسم الهدبي القاعدية (4، 5) والنقل intraflagellar على طول هدب (5 - +7). وتوضيح عدة تقارير الآليات التي تعطل بروتينات BBS تؤدي إلى الظواهر الفردية ينظر في هذه المتلازمة عديد المظاهر غاية (8 - 11).
تنكس الشبكية هو سمة أساسية من جميع النماذج BBS الماوس ولدت حتى الآن (8، +12 - 16). في قضيب ومخروط المستقبلات الضوئية، وربط هدب هو بنية الهدبية درجة عالية من التخصص الذي يخدم كقناة الوحيدة من قطاع الداخلي إلى الجزء الخارجي. لأن تخليق البروتين يحدث الأقرب إلى الجزء الخارجي، رودوبسين والبروتينات البصرية الأخرى يجب أن يتم الاتجار بهن من خلال هدب ربط للوصول إلى موقع عملها في الجزء الخارجي. عبد البر وآخرون. (11) أظهر أنه عندما تم حذف Bbs4 في الفئران، رودوبسين ومخروط opsins أصبح mislocalized بشكل صارخ في قضيب ومخروط المستقبلات الضوئية، على التوالي. وأعقب ذلك أفكارك الموت مبصرة وتدهور مخطط كهربية (أرج) موجات ب أ- و(14). وكشف تحليل التركيبية قضبان من الحيوانات الصغيرة التي تربط أهداب والهياكل القاعدية التي تظهر الجسم الطبيعي. هذا الاستنتاج الأخير له انعكاسات هامة على العلاج الجيني: لأن جهاز النقل الهيكلي يبدو أن تتطور بشكل طبيعي في خلايا مستقبلة للضوء Bbs4 -null، ونحن افترضنا أن مكملات ما بعد الولادة من الجين Bbs4 في قضبان شأنه انقاذ رودوبسين mislocalization ومنع قضيب الموت مبصرة.
لاختبار الفرضية لدينا، اخترنا فيروس الغدة المرتبطة-pseudotyped (AAV) كناقل التسليم. AAV المرغوب فيه ميزات كثيرة باعتباره الشبكية العلاج الجيني ناقلات، بما في ذلك المناعية منخفضة (17)، الكفاءة تنبيغ عالية (18)، والتعبير التحوير على المدى الطويل (19)، وtropisms محددة تعتمد على المصلي الخلوية (20). وعلاوة على ذلك، بيانات من ثلاث مراحل التاريخية الأولى من التجارب السريرية تشير إلى أن AAV ديه صورة ممتازة سلامة في البشر (+21 - 23). هنا، نحن تصف نتائج بوساطة AAV تسليم Bbs4 إلى قضبان من الفئران Bbs4 -null. وتوضح النتائج التي توصلنا إليها أن العلاج الجيني يمكن انقاذ رودوبسين mislocalization في هذا النموذج الماوس BBS والحفاظ العادي تقريبا قضيب التشكل الجزء الخارجي. وعلاوة على ذلك، معالجتنا يمنع الموت مبصرة، ويحسن وظيفة الكهربية من شبكية العين، ويحافظ على الاستجابات السلوكية أثار بصريا. وتشير هذه البيانات من نموذج الثدييات التي BBS المرتبطة تنكس الشبكية يمكن علاجها.

القسم السابق القسم التالي

النتائج

تنكس الشبكية في Bbs4 -Null ماوس.

أجرينا دراسات تشريحية وظيفية في Bbs4 الفئران -null والنوع البري تتزاحم للحصول على القيم الأساسية قبل التجارب نجدتنا. في البرية من نوع شبكية العين، المناعى تلطيخ رودوبسين (الأحمر) مترجمة إلى منطقة الجزء الخارجي من المستقبلات الضوئية قضيب وكان غائبا تماما عن الطبقة النووية الخارجي (ONL) (الشكل 1 A، 8 أسبوع من العمر). تم العثور على رودوبسين أيضا في منطقة الجزء الخارجي من العمر المتطابقة Bbs4 -null (- / -) شبكية العين، ولكن هذا كان يرافقه mislocalized جزيئات رودوبسين التي تميل إلى تشكيل أنماط حلقية (الشكل 1 B. حول نواة مبصرة الفردي (، النصال) الأزرق). الشكل. 1 C يوضح الفقدان التدريجي للنوى مستقبلة للضوء في شبكية العين BBS، والبعض الآخر الذي قد أظهرت أن تحدث من خلال موت الخلايا المبرمج (11، 12). في 2 أسبوع من عمر - / - شبكية العين أظهر بالفعل دليل على فقدان مبصرة (سبعة إلى ثمانية نوى في العمود ONL) مقارنة مع + / + ضبط نفس العمر الذي كان 10-11 نوى سميكة فقط. الموت مستقبلة للضوء في - / - شبكية العين تقدما مطردا على مر الزمن، وظلت 1-2 فقط نوى في العمود ...... قل في 16 أسبوع. وكانت الشبكية أقصر وأكثر غير متجانسة من + / + شرائح الخارجي في أقرب نقطة زمنية بحثت وكانت لا يمكن التعرف عليها تماما من قبل 16 أسبوع - شرائح الخارجي في - /.

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 1.

رودوبسين mislocalization وتنكس الشبكية في الفئران Bbs4 -null. Immunolocalization من رودوبسين (الأحمر) في القديم 8-أسبوع-من النوع البري (A) وBbs4 - / - (B) شبكية العين. Topro-3 (الأزرق) يمثل نواة، والسلطة الوطنية الفلسطينية (الأخضر) يحدد الأغماد مخروط. النصال في B تشير مبصرات قضيب الذي يحمل رودوبسين mislocalized. وتوضح (C) Photomicrographs الفقدان التدريجي للخلايا مستقبلة للضوء في ONL من Bbs4 - / - شبكية العين، مع أقسام من النوع البري على طرفي للمقارنة. (D-F) التوهين من أرج يصاحب فقدان مبصرة. في 8 أسبوع، Bbs4 - / - (الأحمر) الاستجابات هي أصغر بكثير من النوع البري تتزاحم (الأسود) في شدة فلاش انتزاع إما قضيب فقط (D) أو مختلطة قضيب مخروط (E) ردود F هو تضخم عالية. نظرا لوجود موجة حواف الرائدة في اثنين من كثافات مختلفة، مع نموذج photoresponse تركيبها على البيانات (آثار المنقطة). شدة فلاش في سجل الاسكتلندي مؤتمر نزع السلاح * ق / م 2 هي -3.65، -2.93، -2.08، -0.89 و لD؛ 3.45 لE؛ 2.10 و3.45 لF. (أشرطة النطاق، 20 ميكرومتر في A و B، و 10 ميكرون في C).

أجرينا ERGs لقياس وظيفة الشبكية في Bbs4 الفئران -null مع مرور الوقت. في جميع الأعمار وشدة فلاش فحصها، وسعة A و B موجة الموهن بشدة في - / - الفئران (آثار حمراء اللون) مقارنة مع + / + الضوابط (آثار سوداء). وأظهرت البيانات القديمة 8-أسبوع-تمثيلية للقضيب فقط (الشكل 1 D) والمختلط قضيب مخروط (الشكل 1 E) الاستجابات. لبالحدود وphotoresponses قضيب، أجرينا نوبة الفرقة من طراز photocurrent Cideciyan-جاكوبسون (24) ضد أرج البيانات على بعد موجة من اثنين من شدة فلاش مختلفة. الشكل. 1 F يظهر على الموجة الحواف الأمامية من ممثل - / - العين (يمين) الذي هو أقل في كل من السعة وحساسية مقارنة مع عنصر تحكم من النوع البري العين يقابل عمر (يسار) استجابة قضيب.

التعبير عن AAV الجينات المحورة.

وقد أظهرت التوصيف السابق من هذا نموذج الفأر أن مخروط أوبسين mislocalization شديد من قبل 2 أسبوع من العمر (11)، والموهن مخروط ERGs بنسبة 88٪ في 4 أسبوع (14). لهذه الأسباب، اخترنا لتوجيه جهودنا العلاج الجيني نحو إنقاذ مبصرات قضيب، والتي لها بالطبع أبطأ من انحطاط. كنا على بعد التكميلي النفس الغدة المرتبطة بفيروس pseudotyped (scAAV5) التي تحتوي على المروج الماوس أوبسين (MOP) لدفع تعبير قوي في قضبان (25). واستخدمت اثنين من بنيات الفيروسية في هذه الدراسة: فيروس تحكم يحتوي GFP (المشار إليه فيما scAAV5-MOP-GFP) وفيروس العلاجية التي تحتوي على الماوس Bbs4 الجينات مع علامة HA N-الطرفية (scAAV5-MOP-BBS4). في أيدينا، أدى حقن تحت الشبكية من 1.1 ميكرولتر من scAAV5-MOP-GFP إلى البرية من نوع الماوس العين في منطقة المترجمة من التعبير GFP (الشكل 2 A) التي تغطي 4.8٪ ± 1.1٪ من شبكية العين (يعني ± SEM ، ن = 6). كان تنبيغ من الخلايا قضيب داخل تلك المناطق فعالة للغاية، مع ما يقرب من 100٪ من الخلايا قضيب معربا عن GFP على مقربة من موقع الحقن (الشكل 2 B ط). في المقابل، مبصرات مخروط (النصال في الشكل 2 B ط، إشارة حمراء في الشكل 2 B كانت ب) معربا عن GFP الحالية ولكنها نادرة. وقد تم تحديد الأقماع عن طريق فحص المقاطع البصرية مسلسل من شبكية العين مسطحة شنت ملطخة-رودامين مترافق الفول السوداني راصة (PNA) (فيلم S1).

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 2.

التعبير التحوير بعد الحقن تحت الشبكية من AAV. (A) flatmount الشبكية 4 مو بعد الحقن scAAV5-MOP-GFP كشفت مترجمة التعبير الجيني فقط بالقرب من موقع الحقن. (شريط مقياس، 1 ملم.) (بي) متحد البؤر صورة من الجزء العلوي من ONL تظهر قضبان (الأخضر من GFP) والمخاريط (زنازين مظلمة تميزت السهام). وقد تم تحديد الأقماع التي تلطيخ رودامين-السلطة الوطنية الفلسطينية في المقاطع البصرية التسلسلية. (شريط مقياس، 10 ميكرون.) (BII) شرائح الداخلية ينتمون إلى ثلاثة مخاريط (PNA) هي الوحيدة التي لا تعبر عن GFP. (شريط مقياس، 5 ميكرون.) (C) تحليل لطخة غربية لعينة الشبكية حقن AAV تحمل بناء HA-Bbs4 يظهر الفرقة HA-مناعيا قرب 59 كيلو دالتون الذي هو غائب في العينة الضابطة uninjected. (D) بوساطة AAV Bbs4 التعبير يموضع في المقام الأول إلى قطاعات الداخلية والقطاعات الخارجية القريبة (النجمة)، في حين ينظر لا يوجد مثل هذا في تلطيخ الضوابط uninjected. (مقياس شريط 20 ميكرون) الحق: ويرد إشارة رودوبسين لتحديد نظام التشغيل / IS الحدود. أجريت جميع التجارب في ظاهريا الضوابط العادية (Bbs4 + / + أو Bbs4 +/-). Topro-3، وصمة عار النووية؛ السلطة الوطنية الفلسطينية، مخروط غمد علامة. OS، الجزء الخارجي؛ هو، الجزء الداخلي. اوبل، طبقة ضفيري الخارجي.

حقن لدينا scAAV5-MOP-BBS4 بناء إلى نجم الفضاء تحت الشبكية في واحدة الفرقة HA-مناعيا لطخة غربية (الشكل 2 C). وتقع هذه الفرقة، التي كانت غائبة في العينة الضابطة uninjected، في ≈59 كيلو دالتون، الكتلة الجزيئية المتوقع لBbs4 (UniProt # Q8C1Z7) مع علامة HA. لتحديد توطين التحت خلوية من البروتين الفيروسي Bbs4، أجرينا المناعية على المقاطع vibratome 40 ميكرون. تظاهر شبكية العين حقن scAAV5-MOP-BBS4 الفرقة واضحة لتلطيخ منقط HA-الإيجابي (النجمة) التي لم يكن ينظر في شبكية العين السيطرة uninjected (الشكل 2 D). وكانت هذه الفرقة من تلطيخ الأكثر كثافة في المنطقة الواقعة بين الجزء الداخلية نوى مبصرة (ONL) و-رودوبسين الغنية قطاعات الخارجي (الشكل 2D.، يمين). ولكن لوحظت بعض punctae على هامش القريبة من طبقة الجزء الخارجي. هذه البيانات متوافقة مع التعريب الأنسجة من البروتين الذاتية (4، 11)، وكذلك الملاحظات من تجارب زراعة الخلية التي BBS4 يمكن العثور عليها على حد سواء داخل هدب (5) وعلى الأقمار الصناعية مريكزي (4، 5).

إنقاذ رهودوبسن Mislocalization.

بعد إنشاء توطين التحت خلوية من الفيروسية Bbs4، نحن مصممون المقبل ما إذا كان لدينا الجين العلاج العلاج يمكن أن يمنع رودوبسين mislocalization. عولجت فئران Bbs4 القديمة اسبوعين -null عن طريق الحقن تحت الشبكية من scAAV5-MOP-BBS4 في hemiretina الزماني للعين واحدة. في 12 أسبوع من العمر، وقطعت أقسام ناظم البرد الأفقية التي تحتوي على المنطقة المعالجة الفيروس في النصف الصدغي من هذا الباب، والمنطقة ضابطة في النصف الأنف. وأشار المناعية أن نسبة خلايا مستقبلة للضوء مع الحلقي mislocalized رودوبسين تلطيخ (السهام) كانت أقل في المناطق المعالجة (الشكل 3 A) مقارنة مع المناطق غير المعالجة (الشكل 3 B). النسب المئوية في معاملة مقابل المناطق غير المعالجة لشبكية العين ثلاثة فحص (الشكل 3 C كانت) 0.30٪ مقابل 4.19٪ (P <0.0001)، 0.23٪ مقابل 1.58٪ (P <0.01)، وبنسبة 0.09٪ مقابل 2.30 ٪ (P <0.0001). تم إحصاء ما لا يقل عن 600 خلايا ...... قل في كل منطقة، وكان يحسب أهمية باستخدام اختبار χ 2 لجدول طوارئ 2 × 2.

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 3.

scAAV5-MOP-BBS4 ينقذ رودوبسين mislocalization ويعيد التشكل الجزء الخارجي. المعالجة (A) وغير المعالجة (B) مناطق نفس الشبكية تظهر اختلافات واضحة في نسبة خلايا مستقبلة للضوء مع رودوبسين mislocalized (السهام). إشارة حمراء مباشرة أسفل ONL تمثل سمة غير محددة تلطيخ هذه الأجسام المضادة (الشكل 1 A). نلاحظ أيضا أن ONL هو أكثر سمكا كبيرا في الشبكية المعالجة (A). الأحمر، رودوبسين؛ الأزرق، وصمة عار النووية Topro-3. (. أشرطة النطاق، 20 ميكرومتر) (C) في كل شبكية العين ثلاثة درست في هذا العصر، وكانت النسبة المئوية للخلايا مستقبلة للضوء واظهار رودوبسين mislocalization أقل من ذلك بكثير في معاملة مقابل المناطق غير المعالجة (* P <0.01 **؛ P <0.0001؛ أهمية محسوبة بواسطة χ 2 الاختبار لجدول طوارئ 2 × 2). (D) الأقاليم من Bbs4 - / - شبكية العين تعامل مع scAAV5-MOP-BBS4 الواردة قطاعات الخارجية التي كانت مشابهة لافت للنظر في WT قطاعات الخارجي. في غير المعالجة السيطرة Bbs4 - / - شبكية العين، وقطاعات الخارجي لا يمكن التعرف عليها في 16 أسبوع من العمر. (شريط مقياس، 10 ميكرون). OS، الجزء الخارجي؛ هو، الجزء الداخلي. INL، طبقة النووية الداخلية.

كما أظهرت قطاعات الخارجي في Bbs4 شبكية العين -null التحسن بعد العلاج مع scAAV5-MOP-BBS4. تعامل - / - الفئران قتل في 16 أسبوع أظهرت بقع كثيفة، شرائح الخارجي متجانسة في hemiretina الزمانية قياس 20.7 ± 0.52 ميكرومتر في الطول (يعني ± SEM، ن = 12) (الشكل 3 D.، يمين). وكانت هذه مشابهة لمن النوع البري قطاعات الخارجي (الشكل 3D، يسار) في كل من المظهر وطول (22.6 ± 0.21 ميكرون، ن = 12). قطاعات الخارجي من دون علاج - / - شبكية العين، في المقابل، كانت متفرق، غير متجانسة، وقصيرة (13.1 ± 0.44 ميكرون، ن = 12) في 4 أسبوع والتعرف عليها في 16 أسبوع (الشكل 3 D.، مركز لليسار ويمين مركز).

مبصرة الإنقاذ.

لتحديد ما إذا كان العلاج الجيني يمكن أن يمنع موت الخلايا المستقبلة للضوء في شبكية العين -null Bbs4، أحصينا عدد الأنوية المتبقية في الأعمدة الخلوية من ONL. الشكل. 4 يظهر كلتا العينين من - / - الماوس العلاج في 2 أسبوع وقتل في 16 أسبوع. تلقت العين اليسرى لحقن scAAV5-MOP-BBS4 الزمني، في حين أن العين اليمنى تلقت حقن scAAV5-MOP-GFP الزمني، وترك أجزاء الأنف كل من شبكية العين غير مصورة على أي فيروس. خرائط الحرارة من سمك فقط. t (الشكل 4 أ) تدل بوضوح على المنطقة المحلية في النصف الصدغي للعين اليسرى، حيث كان ONL أربع إلى ست نوى مستقبلة للضوء في السمك. هذه المنطقة تقابل بالضبط إلى جزء من شبكية العين تتعرض لفيروس Bbs4 العلاجي. مناطق لا يتلقى الفيروس العلاجي (أي النصف الأنف للعين اليسرى وكل شطر من العين اليمنى) قد شهد انحطاط لا هوادة فيه أن ترك طبقة مبصرة 1-2 فقط نوى سميكة. Photomicrographs (الشكل 4 B) من المواقع الخمسة المشار إليها في خرائط الحرارة توضح تناقض صارخ بين - / - شبكية العين مع وبدون العلاج العلاج الجيني. المناطق المعالجة (الأول والثاني) لديها ONL سمكا بكثير جنبا إلى جنب مع ما يقرب من المعتاد الظهور-شرائح الخارجي، في حين أن المناطق غير المعالجة (الثالث إلى الخامس) لديها ONL رقيقة متجانس وليس قطاعات الخارجي.

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 4.

العلاج مع scAAV5-MOP-BBS4 يمنع الموت مبصرة. (A) في 16 أسبوع، مبصرة البقاء على قيد الحياة وتقييمها من قبل طبقة النووية الخارجي (ONL) سمك في أقسام أفقية تحتوي على العصب البصري. خرائط الحرارة تشير إلى طبقة سميكة الخارجي النووية (الأحمر) في موقع الحقن scAAV5-MOP-BBS4، والطبقة النووية الخارجي رقيقة (الأزرق) في جميع المناطق الأخرى. (B) Photomicrographs من المعالجة (الأول والثاني) وغير المعالجة (من الثالث الى الخامس) مواقع مبين في A. (شريط مقياس، 10 ميكرون). وأصبحت قطاعات الخارجي في BII عازمة أثناء التثبيت وتظهر في المقطع العرضي. هو، الجزء الداخلي. OS، الجزء الخارجي؛ INL، طبقة النووية الداخلية.

كان نمط المترجمة سمك فقط. t في المنطقة تعامل مع scAAV5-MOP-BBS4 متناسقة عبر جميع شبكية العين فحصها. تضمين هذا حيوانين قتل في 12 أسبوع (التين. S1 و S2)، واثنين من الحيوانات قتل في 16 أسبوع (الشكل 4 والشكل S3)، واحد حيوان قتل في 45 أسبوع (الشكل. S4). كان هذا أقدم الحيوانات ذات أهمية خاصة لأن العين غير المعالجة الواردة على الإطلاق أي خلايا مستقبلة للضوء، في حين أن المنطقة الزمنية للعين المعالجة كان ستة إلى سبعة صفوف من خلايا مستقبلة للضوء في أنحف نقطة فيه.

تحسين وظيفي من الرؤية.

لتقييم وظيفة قضيب في شبكية العين -null Bbs4 بعد العلاج الجيني، أجرينا ERGs ومعلمات الردود على الموجة باستخدام المربعات الصغرى يصلح للphotocurrent نموذج Cideciyan-جاكوبسون (المعادلة 1). أنتج هذا التحليل اتساع (R كحد أقصى) والحساسية (σ) قيمة لوصف استجابة قضيب من كل عين. الشكل. 5 A يدل على البيانات الفعلية على الموجة (آثار الصلبة) في اثنين من كثافات مختلفة ومنحنيات المجهزة (آثار متقطع) لمدة 12 فالتر كالين من العمر - / - الفأر مع عين واحدة تعامل (يسار) ودون علاج البعض (يمين).

• في نافذة جديدة

• تحميل PPT

تين. 5.

تحليل ERG موجة بعد العلاج scAAV5-MOP-BBS4. (A) التمثيلية 12 أسبوع من موجة الحواف الأمامية وآثار نموذج المجهزة (الخطوط المنقطة) للتعامل (يسار) والتحكم (يمين) عيون Bbs4 - / - الماوس. (B) وعاد إجراءات تركيب نموذج السعة (R كحد أقصى) والحساسية (σ) معلمات للعيون اختبارها في 4 و 8 و 12 و 16 أسبوع. وتظهر عيون الفردية رموز المفتوحة (الأزرق وscAAV5-MOP-BBS4، الأحمر وscAAV5-MOP-GFP أو أي حقن)، وتمثل الرموز شغل المتوسطات (أشرطة الخطأ = SEM). المتوسطات مجموعة مختلفة إحصائيا في 8 و 12 و 16 أسبوع (الجدول 1). وتظهر (C) متوسط ​​R ماكس واستخدمت القيم سيجما من B كمدخلات لنموذج photocurrent، وآثار الإخراج لكل نقطة من النقاط الزمنية الأربعة التي تم فحصها.

بعد العلاج في 2 أسبوع من العمر، وقد تم تحليل ERG على موجات في 4 و 8 و 12 و 16 أسبوع. يتم عرض البيانات في الشكل. 5 B، مع كل من الفردية عيون (رموز فتح) ومتوسط ​​القيم (رموز شغل) هو مبين. في جميع نقاط الوقت الأربعة، وكان يعامل عيون (scAAV5-MOP-BBS4) في المتوسط ​​على حد سواء أعلى سعة وحساسية أعلى من عيون التحكم (scAAV5-MOP-GFP أو uninjected). كان الفرق بين عيون المعالجة والسيطرة صغير في 4 أسبوع لكن نما أوسع وصلت دلالة إحصائية عند كل نقطة زمنية لاحقة الثلاث (الجدول 1). أهمية خاصة هو حقيقة أن متوسط ​​حساسية العينين تعامل زاد فعلا من 12 إلى 16 أسبوع، لتصل إلى قيمة 3.80 ± 0.077 سجل الاسكتلندي مؤتمر نزع السلاح -1 م 2 ق -3 (يعني ± SEM، ن = 15). وكانت هذه القيمة يمكن تمييزها تقريبا من قيمة من النوع البري العمر المتطابقة من 3.83 ± 0.064 (ن = 6). قيم متوسط ​​R ماكس وσ من الشكل. 5 B تم استبداله في المعادلة 1 لإنتاج متوسط ​​حواف الموجة الرائدة لكلا الفريقين (الشكل 5 C) في جميع نقاط الوقت الأربعة (4 أسبوع يسار، 16 أسبوع اليمين). لاحظ أسرع الارتفاع الوقت وزيادة سعة المعالجة (الأزرق) يتتبع في جميع الأوقات. ومن المثير للاهتمام، وظل الفرق السعة بين المعالجة ومراقبة ثابتة نسبيا على مر الزمن، على الرغم من العمليتين انخفضت في السعة المطلقة (مناقشة).

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

الجدول 1.

مخطط كهربية على الموجة تحليل

أجرينا أيضا حركة العين استجابة (OKR) اختبار لتحديد ما إذا كانت المنطقة محدودة من شبكية العين الحفاظ كافية للحصول على رد السلوكية أثار بصريا. تم اختبار ما مجموعه تسعة الفئران (تتراوح أعمارهم بين 9-11 شهر)، بعد أن تلقى كل حيوان لحقن scAAV5-MOP-BBS4 أحادي في 2 أسبوع من العمر. كشفت التجارب الأولية في ظل ظروف ظلامية أن أربعة من تسعة عيون المعالجة يمكن أن انتزاع OKR إيجابي، في حين كان ينظر توجد مثل هذه الاستجابة لأي من أعين غير المعالجة المقابل. مزيد من الاختبارات السلوكية ويجري حاليا.

القسم السابق القسم التالي

نقاش

نحن هنا تقديم دليل على أن العلاج الجيني يمكن أن تمنع بصمات مرضية الرئيسية التي توجد في شبكية العين -null Bbs4 (11، 13، 14). على وجه التحديد، والتعبير Bbs4 الفيروسي في المستقبلات الضوئية قضيب ينقذ رودوبسين mislocalization ويحافظ على قضيب قطاعات الخارجية التي تظهر صحية. يتم منع الموت مستقبلة للضوء في المناطق تلقي العلاج الجيني العلاج، في حين أن المناطق غير المعالجة تتحول بسرعة. نحن تأكدت هذه النتائج التشريحية التي كتبها تخطيط كهربية الشبكية والسلوك. أظهرت ردود قضيب أرج أكبر سعة وارتفاع حساسية في العينين تعامل مقابل الضوابط غير المعالجة، وكانت أثارت OKRs إيجابية من بعض العيون المعالجة ولكن لا علاج الضوابط. بشكل جماعي، وتشير هذه النتائج إلى أن العلاج الجيني هو نهج ممكنا لعلاج العمى في المرضى الذين يعانون BBS البشري. على أساس نجاحنا في استكمال هذا الجين Bbs4، يبدو من المرجح جدا أن أشكالا أخرى من BBS، وخصوصا تلك التي ترتبط جزيئيا إلى BBSome (5)، وسوف تكون أيضا أهدافا مناسبة للعلاج بالجينات. والشيء نفسه يمكن أن ينطبق على ciliopathies الشبكية الأخرى، بما في ذلك متلازمة حاجب، متلازمة جوبير، متلازمة العليا-لوكن، وبعض أشكال يبر كمنة خلقية (26). وعلاوة على ذلك، لأنه يعتقد السمنة في BBS أيضا أن يحدث بواسطة آلية البروتين mislocalization مماثلة تنطوي على مستقبلات هرمون الليبتين في الخلايا العصبية المهاد (9)، فمن الممكن أن بعض أشكال السمنة المتلازمات قد تكون أيضا المرشحين للعلاج بالجينات.
في أيدينا، أدى حقن تحت الشبكية من scAAV5-MOP-GFP في GFP التعبير بمتوسط ​​تغطية شبكية العين من 4.8٪ فقط. على الرغم من أن هذا هو أقل مساحة من وقدر الآخرين، حققنا مرتفعة للغاية قضيب تنبيغ داخل منطقة التغطية (تقترب من 100٪ قرب موقع الحقن) والأحداث السلبية التقليل الناتجة عن الإصابات الميكانيكية للأنسجة. كان نمط تغطية الفيروسي من المفيد لدراستنا: أنها قدمت الرقابة الداخلية مريحة عند دراسة المعالجة (الزمانية) وغير المعالجة (الأنف) مناطق أقسام الشبكية عرضية. وعلاوة على ذلك، لأن تنبيغ من الخلايا قضيب كان ما يقرب من 100٪ محليا وغائبة في المناطق البعيدة، وكانت آثار نسيجية للفيروس جلية واضحة. لأسباب سبق ذكرها، اخترنا الماوس أوبسين المروج أن نركز جهودنا على إنقاذ مبصرات قضيب. ونتيجة لذلك، أدى لدينا بناء الفيروسي العلاجية إلى تحسن واضح في نظام قضيب ولكن تحسين مخروط قليلا. ومع ذلك، ونظرا لأوسع نافذة الوقت العلاجية والمروج المناسب (+27 - +29)، وليس هناك سبب واضح لماذا لا يمكن أيضا أن أنقذ المخاريط. على عكس الفأر المستخدمة في هذه الدراسة، وBbs1 M390R ديه knockin عادية نسبيا مخروط أرج وظيفة في 11 أسبوع من العمر (16)، وبالتالي قد يكون نموذجا مناسبا للتقييم المستقبلي لإنقاذ مخروط.
على الرغم من أن دور الجزيئي الدقيق للBbs4 والبروتينات BBS أخرى في المستقبلات الضوئية ليست مفهومة تماما [انظر زغلول وKatsanis (30) لمراجعة]، والكثير من النقاط الأدب دورا في الاتجار داخل الخلايا البروتين والتعريب في المنطقة المجاورة لل الجسم الهدبي القاعدية. ملاحظتنا التعبير Bbs4 الفيروسي في الجزء الداخلي والجزء الخارجي القريب يتسق تماما مع هذه الفكرة. كان قادرا على عكس النمط الظاهري تنميط رودوبسين mislocalization ينظر في عدة نماذج BBS الماوس (ScAAV5-MOP-BBS4 11، 12، 15)، وكذلك نماذج الأخرى التي تم حذفها البروتينات الهدبية (31، 32). وليس من الواضح تماما ما إذا mislocalization رودوبسين في هذا النموذج هو نتيجة مباشرة لBbs4 حذف أو بالأحرى إهانة الثانوية الناجمة عن انحطاط مبصرة. هذا التمييز، ومع ذلك، لا تحدث أثرا يذكر لهذه الدراسة. تم العثور رودوبسين mislocalization أن تسبق الموت مبصرة أفكارك في Bbs2 - وBbs4 نماذج الماوس -null (11، 12)، وذلك على أساس لدينا وجدت أن عمليات الإنقاذ العلاج الجيني رودوبسين mislocalization، وكنا نتوقع تماما أن العلاج الجيني من شأنه أيضا أن يمنع الموت مبصرة . والواقع أن هذه القضية: أدى الحقن الموضعي للscAAV5-MOP-BBS4 في 2 أسبوع من العمر في المترجمة الإنقاذ مبصرة التي لا تزال قائمة حتى حتى بحثت نقطة زمنية مشاركة (45 أسبوع). على العكس، المناطق غير المعالجة تدهورت بشكل مطرد حتى بلغت خسائر مبصرة كاملة. ولذلك أنشأنا التي نافذة علاجية موجود في الماوس -null Bbs4 خلالها عملية مرض شبكية العين هو عكسها.
تحليل كامل الحقل أرج على الموجة باستخدام نموذج Cideciyan-جاكوبسون (24) أثبتت أن لديها حساسية بشكل ملحوظ في هذه الدراسة. دون الحاجة إلى استخدام تقنية أرج متعددة البؤر كنا قادرين على ملاحظة هامة للغاية (P <0.0001) تحسن في وظيفة قضيب الرغم من الحقن تحت الشبكية لدينا تغطي سوى 5٪ من شبكية العين. إمكانية أرج القرنية هي محصلة جميع التيارات خارج الخلية الشعاعية في العين، لذلك لدينا في فوج من العيون تعامل مع scAAV5-MOP-BBS4 افترضنا أن أرج يمثل تركيبة خطية من 5٪ الصحية (المعالجة) شبكية العين و 95٪ المنحطة (غير المعالجة) شبكية العين. السعة القصوى لالموجة، R كحد أقصى، ويرتبط إلى مجموع الظلام الحالي المتداول في قطاعات الخارجي في وقت ظهور ضوء (33)، وبالتالي من المتوقع أن ينخفض ​​في هذا النموذج الماوس كما تفقد قطاعات الخارجي بسبب وفاة مبصرة . لدينا بيانات على الموجة (الشكل 5 C) تبين أن R كحد أقصى في التعامل مع عيون انخفاض 4-16 أسبوع ولكن أكبر من R الحد الأقصى من أعين الرقابة غير المعالجة في كل نقطة زمنية. الأهم من ذلك، والفرق السعة بين المجموعتين التجريبية هو ثابت تقريبا. الفرق ثابت يشير إلى أن عيون المعالجة لديها عدد قليل من السكان انقاذ قطاعات الخارجية التي تبقى في صحة جيدة على مر الزمن (الشكل 4 B i و B II) والإسهام بشكل مطرد إلى والموجة. هذا، ومع ذلك، يتم فرضه على إشارة الخلفية الكبيرة القادمة من شرائح الخارجي غير الصحية التي تتدهور مع مرور الوقت.
معتمد لدينا الخطية الجمع الفرضية أيضا بالتغيرات في حساسية على الموجة (σ) على مر الزمن. شادي وآخرون. (34) خلصت من مرضى التهاب الشبكية الصباغي البشري الذي قضيب انحطاط أدى إلى تخفيض تدريجي من التضخيم تنبيغ، وهي كمية ترتبط ارتباطا وثيقا المعلمة حساسية عنها في هذه الدراسة. وتبين لنا أن حساسية قضيب في غير المعالجة Bbs4 عيون -null تنخفض مفردة النغمة 4-16 أسبوع. في عيون المعالجة، إلا أن انخفاض حساسية 4-12 أسبوع، تليها زيادة ملحوظة من 12 إلى 16 أسبوع. ومن المثير للاهتمام خاصة أن حساسية العين العلاج في 16 أسبوع هي مشابهة جدا لحساسية النوع البري عيون العمر المتطابقة. في سياق نموذجنا الجمع الخطي، وتشير هذه البيانات إلى أن القفزة في حساسية بين 12 و 16 أسبوع يمثل الاختفاء التدريجي لل95٪ قضيب صحي إشارة وهيمنة الناشئة من 5٪ الصحية (المعالجة) قضبان مع قضيب عادية نسبيا المعلمات phototransduction. ويؤكد الحفاظ على الاستجابات السلوكية أثار بصريا من أربعة من تسعة عيون يعامل كذلك إلى أن عدد سكان قضبان الوظيفية نجا نتيجة العلاج لدينا. والحقيقة أن أي الفئران التي عولجت عرضت هذه الاستجابات السلوكية مفاجئا، بالنظر إلى مساحة محدودة من المستقبلات الضوئية انقاذهم. مزيد من الدراسات جارية حاليا لربط تشريحية، الكهربية، والإنقاذ السلوكي على مستوى الفرد العينين.
من منظور تجريبي لدينا عامل التغطية المتوسط ​​من 5٪ في حقن الفيروس كان أكثر من كافية لمراقبة مصلحة التشريحية والوظيفية، وبالتالي التحقق من فعالية لدينا بناء الفيروسي. في النماذج الحيوانية الكبيرة، والتغطية الشبكية من 20-30٪ يمكن تحقيقه بسهولة عن طريق الحقن تحت الشبكية (35، 36). إذا ترجم إلى موضوع الإنسان، أن 30٪ تحتوي على تغطية منطقة البقعة الصفراء لديها القدرة على الحفاظ على حدة البصر العادي تقريبا. شرط هام للعلاج بالجينات، ومع ذلك، هو التشخيص الوراثي في ​​الوقت المناسب قبل حدوث الموت مبصرة واسعة النطاق. وتشير الدراسات السريرية أن من بين المرضى BBS1، نصف فقط سيكون حدة البصر من 20/60 أو أفضل في وقت التشخيص. يبدو أن الوضع يكون أسوأ بالنسبة لأولئك مع BBS10 (37، 38). وهذا يؤكد على أهمية الوعي BBS في طب العيون والمجتمعات طبية واسعة النطاق. نتائجنا هي خطوة مشجعة أولى نحو الحفاظ على الرؤية في المرضى الذين يعانون BBS، ولكن النجاح النهائي لمثل هذا العلاج يتطلب جهد تعاوني بين الباحثين والأطباء متعدية يقظة.

القسم السابق القسم التالي

المواد والأساليب

التركيبات الفيروسية.

كامل طول كدنا] للماوس Bbs4 الجين (الانضمام لا. BC145771 تم الحصول عليها) من النظم البيولوجية فتح. تمت إضافة حاتمة العلامة HA (YPYDVPDYA) إلى N محطة من Bbs4، تليها ربط من HA- Bbs4 إلى البلازميد SC-MOPS500-hGFP في مكان hGFP. طريقة البلازميد ترنسفكأيشن باستخدام خلايا HEK293 كما هو موضح سابقا (39) تم استخدامه لإنتاج وتنقية scAAV2 / 5 ناقلات تحمل إما Bbs4 أو GFP. تم تحديد التتر الفيروسية التي كتبها في الوقت الحقيقي PCR كما هو موضح سابقا (40) وكانت 6.82 × 10 12 VG / مل لscAAV5-MOP-BBS4 و 3.64 × 10 12 VG / مل لscAAV5-MOP-GFP.

الحيوانات وتحت الشبكية الحقن.

تم إنشاؤها الفئران Bbs4 -null كما (هو موضح سابقا 8). وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في كلية بايلور للطب. وترد تفاصيل تقنية الحقن تحت الشبكية بطريق الصلبة في مواد SI وطرق.

الأنسجة وImmunoblotting.

تم تنفيذ طرق كما هو موضح سابقا (11) مع تعديلات طفيفة. كانت ملطخة أقسام المجمدة عشرة ميكرومتر مع 1: 1000 لمكافحة رودوبسين (استنساخ RET-P1؛ Neomarkers) ماب ودابي. لتحديد HA-BBS4، 1: تم استخدام 1000 التخفيف من مكافحة HA ماب (16B12 استنساخ؛ كوفانس). لالمجهر الضوئي، كانت ملطخة أقسام الإي بي 1 ميكرومتر مع الميثيلين الأزرق الفوكسين والأساسي. لخلق تمثيل خريطة الحرارة، تم تقسيم الصور الرقمية بشكل متساو إلى 32 مناطق في hemiretina. تم تحديد قيمة سمك لكل منطقة عن طريق حساب متوسط ​​ثلاث تهم من النوى الموجودة في عمود فقط.

اختبار الرؤية وظيفية.

تم تخدير الفئران عن طريق الحقن الملكية الفكرية من 51 ملغم / كغم من الكيتامين، 10 ملغ / كغ زيلازين، و 0.86 ملغم / كغم آسيبرومازين، وسجلت ERGs كما هو موضح سابقا (11). وعلى غرار A-موجة الرائدة الحواف باستخدام طريقة وصفها Cideciyan وجاكوبسون (24). لفترة وجيزة، تم تسجيل ERGs الظلام تكييفها استجابة لاثنين من ومضات مشرقة (2.10 و 3.45 سجل الاسكتلندي * CD * ق / م 2)، والمعادلة التالية كان يصلح لكلا منحنيات وقت واحد باستخدام المربعات الصغرى التقليل: حيث I هي شدة فلاش، R كحد أقصى، وأقصى اتساع الاستجابة؛ σ، والحساسية؛ ور، مرة بعد بداية التحفيز. مزيد من المعلومات حول المعادلة. 1، منحنى البرنامج المناسب، واختبار OKR يمكن العثور عليها في مواد SI وطرق.

 

[رافت ابراهيم]

 

استخدام السكان المعزولين في دراسة لمتلازمة السمنة الإنسان، وبارديه-بيدل متلازمة

http://www.nature.com/pr/journal/v55...r2004140a.html


متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب وراثي عديد المظاهر مع الميزات الأساسية للسمنة، انحطاط مبصرة، polydactyly، نقص الأعضاء التناسلية، تشوهات الكلى، وتأخر في النمو. يرتبط النتائج السريرية الأخرى في المرضى الذين يعانون BBS تشمل مرض السكري وارتفاع ضغط الدم، وعيوب خلقية في القلب. ويستند التشخيص السريري على وجود أربعة على الأقل من الأعراض الرئيسية. ومن المسلم به BBS أن تكون جسمية رسم الخرائط اضطراب المتنحية غير المتجانسة وراثيا إلى ثمانية مواضع معروفة. وقد أدى استنساخ الموضعية والتقييم الجينات مرشح في تحديد ستة جينات BBS. طفرة واحدة من هذه الجينات، BBS6، كما يسبب متلازمة McKusick-كوفمان. ومن المتوقع الجين BBS6 إلى رمز للبروتين مع تشابه تسلسل لعائلة chaperonin من البروتينات. منتجات الجين توقع BBS1، BBS2، BBS4، BBS7، وBBS8 لا يبدو أن المحرمين الجزيئي، على أساس عدم وجود تشابه تسلسل لعائلة chaperonin من البروتينات. تحديد BBS8 يشير إلى وجود دور محتمل في وظيفة الأهداب للمنتجات الجين BBS. يبقى أن تحدد ما إذا كانت البروتينات BBS متعددة هي جزء من مجمع multisubunit أو لا تتفاعل مباشرة مع بعضها البعض ولكن هي جزء من مسار مشترك. وتوضح الدراسة من BBS قيمة استخدام السكان الفطرية المعزولة لدراسة الأمراض الجينية البشرية وتقترح استراتيجيات لتسهيل دراسة الأمراض المعقدة والصفات.

الاختصارات:

BBS، متلازمة بارديه-بيدل. MKS، متلازمة McKusick-كوفمان

وغالبا ما تنقسم الأمراض الوراثية إلى فئتين: تلك التي تعرض على وضع مندلية بسيطة من الميراث واضطرابات معقدة وراثيا التي لا تعرض الميراث مندلية. اضطرابات مندل هي نتيجة لشذوذ الجينات واحدة، في حين أن اضطرابات معقدة تنجم عن تفاعل اثنين على الأقل من الجينات و / أو الجينات والعوامل البيئية. الاضطرابات المندلية نادرة بشكل فردي ولكن توجد ل> 10،000 اضطرابات مندل تراكمي يكون لها تأثير كبير على الصحة، وخاصة في عدد من الأطفال. اضطرابات معقدة شائعة بشكل فردي. مع الانتهاء من مشروع الجينوم البشري، والموارد، والفرص، والتحديات القائمة لتعيين وظيفة لجميع الجينات. واحد مكون من وظيفة الجين فهم تماما هو إلقاء الأضواء على تورط الجينات الفردية في كل أحادية المنشأ ومعقدة الأمراض التي تصيب الإنسان. نهج واحد لفهم أفضل الفيزيولوجيا المرضية الجزيئي للاضطرابات معقدة هو التحقيق في الاضطرابات المندلية التي لها تداخل المظهري مع الأمراض المعقدة المشتركة. مختبرنا وقد طبقت هذه الاستراتيجية من خلال دراسة متلازمة بارديه-بيدل (BBS)، وهو اضطراب رائعة يعتقد مرة واحدة أن يكون جسمي موضع واحد اضطراب المتنحية ولكن ثبت الآن أن يكون المرض وراثيا غير المتجانسة الناجمة عن مواضع فردية متعددة ( 1 - 6). وعلاوة على ذلك، فقد كان هناك اقتراح مؤخرا أن بعض حالات BBS نتيجة من التفاعل بين اثنين أو أكثر من مواضع ( 7 - 10). بسبب عدم التجانس الوراثي واسعة النطاق والتعقيد الجيني ممكن، وقد استفادت الدراسة من BBS على نطاق واسع من توافر البشر معزولة يعانون من هذا الاضطراب.
في عام 1866، لورنس والقمر ( 11) وصفت متلازمة التي تتألف من تنكس الشبكية، قصور الغدد التناسلية، والتخلف العقلي، والشلل النصفي التشنجي. بارديه ( 12) وبيدل ( 13) وصفها بشكل مستقل متلازمة مماثلة مع ميزات إضافية من polydactyly والسمنة. وفي وقت لاحق، أحيلت إلى اضطراب في الأدبيات العلمية والطبية باسم متلازمة لورنس-مون بيدل ومتلازمة لورنس-مون بارديه-بيدل. وفي الآونة الأخيرة، فقد اعتبر متلازمة لورنس-مون بارديه-بيدل أن اثنين من اضطرابات متميزة، ومتلازمة لورنس مون ومتلازمة بارديه-بيدل ( 14). ومن المسلم به BBS الآن لديها ميزات الأولية من السمنة، polydactyly، اعتلال الشبكية الصباغي، قصور الغدد التناسلية، وتشوهات الكلى، وتأخر في النمو ( 14 - 17). ميزات الثانوية من BBS تشمل مرض السكري وارتفاع ضغط الدم، وعيوب خلقية في القلب ( 16، 18).
BBS أمر نادر الحدوث في معظم السكان (<1 / 100،000)، إلا أنه ذكر أن يحدث في حالات أعلى من ذلك بكثير في بعض السكان الفطرية المعزولة ( 19). والافتراض بأن الجينات المسؤولة عن BBS يمكن أن توفر أدلة على تحديد المسارات البيوكيميائية والتنموية تشارك في اضطرابات المشتركة والصفات مثل السمنة، فضلا عن توفير فهم إضافي من العمليات التنموية العادية.
أعلى الصفحة عدم التجانس الوراثي للBBS.

كان يعرف القليل عن سبب BBS، وتم تحديد أي الجينات BBS أو مواضع حتى بدأنا بدراسة اضطراب في السكان العرب البدو معزولة ( 1). ارتفاع معدل زواج الأقارب في هؤلاء السكان يؤدي إلى زيادة في وتيرة الاضطرابات الوراثية المتنحية ( 20). وقد تم تحديد ثلاث قبائل مع BBS بين البدو العرب في إسرائيل. وكان من المتوقع أن المعلومات الوراثية المشتركة المتاحة في هذه القبائل الثلاث من شأنه أن يجعل من الممكن تحديد وpositionally استنساخ الجين BBS. تظاهر مفاجئة، ودراسات الخرائط الوراثية أن الخلل تعيينها إلى منطقة مختلفة من الجينوم البشري في كل من قبائل البدو الثلاثة ( 1، 3، 4). وقد حددت العمل من قبل الولايات المتحدة وغيرها الآن ثمانية مواضع تشارك في BBS على الكروموسومات 11q13 (BBS1) ( 2)، 16q21 (BBS2) ( 1)، 3P (BBS3) ( 3)، 15q22.3-Q23 (BBS4) ( 4)، 2q31 (BBS5) ( 5)، 20p12 [BBS6. متلازمة McKusick-كوفمان (MKKS)] ( 21، 22)، 4P (BBS7) ( 23)، و14q32 (BBS8) ( 24). بالإضافة إلى ذلك، انعكاس pericentric من كروموسوم 1 (p36.3؛ Q23) وقد تم الإبلاغ عن أن يرتبط النمط الظاهري BBS في عدة أعضاء من الأسرة الممتدة واحدة ( 25).

التعرف على الجينات BBS.

وركزت الدراسات التي تهدف إلى تحديد الجينات المسؤولة عن BBS على صقل المواقف خريطة أماكن وتقييم الجينات المرشحة الموضعية داخل فترات معين. وقد أعاقت الاستنساخ الموضعية من الجينات BBS في البداية من قبل التباين الوراثي واسعة وعدم القدرة على التمييز بين مواضع المسبب بناء على تحليل المظهري. أدى التعرف على أول جين BBS من الاعتراف بأن BBS المشتركة الميزات المظهرية لمتلازمة McKusick-كوفمان (MKS). MKS هو اضطراب وراثي جسمي مقهور تتميز رتق المهبل مع موه رحمي مهبلي، polydactyly خلف المحور، وعيوب خلقية في القلب ( 26، 27). اقترح التداخل المظهري بين MKS وBBS أن الجين المسبب MKS سيكون الجينات المرشح المحتمل لBBS. تم تعيين MKS في البداية لكروموسوم 20p12 باستخدام السكان طائفة الأميش ( 28). وحددت في وقت لاحق هذا الجين المسبب للمرض باستخدام أساليب الاستنساخ الموضعية وبالنظر إلى MKKS اسم ( 29). على أساس التداخل المظهري بين BBS وMKS، تحديد مجموعتين بشكل مستقل ما مجموعه ستة الطفرات في الأسر BBS، مما يدل بشكل مقنع أن الطفرات في الجين السبب MKKS مجموعة فرعية صغيرة من الحالات BBS ( 21، 22). والآن غالبا ما يشار الجين MKKS باسم BBS6.
مختبرنا استخدمت مؤخرا الاستنساخ الموضعية لتحديد BBS1، BBS2، والجينات BBS4 ( 30 - 32). استخدام السكان يعزل وكان تحليل النمط الفرداني رئيسيا في تحديد هذه الجينات التي تجعل من الممكن لتعيين مواضع الفردية وتضييق فترات المرض حتى في وجود التجانس الوراثي واسعة النطاق. تم انجازه تحديد BBS1، BBS2، وBBS4 باستخدام السكان من بورتوريكو والبدو السكان من إسرائيل. وفي وقت لاحق، تم تحديد BBS7 وBBS8 باستخدام نهج الجين مرشح على أساس مراقبة بعض التشابه مع BBS2 وBBS4، على التوالي ( 23، 24).

BBS وظيفة الجين.

على الرغم من أن ستة جينات BBS الآن وقد تم تحديد، لا يعرف إلا القليل عن وظيفة هذه الجينات وكيف أنها تسهم في التسبب في BBS. تظهر الجينات المعروفة الأنماط المكانية والزمانية مشابهة جدا التعبير. يتم التعبير عن كل ما في التنمية في وقت مبكر ويستمر أعرب على نطاق واسع في أنسجة البالغين ( 29، 30 - 32). واحدة من هذه الجينات، BBS6، يتوقع أن رمز للبروتين الذي لديه تشابه تسلسل لعائلة chaperonin من البروتينات. المحرمين الجزيئية هي البروتينات التي تشارك في للطي أو تجميع البروتينات الوليدة في هيكل العليا. البروتين BBS6 له تناظر تسلسل كبير إلى الوحيدات ألفا من Thermoplasma acidophilum thermosome ( 25)، وهو مجمع chaperonin بدائيات النواة مع التشابه الهيكلي لchaperonin حقيقية النواة يسمى العديم الذيل المعقد تعقيدا حلقة ببتيد. على أساس التماثل تسلسل، BBS1، BBS2، BBS4، وBBS7 لا يبدو أن تلعب دورا chaperonin. قد تتطلب هذه البروتينات BBS6 للطي السليم وظيفة.
وتوقع البروتينات BBS1، BBS2، وBBS7 لا تملك تناظر تسلسل إلى البروتينات المعروفة الأخرى التي تقدم أدلة هامة إلى وظيفتها ( 30 - 32). BBS1 وBBS2 إظهار تناظر تسلسل المتواضع لبعضها البعض على منطقة محدودة. وبالمثل، BBS2 وBBS7 تظهر بعض التشابه تسلسل. يظهر البروتين BBS4 توقع ضعف التماثل إلى ربط O ترانسفيراز N-acetylglucosamine من عدة أنواع ( 30). هذا التماثل تسلسل يقتصر على المجالات TPR وله أهمية واضحة.
يبدو أن الاكتشاف الأخير من BBS8 قد قدم فكرة هامة إلى وظيفة البروتينات BBS. تسلسل البروتين المتوقعة للBBS8 المعارض تشابه كبير إلى المجال بدائيات النواة pilF. في البكتيريا، وقد تبين أن الجينات pilF أن تشارك في التجمع من النوع الرابع الشعرة، الذي توسط البكتيرية الوخز حركية ( 33). انسلي وآخرون. ( 24) افترضنا أن BBS8 والبروتينات BBS غيرها من المعنيين في وظيفة الأهداب. ودعما لهذه الفرضية، فإنها أثبتت أن BBS8 يموضع إلى الجسم القاعدية من الخلايا المهدبة، مما يشير إلى دور لBBS8 والبروتينات BBS أخرى في التجمع الهدبية، صيانة، أو وظيفة. يبقى أن نرى ما إذا كانت الجينات BBS متعددة سيثبت إلى رمز للبروتينات التي تشكل جزءا من مجمع multisubunit أم البروتينات BBS لا تتفاعل مباشرة مع بعضها البعض ولكن هي جزء من مسار الكيمياء الحيوية أو التنموي المشترك.

رؤى الوراثية من اضطرابات أحادية المنشأ.

دراسة اضطرابات أحادية المنشأ يمكن أن تسهم في فهمنا للاضطرابات معقدة على عدة مستويات. أولا، ودراسة اضطرابات أحادية المنشأ التي لها تداخل المظهري مع اضطراب معقد مشترك يمكن أن يؤدي إلى تحديد المسارات البيوكيميائية أو التنموية تشارك في النمط الظاهري المشترك. على سبيل المثال، دراسة BBS قد يؤدي إلى فهم مسارات تشارك في تنظيم ومراقبة الوزن. الثانية، ودراسة الأمراض مندلية يمكن أن يؤدي إلى تحسين فهم الآليات الوراثية التي يمكن أن تلعب دورا في مرض معقد وراثيا. وأخيرا، ودراسة اضطرابات أحادية المنشأ يمكن أن يؤدي إلى تحسين استراتيجيات لدراسة اضطرابات معقدة وراثيا. حتى الآن، لم تضع دراسة BBS آلية المرض موحدة. ومع ذلك، فقد قدم هذا العمل الضوء على أنواع الأحداث طفرة وراثية، والتباين الوراثي، وتصميم الدراسة، والاستراتيجيات التي من شأنها أن تسهم في فهم الاضطرابات المعقدة المشتركة. وعلاوة على ذلك، قدمت هذه البحوث الفرص لاكتساب المعرفة في العمليات البيولوجية الأساسية والفيزيولوجيا المرضية مرض معين.
وأشار تحليل تحور الجين BBS1 أن ما يقرب من 40٪ من المرضى أمريكا الشمالية وBBS الأوروبي لديها طفرات في هذا الجين، مما يجعلها السبب الأكثر شيوعا لBBS، والتعرف على الطفرات الشائعة (M390R) مشترك من قبل معظم المرضى BBS1 ( 32، 34). ويشارك منطقة كبيرة من المستغرب (~ 400 كيلوبايت) الربط اختلال التوازن بين السكان في المرضى الذين يعانون من طفرة BBS1 M390R ( 34). على الرغم من تحديد النسخ المتنوعة المشتركة في الأفراد المتضررين من المحتمل أن يكون طريقة فعالة لتحديد الجينات المسؤولة عن اضطرابات معقدة، يجب على المرء أن يكون حذرا عند استخدام هذا النهج. على سبيل المثال، تم العثور على ثلاث طفرات BBS مختلفة على النمط الفرداني نادر بورتوريكو، وهو الاكتشاف يدل على التحيز لأحداث طفرة وراثية في بعض النسخ المتنوعة أو تغيير في التركيبة السكانية بورتوريكو على مر الزمن ( 32، 34). وعلاوة على ذلك، تم تحديد طفرة الحذف 6 كيلو بايت في الجين BBS4 في الأسر غير ذات صلة. ويبدو أن هذه الطفرة إلى أن تكون المتكررة ليتم العثور على طفرة في خلفيات وراثية مختلفة في اثنين من عائلات مختلفة. هو تكرار هذه الطفرة يرجع إلى عدم المساواة في معبر أكثر من بين تسلسل ألو في هذا الجين ( 31). ويوضح هذا الاكتشاف هذا السياق تسلسل المحلي يمكن أن يؤدي إلى تكرار حدوث طفرات مماثلة في الأفراد لا علاقة لها وعلى النسخ المتنوعة المختلفة. هذا الاستنتاج هو ذات الصلة لدراسة الأمراض المعقدة لأنه يشير إلى أن بعض اضطرابات قد تحدث عادة نتيجة لأحداث طفرة التي تتكرر في كثير من الأحيان نسبيا في عدد السكان نتيجة للتسلسل الجيني المحلي والهندسة المعمارية.
تحليل تحور الجينات BBS2، BBS4، وBBS6 أدى إلى الفرضية القائلة بأن ثلاثة أليل متحولة مطلوبة من أجل مظهر من مظاهر النمط الظاهري BBS، وهو شكل من الميراث معقدة ويشار إلى triallelic ( 8). للتحقيق في احتمال وراثة معقدة من BBS، قمنا تسلسل الجينات المعروفة BBS، بما في ذلك الجين BBS1 حددت مؤخرا، في لفيف كبير المريض ( 32، 34). وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن BBS يعرض الميراث مقهورة. ومع ذلك، تقارير تفيد بحدوث حالات نادرة من BBS nonpenetrance تتفق مع الإرث المعقد في مجموعة فرعية صغيرة من المرضى ( 8 - 10). الأهم من ذلك، وجود تباين السريري المشترك بين وداخل الأسرة إلى أن هناك جينات تعديل النمط الظاهري BBS ( 16، 18، 35 - 37). معدلات الوراثية من النمط الظاهري BBS قد تكون الجينات BBS أخرى و / أو الجينات التي تكود المنتجات التي تتفاعل مع بروتينات BBS.

تحسين دراسات مرض معقد.

وقد أثبتت تحديد الجينات المسؤولة عن الأمراض المعقدة المشتركة ليكون صعبا. تحتاج استراتيجيات تحسين والمكررة لاستخدامها في تسهيل التعرف على الجينات والاختلاف تسلسل تشارك في مثل هذه الاضطرابات. وتشمل هذه الاستراتيجيات 1) التحقيق في تأثير العمارة الجينومية المحلية على طفرة المتكررة، 2) تقييم مساهمة الخلافات جرعة الجين (زاد ونقص) إلى الظواهر المرض، و 3) تحديد تأثير على التعبير الجيني من غير المرمزة noncoding الموجودة تطوريا تسلسل الحفظ. وهكذا، في السعي من الجينات والاختلاف الجيني المشاركة في اضطرابات معقدة، ونحن سوف تحتاج إلى أن تأخذ في الاعتبار بنية الجينوم، سياق تسلسل المحلي، والجينوم الشرح في تقييم الجينات المرشحة وتشمل استخدام أساليب لتحديد الطفرات المتكررة، جرعة الجينات الاختلاف، والاختلاف في تسلسل غير المكودة. وعلاوة على ذلك، فإن تحديد الجينات التي تسبب الاضطرابات المندلية مثل BBS يتيح الفرصة لتحديد الجينات التي تخفف أو تعديل الظواهر يعتقد عموما أن تكون أحادية المنشأ في الأصل. واصلت دراسة الاضطرابات المندلية ويجوز أن ينص التعديل على أفضل فرصة لتحسين فهم التعقيد الجيني.

نماذج حيوانية BBS.

تحديد الجينات التعديل حتى لاضطرابات أحادية المنشأ صعب في البشر. استخدام النماذج الحيوانية مصدرا للقوة لتحديد الجينات التعديل. في الأعمال التمهيدية، قمنا بتطوير نماذج الزرد والفأر من BBS ونحن في عملية تقييم المظهرية حذرا من هذه النماذج. والنماذج الحيوانية مثل هذه تسمح الدراسات لتحديد ما إذا كانت الجينات BBS تعديل بعضها البعض، وإتاحة الفرصة لاستخدام أساليب الجينية لتحديد مواضع الأخرى التي تتفاعل وراثيا مع جينات BBS المعروفة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه النماذج تسهيل الدراسات وظيفة من البروتينات BBS ودراسة أخرى من BBS الفيزيولوجيا المرضية.

أعلى الصفحة المراجع

• Kwitek الأسود AE، كرمي R، Duyk GM، Buetow JH، Elbedour K، Parvari R، Yandava CN، ستون EM، شيفيلد VC 1993 ربط متلازمة بارديه-بيدل على كروموسوم 16q والدليل على عدم التجانس الوراثي غير أليلية. نات جينيه 5 : 392-396. | المادة | مجلات | ISI | ChemPort |
• ليبرت M، L بيرد، أندرسون KL، Otterud B، Lupski JR، لويس RA يرتبط 1994 متلازمة بارديه-بيدل لعلامات الحمض النووي على الصبغي 11q وغير متجانسة وراثيا نات جينيه 7: 108-112. | المادة | مجلات | ISI | ChemPort |
• شيفيلد VC، كرمي R، Kwitek الأسود A، Rokhlina T، نيشيمورا D، Duyk GM، Elbedour K، Sunden SL، ستون EM 1994 تحديد متلازمة موضع بارديه-بيدل على الكروموسوم 3 وتقييم نهج فعال لرسم الخرائط جود زيجوت متماثلة الألائل. همهمة مول جينيه 3: 1331-1335. | المادة | مجلات | ISI | ChemPort |
• كرمي R، T Rokhlina، Kwitek الأسود AE، Elbedour K، D نيشيمورا، ستون EM، شيفيلد EM 1995 استخدام استراتيجية تجميع الحمض النووي لتحديد مكان متلازمة السمنة الإنسان على الصبغي 15. مول جينيه 4: 9-13.
• الشباب TL، بيني L، ودز MO، Parfrey PS، أخضر JS، Hefferton D، ديفيدسون WS 1999 A موضع الخامس لبارديه-بيدل خرائط متلازمة كروموسوم 2q31 ل[الرسالة] آم J همهمة جينيه 64: 901-904.
• وودز MO، Parfrey PS، أخضر JS، ديفيدسون WS 2000 الأدلة على بعد رواية أخرى متلازمة بارديه-بيدل (BBS) موضع في عدد السكان نيوفاوندلاند [المجرد] آم J همهمة جينيه 67 (ملحق): 1730.
• Beales PL، Katsanis N، لويس RA، انسلي SJ، Elcioglu N، رضا J، ودز MO، أخضر JS، Parfrey PS، ديفيدسون WS، Lupski JR 2001 الوراثية والتحليلات طفرية من كبيرة متعددة الأعراق بارديه-بيدل فوج تكشف عن تورط القصر لل BBS6 وترسيم فترات حرجة من مواضع أخرى آم J همهمة جينيه 68: 606-616. | المادة | مجلات | ISI | ChemPort |
• Katsanis N، انسلي SJ، Badano JL، Eichers ER، لويس RA، هوسكينز يكون، Scambler PJ، ديفيدسون WS، Beales PL، Lupski JR 2001 Triallelic الميراث في متلازمة بارديه-بيدل، وهو اضطراب المتنحية مندلي العلوم 293: 2256-2261. | المادة | مجلات | ISI | ChemPort |
• Katsanis N، Eichers ER، انسلي SJ، لويس RA، Kayserili H، هوسكينز يكون، Scambler PJ، Beales PL، Lupski JR 2002 BBS4 هو المساهم البسيط لمتلازمة بارديه-بيدل ويمكن أن تشارك أيضا في الميراث triallelic. آم J همهمة جينيه 71 : 22-29. | المادة | مجلات | ISI | ChemPort |
• بيلز PL، Badano JL، روس AJ، انسلي SJ، هوسكينز BE، كيرستن B، مين CA، Froguel P، Scambler PJ، لويس RA، Lupski JR، Katsanis N 2003 التفاعل الجيني للطفرات BBS1 مع الأليلات في غيرها من مواضع BBS يمكن أن يؤدي إلى غير مندلية-بارديه-بيدل متلازمة آم J همهمة جينيه 72: 1187-1199. | المادة | مجلات | ISI | ChemPort |
• لورانس JZ، القمر RC 1866 أربع حالات من التهاب الشبكية الصباغي التي تحدث في نفس العائلة ويرافقه النقص العام للتنمية Ophthalmol القس 2: 32-41.
• بارديه G 1920 سور الامم المتحدة متلازمة دي obesite الطفلي AVEC polydactylie آخرون retinite مصطبغ (مساهمة A L'القطعة الموسيقية دي FORMES cliniques DE L'obesite hypophysaire). أطروحة، باريس، ملاحظة no.479
• . بيدل A 1922 عين Geschwisterpaar معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا adiposogenitaler Dystrophie Dtsch ميد Wschr 48: 1630
• آمان F 1970 التحقيقات cliniques آخرون genetiques سور جنيه متلازمة دي بارديه-بيدل أون سويس. J جينيه هوم 18 (ملحق) 1-310. | مجلات | ISI |