تزايد انتشار السمنة وارتباطه مع مختلف الاضطرابات الإنسان، مثل مرض السكري وارتفاع ضغط الدم قد جعل دراسة آليات التي تتحكم في توازن الطاقة أولوية عالية. العوامل البيئية والوراثية التي تسهم في البدانة "وباء" هي حاليا قيد التحقيق المكثف ولكن فهمنا للعمليات الجزيئية الخلوية والفسيولوجية التي تنظم توازن الطاقة والعيوب التي تؤدي إلى اختلال توازن الطاقة والسمنة لا تزال بعيدة عن الاكتمال. في الثدييات، يتم التحكم في وزن الجسم وتوازن الطاقة عن طريق التفاعل بين الإشارات الطرفية والدماغ، وخصوصا منطقة ما تحت المهاد
(1). اللبتين هو هرمون المشتقة من خلية شحمية الذي يدور في نسبة إلى كمية الدهون في الجسم من أجل إبلاغ الدماغ عن تخزين الدهون الطرفية
(2، 3). داخل النواة المقوسة من منطقة ما تحت المهاد، وهو موقع كبير للعمل هرمون الليبتين، ومن المعروف اللبتين للعمل على اثنين على الأقل من السكان العصبية: proopiomelanocortin (POMC) الخلايا العصبية، والتي يتم تفعيلها من خلال ليبتين ونيوروبيبتيدي Y (NPY) الخلايا العصبية [معربا عن المشترك آغوطي البروتين ذات الصلة ب (AgRP)]، وتحول دون اللبتين
(1 -
+4). في القوارض والبشر، والطفرات في الجينات التي تكود اللبتين ومستقبلات هرمون الليبتين الرصاص إلى السمنة والعقم والغدد الصماء اختلالات شديدة
(2، 5).
وتشير الاكتشافات الحديثة أن الخلل الهدبية ويرتبط مع السمنة الإنسان. متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب وراثي البشرية تنميط المرتبطة اختلال وظيفي الهدبي والسمنة
(6، 7). حتى الآن، تم التعرف على أكثر من 12 جينات BBS وترتبط طفرات في الجينات BBS مع السمنة، polydactyly وتنكس الشبكية
(6 -
+8). المظاهر السريرية إضافية من BBS تشمل مرض السكري وارتفاع ضغط الدم وضعف الإدراك، وتشوهات الكلى ونقص الأعضاء التناسلية
(6 -
+8). على الرغم من أن تشارك البروتينات BBS في القائم أنيبيب الاتجار البروتين / الحويصلة
(6، 9، 10)، لم تتميز وظيفة جزيئية دقيقة من كل من البروتين BBS. وبالمثل، فإن الآليات الفيزيولوجية المرضية التي تؤدي إلى كل عنصر من عناصر النمط الظاهري BBS غير معروفة.
في السابق، أثبتنا أن السمنة في BBS الفئران يرتبط hyperleptinemia ومقاومة اللبتين
(11). ومع ذلك، منذ إنتاج هرمون الليبتين يتناسب مع كمية الدهون في الجسم، وكثيرا ما ترتبط hyperleptinemia ومقاومة اللبتين مع السمنة في النماذج الحيوانية والبشر
(3، +12 -
14)، ومقاومة اللبتين في الفئران BBS يمكن أن تكون ثانوية إلى السمنة، مقارنة ليكون سببا في السمنة. هنا، تناولنا هذه المسألة، وكشف العيوب الجزيئية مما يؤدي إلى اختلال توازن الطاقة في BBS. باستخدام نموذج BBS الماوس خروج المغلوب
(Bbs2 - / -)
(15)، التي تلخص أهم مكونات النمط الظاهري البشري بما في ذلك السمنة، علينا أن نبرهن على البروتينات BBS مطلوبة للLepR الإشارات. أكدنا هذا مع BBS نماذج إضافية الماوس خروج المغلوب
(Bbs4 - / -
وBbs6 - / -)
(16، 17). علينا أن نبرهن أيضا أن البروتينات BBS التفاعل بأنفسهم مع LepR والتوسط الاتجار LepR. النتائج التي توصلنا إليها تشير إلى أن الإشارات LepR الموهنة بسبب الاتجار تغير من LepR هي السبب الرئيسي للسمنة في BBS.
بارديه-بيدل الفئران متلازمة جود عيوب في المحور اللبتين الميلانوكورتين المهاد
لاختبار ما إذا كانت مقاومة اللبتين في BBS الفئران هي الثانوية إلى السمنة، ودرسنا شهية-قمعها وآثار الخارجية ليبتين الماوس في BBS الفئران التي لديها مستويات تعميم ليبتين على تطبيع بواسطة تقييد السعرات الحرارية خفض الوزن
Bbs2 - / -،
Bbs4 - / -
وBbs6 - / - أعطيت الفئران 70-80٪ من الكريات طعام تستهلك عادة يوميا من قبل الفئران البرية من نوع الجنس والعمر المتطابقة. هذا البروتوكول تقييد السعرات الحرارية بشكل فعال منعت السمنة وانخفاض مستويات اللبتين في الدم في الفئران BBS (الشكل
1 A). في حين
Bbs2 - / -،
Bbs4 - / -
وBbs6 - / - أظهرت الفئران التي غذيت
الإعلانية libitum 4-10 أضعاف أعلى مستويات اللبتين في الدم [الشكل
1 A و
(11)]، ومستويات هرمون الليبتين من سعرات حرارية
Bbs2 - / -
Bbs4 - / -
وBbs6 - / - كانت الفئران مقارنة مع البرية من نوع الحيوانات. تسببت Intracerebroventricular (ICV) إدارة يبتين انخفاضا كبيرا في تناول الطعام ووزن الجسم في البرية من نوع الفئران. في المقابل، فشلت ICV يبتين إلى الحد من الاستهلاك الغذائي ووزن الجسم في
Bbs2 - / -،
Bbs4 - / -
وBbs6 - / - الفئران على الرغم من مستويات اللبتين في الدم العادية (الشكل
1 B و C). تناول الطعام تعديلها لوزن الجسم أسفرت عن نتائج مماثلة (لا تظهر البيانات). هذه النتائج تشير إلى أن مقاومة اللبتين في BBS الفئران ليست الثانوية إلى السمنة. بدلا من ذلك، هذه النتائج تشير مقاومة اللبتين هو سبب السمنة في الفئران BBS.
الشكل 1.
بارديه-بيدل الفئران متلازمة مقاومة لهرمون الليبتين. (A) مستويات هرمون الليبتين في مصل الدم من النوع البري و(CR) Bbs2 المقيدة السعرات الحرارية - / - (2KO)، Bbs4 - / - (4KO) وBbs6 - / - (6KO) الفئران. وقد أظهرت مستوى اللبتين في الدم لتغذية الفئران عادة Bbs2 اغيا للمقارنة (ن = 4-16). (B، C) Bbs2، Bbs4 وBbs6 الفئران الخالية مع مستويات اللبتين تعميم العادية لا تزال تقاوم عمل عن زيادة الوزن والحد من الشهية اللبتين. تم قياس التغيرات في وزن الجسم وتناول الطعام 24 ساعة بعد تناوله ICV ليبتين (ن = 5-16). البيانات يعني ± SEM. * P <0.05 مقارنة مع البرية من نوع الفئران؛ † P <0.05 مقابل السيارة.
مستقبلات ميلانوكورتين، والتي هي المصب لLepR الإشارات، هي عقدة مهمة لتوازن الطاقة
(1، 4). ولذلك، درسنا ما إذا كان ضعف قدرة المستقبلات ميلانوكورتين لتغيير الأيض أيضا في BBS الفئران. لهذا، نحن اختبار أثر إعطاء ICV من Melanotan الثاني (MTII)، ناهض مستقبلات ميلانوكورتين، على وزن الجسم وتناول الطعام (الشكل
2 ألف وباء). وعلى النقيض من اللبتين، وانخفاض ICV MTII تناول الطعام ووزن الجسم في كل من النوع البري
وBbs2 - / -
وBbs6 - / - الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، خفضت إدارة MTII الأنسجة الدهنية البنية والبيضاء في كل من السيطرة والحيوانات BBS (الشكل
2 C و D). وتشير هذه البيانات إلى أن قدرة المستقبلات ميلانوكورتين للتأثير على التمثيل الغذائي سليمة في الفئران BBS. الكمي العكسية الناسخ تفاعل البلمرة المتسلسل أظهرت (QRT-PCR) النتائج أيضا أن التعبير عن الميلانوكورتين-3 و -4 مستقبلات كان طبيعيا في BBS الفئران
(المواد التكميلية، الشكل S1). جنبا إلى جنب، وهذه البيانات تشير إلى أن السمنة في الحيوانات BBS ونظرا لعيب (ق) المصب أو على مستوى LepR لكن المنبع من مستقبلات ميلانوكورتين في المحور اللبتين الميلانوكورتين المهاد.
الرقم 2.
بارديه-بيدل الفئران متلازمة هي استجابة لناهض مستقبلات ميلانوكورتين، MTII. (A-D) BBS الفئران لا يستجيب لعن زيادة الوزن، وتأثير الحد من كتلة appetite- والدهون من MTII. من النوع البري، Bbs2 - / - وBbs6 - / - تم حقن الفئران مع MTII أو مركبة، وتم قياس التغيرات في وزن الجسم وتناول الطعام بعد 24 ساعة. تم قياس البني الأنسجة الدهنية والدهون الإنجاب بعد وفاة في الفئران vehicle- أو MTII حقن (ن = 4-7). البيانات يعني ± SEM. * P <0.05 مقارنة مع البرية من نوع الفئران. † P <0.05 مقابل السيارة.
لتحديد خلل محدد مما يؤدي إلى اللبتين المقاومة في الفئران BBS، درسنا التعبير ويشير قدرة الإسوي طويلة من مستقبلات هرمون الليبتين (LepRb)، وشكل الإسوي الذي يشير القدرات داخل منطقة ما تحت المهاد
(18، 19). لم تتغير مستويات مرنا من LepRb في
Bbs2 - / -،
Bbs4 - / -
وBbs6 - / - الفئران مقارنة مع من النوع البري الضوابط (الشكل
3 A). لدراسة ما إذا كانت قدرة الإشارات من LepRb أمر طبيعي في الفئران BBS، قارنا قدرة اللبتين لتفعيل المهاد محول الإشارات ومنشط النسخ-3 (STAT3) بين النوع البري والفئران BBS. على النحو الوارد أعلاه، تم تطبيع مستويات اللبتين في الفئران BBS بواسطة تقييد السعرات الحرارية لتجنب مقاومة اللبتين الثانوية إلى السمنة. في السيطرة على الفئران، تسببت اللبتين زيادة قوية في STAT3 الفسفرة (الشكل
3 B). ومع ذلك، تم تخفيض الناجم عن اللبتين STAT3 الفسفرة إلى حد كبير في
Bbs2 - / -،
Bbs4 - / -
وBbs6 - / - الفئران (إلى 17-39٪ من السيطرة) وإن كانت مستويات اللبتين في الدم طبيعية في تلك الفئران (الشكل
3 B و C). تدل هذه البيانات على أن اللبتين المقاومة في BBS الفئران سببه عدم قدرة LepR لتفعيل آلية داخل الخلايا اللاحقة المرتبطة هذا المستقبل. في الفئران السمينة التي يسببها النظام الغذائي، ويعتقد مقاومة اللبتين أن يكون بسبب زيادة في القامع للخلوى يشير 3 (Socs-3)، واحدة من الأهداف التي تحدثها STAT3 ومثبط ردود الفعل السلبية من LepR الإنذار
(20، 21 ). وجدنا أن كلا مرنا (الشكل
3 D) والبروتين (الشكل
3 E) مستويات Socs-3 وانخفض في
Bbs2 - / -،
Bbs4 - / -
وBbs6 - / - الحيوانات، مشيرا إلى أن المقاومة اللبتين في BBS الفئران لم يكن بسبب زيادة التعبير عن
Socs-3 على عكس ما لوحظ في النظام الغذائي الناجم عن نموذج السمنة. الدور المحتمل للآليات أخرى مثل البروتين التيروزين الفوسفاتيز 1B ودوري AMP استجابة البروتين 1 (Creb1) لا يزال -regulated النسخ coactivator-1 في مقاومة اللبتين المرتبطة BBS يتم تحديدها (ملزم العنصر
22، 23). كما وجدنا أن
Bbs2 - / -،
Bbs4 - / -
وBbs6 - / - زيارتها الفئران التعبير الطبيعي
للSyntaxin 1 (الشكل
3 E)، الذي سبق ان عرضه إلى أن downregulated في الفئران من نقص في هرمون الليبتين
(OB / OB) أو LepRb
(ديسيبل / ديسيبل) (24). Synaptophysin هو علامة عموم العصبية ولم يتم تغيير مستوى له في
Bbs2 - / -،
Bbs4 - / -
وBbs6 - / - الفئران، مشيرا إلى أنه لا يوجد أي خسارة جسيمة للخلايا العصبية في الفئران BBS (الشكل
3 E). باختصار، البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن مقاومة اللبتين في BBS الفئران هي بسبب الإشارات LepR الموهنة في منطقة ما تحت المهاد.
الرقم 3.
ضعاف LepRb يشير في متلازمة بارديه-بيدل (BBS) الفئران. مستويات (A) التعبير عن LepR مطولا (LepRb). تم قياس كميات النسبية LepRb من mRNAs التي كتبها الكمي عكس سلسلة الناسخ-تفاعل البلمرة (QRT-PCR) بعد التطبيع مع RPL19. تم تحديد مستويات التعبير في البرية من نوع تعسفا في 1 (ن = 6-9). تم تخفيض (B) STAT3 الفسفرة على ادارة اللبتين في الفئران BBS. وكانت الفئران BBS على النحو الوارد أعلاه لتطبيع مستويات اللبتين في الدم وحقن هرمون الليبتين المقيدة السعرات الحرارية. وقد تم تحليل مقتطفات البروتين طائي من قبل ستاندرد دوديسيل الصوديوم وكبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام والنشاف الغربي. (C) الكمي لSTAT3 مفسفر من البيانات المستخدمة في (B). وقد انخفض (D) Socs-3 مستوى مرنا في الفئران BBS. تم تحديد Socs-3 مستوى مرنا من قبل QRT-PCR على النحو الوارد أعلاه (ن = 4-8). (E) مستويات البروتين من Socs-3، Syntaxin1 وSynaptophysin. β-catenin كان يستخدم كعنصر تحكم التحميل. البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة * P <0.05 مقارنة مع البرية من نوع الفئران.
للحصول على مزيد من التبصر في الآليات الجزيئية والخلوية من السمنة في الحيوانات BBS، درسنا مستويات التعبير عن الجينات طائي الرئيسية المشاركة في العمل اللبتين. وتمشيا مع النتائج التي توصلنا إليها السابقة
(11)، ومستويات التعبير عن الجينات
Agrp ونبي مشه كانت طبيعية، في حين كان مستوى التعبير عن الجينات
POMC مقهم؛ مفقد الشهية أقل من ذلك بكثير في
Bbs2 - / -،
Bbs4 - / -
وBbs6 - / - الفئران (الشكل مقارنة مع من النوع البري الضوابط
4 A). المقبل، ونحن اختبار ما إذا كانت الجينات مشه ومقهم؛ مفقد الشهية طائي ردت بشكل صحيح للتغيرات في توازن الطاقة المحيطية في BBS الفئران عن طريق مقارنة مستويات مرنا من هذه نيوروببتيد في الحيوانات التي تتغذى عادة و 48 ساعة صام. في البرية من نوع الفئران، زادت AgRP وNPY مرنا المستويات، وانخفضت مستويات POMC مرنا بعد الصيام (الشكل
4 B). في
Bbs2 - / -
وBbs4 - / -، وكانت التغيرات في مستويات AgRP وNPY مرنا في الاستجابة للصيام الفئران مماثلة لتلك التي من النوع البري الضوابط. في المقابل، كان الانخفاض الناجم عن الصيام في مستويات POMC مرنا أقل بكثير في
Bbs2 - / -
وBbs4 - / - الفئران بالمقارنة مع من النوع البري الضوابط (الشكل
4 B). وتشير هذه البيانات إلى أن الخلايا العصبية POMC من الفئران BBS لا تستجيب بشكل صحيح إلى تغييرات في توازن الطاقة المحيطية. وهكذا، يبدو أن الخلايا العصبية POMC أن تتأثر بشكل انتقائي في BBS الفئران المصب LepR الإشارات.
الرقم 4.
الخلايا العصبية POMC المعيبة في متلازمة بارديه-بيدل (BBS) الفئران. مستويات (A) طائية من البروتين ذات الصلة آغوطي (AgRP)، نيوروبيبتيدي Y (NPY) وproopiomelanocortin (POMC) مرنا في تغذية عادة Bbs2، Bbs4 وBbs6 الفئران باطل بالمقارنة مع من النوع البري الضوابط (ن = 6-9). (B) تأثير الصيام 48 ساعة (نسبة إلى الدولة تتغذى عادة) على AgRP المهاد، NPY وPOMC مرنا المستويات في البرية من نوع، Bbs2 وBbs4 الفئران فارغة (ن = 4-5). (C) تلطيخ المناعى للخلايا العصبية POMC إيجابية. أقسام الاكليلية من النوع البري، Bbs2 - / - (2KO) وBbs6 - / - كانت ملطخة (6KO) أدمغة مع أضداد POMC وتظهر المقاطع التمثيلية. (D) متوسط عدد الخلايا العصبية POMC إيجابية في النواة المقوسة. احصي الخلايا POMC إيجابية في خمسة أقسام داخل موقف مماثل من كل حيوان ويظهر متوسط عدد الخلايا العصبية POMC في نصف الكرة الأرضية (ن = 3-4). البيانات يعني ± SEM. * P <0.05 مقارنة مع البرية من نوع الفئران.
لاختبار ما إذا كان الانخفاض في عدد الخلايا العصبية POMC قد يكون الخلل الرئيسي في الفئران BBS، قارنا عدد هذه الخلايا العصبية في النواة المقوسة طائي بين النوع البري والفئران BBS. وكشفت النتائج المناعية أن هناك انخفاض طفيف (حوالي 20٪) في الخلايا POMC إيجابية في
Bbs2 - / -
وBbs6 - / - الحيوانات (الشكل
4 C و D). ومع ذلك، هذا الانخفاض في الخلايا العصبية POMC لا يمكن أن يفسر تخفيض حوالي 40٪ في
POMC التعبير الجيني أو الانخفاض أكثر من 60٪ في STAT3 الفسفرة. بالإضافة إلى ذلك، كان المناعية من POMC في الحيوانات BBS في كثير من الأحيان ضعيف (وهو ما يتسق مع مستويات أقل من POMC مرنا) مما يشير إلى أن عدد الخلايا العصبية POMC يمكن الاستهانة بها في الفئران BBS. جنبا إلى جنب مع الكيمياء الحيوية والتعبير الجيني بياناتنا، فإن هذه النتائج تشير إلى أن مقاومة اللبتين في BBS الفئران هي في معظمها بسبب الموهنة يشير LepR.
مؤخرا، تبين أن سبعة البروتينات BBS (BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8 وBBS9) تشكل مجمع مستقرة المعروفة باسم BBSome
(9). ويقترح هذا المجمع كوحدة وظيفية التي تتوسط الاتجار البروتين / الحويصلة إلى أهداب. نحن افترض أن بعض مفارز BBSome قد تتفاعل مع LepRb و / أو STAT3 للتوسط الاتجار بهم. لافت للنظر، وجدنا أن البروتين BBS1 تفاعل تحديدا مع LepRb في ترنسفكأيشن وشارك في مناعي المقايسات عابرة (الشكل
5 A). لم تظهر أي مفارز BBSome أخرى التفاعل مع LepRb. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التفاعل بين BBS1 وLepR محددة لشكل الإسوي إشارات من المستقبلات، LepRb، لأن الإسوي غير إشارة، LEPRA، لم تتفاعل مع BBS1 (الشكل
5 B). واتساقا مع ذلك، وجدنا أن المجال-C محطة حشوية من LepRb، والتي هي فريدة من نوعها لLepRb، كان كافيا للتفاعل مع BBS1 (الشكل
5 C). نحن لم يكشف عن أي تفاعل بين STAT3 وBBS البروتينات (لا تظهر البيانات). طفرة BBS1 M390R، وهو تحور الأكثر شيوعا وجدت في المرضى الذين يعانون BBS البشري وكافية للحث على الظواهر BBS بما في ذلك السمنة في نموذج الفأر المغلوب في
(25)، تقلص إلى حد كبير على قدرة BBS1 للتفاعل مع LepRb (الشكل
5 د). متحولة BBS1 M390R كما أظهرت انخفض التفاعل مع LepRb مجال حشوية (الشكل
5 C). لاختبار ما إذا كان التفاعل بين BBS1 وLepRb يحدث في الخلايا الحية، ونحن transfected ARPE 19 الخلايا مع BBS1 إما وحدها أو مع LepRb. وجدنا أنه على الرغم من الكشف عن البروتينات BBS1 overexpressed في جميع أنحاء السيتوبلازم، وشارك في ترنسفكأيشن من LepRb مع المقيدة BBS1 BBS1 توطين لينقط صغيرة في ARPE 19 الخلايا
(المواد التكميلية، الشكل S2)، ودعم التفاعل المادي للLepR مع BBS1. وإجمالا، فإن هذه النتائج تشير إلى أن LepRb يمكن أن تترافق مع الوحيدات BBS1 من BBSome.
الرقم 5.
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) البروتينات تتوسط الاتجار LepRb. (A) تفاعل BBS1 مع LepRb. البروتينات BBS HA الموسومة (BBS1-5 و7-9) وعابر. مع LepRb وتم فحص التفاعلات التي كتبها المقايسات المشترك مناعي الموسومة FLAG. وقد أظهرت مستويات التعبير من كل من البروتين BBS وLepRb في لست] في لوحات أسفل والمتوسطة، على التوالي. وقد أظهرت LepRb-immunoprecipitated شارك في اللوحة العلوية. IP، مناعي. IB، immunoblotting. (ب) يشير الإسوي من LepR، LepRb، ولكن ليس الإسوي قصيرة LEPRA، يتفاعل مع BBS1. مجال حشوية (C) C-محطة من LepRb (LepRb خلوي) غير كافية للتفاعل مع BBS1. وقد استخدم MYC-GFP بمثابة سيطرة سلبية. (D) BBS1 M390R طفرة يعطل التفاعل BBS1-LepRb. الآخرين هي نفسها كما في (A).
وأخيرا، نحن اختبار ما إذا تم تغيير الاتجار LepRb في غياب البروتينات BBSome. بما يتفق مع الدراسات السابقة للتوطين LepR
(26، 27)، وقد وجد معظم LepRb مناعية في شبكة -Golgi
العابرة (TGN) والحويصلات الصغيرة، وتم الكشف فقط على مستوى منخفض جدا من LepRb في غشاء البلازما ( الشكل
6 ألف
والتكميلية المواد، الشكل S3). وكانت بعض حويصلات صغيرة تظهر مناعية لLepRb إيجابية لTGN46، علامة لالحويصلات بعد جولجي، وكذلك TGN
(28)، مما يشير إلى أن هذه الحويصلات هي في الطريق أو إعادة التدوير الإندوسومات إفرازية. تم العثور على جزء من LepRb أيضا في الإندوسومات في وقت مبكر كما تميزت EEA1
(المواد التكميلية، الشكل S3) (29). عندما المنضب البروتين BBS1 التي تدخل RNA shRNA بوساطة
(. المواد التكميلية، الشكل S4)، فقد وجد LepRb في حويصلات كبيرة بشكل غير طبيعي بالقرب من النواة (حوالي 7٪ من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل؛ الشكل
6). وجدنا mistrafficking مماثلة من LepRb عندما المنضب البروتين BBS2 (الشكل
6)، مشيرا إلى أن شرط البروتينات BBS للاتجار LepRb لا يقتصر على BBS1. وتشير هذه البيانات إلى أن البروتينات BBS مطلوبة من أجل الاتجار السليم للLepRb على الأرجح بين جولجي والهدبية و / أو غشاء البلازما.
الرقم 6.
متلازمة بارديه-بيدل مطلوبة (BBS) البروتينات للاتجار LepRb. (A) التعديلات للاتجار LepRb في BBS1- والخلايا المنضب BBS2. و transfected ARPE 19 الخلايا مع FLAG-LepRb جنبا إلى جنب مع تدافعت (السيطرة)، BBS1 أو BBS2 رني يبني. تم بحثها توطين LepRb (الخضراء) وTGN46 (الأحمر) بواسطة المجهر المناعي غير المباشر. وترد، الصور المدمجة مع تلوين دابي (نواة الأزرق). (أشرطة مقياس: 10 ميكرون). (B) النسبة المئوية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل (يحدده FLAG المناعي) مع حويصلات كبيرة. القيم هي متوسط من ثلاث تجارب وأحصت ما لا يقل عن 120 الخلايا في كل تجربة. البيانات يعني ± SEM.
قد تورطت البروتينات BBS في الاتجار البروتين / حويصلة على طول أنيبيب
(9، 10). ولكن، كيف يرتبط هذا الوظيفة العامة مع المكونات الفردية من النمط الظاهري BBS لم يكن معروفا. وتقدم هذه الدراسة الآلية الفيزيولوجية المرضية للسمنة في BBS على المستوى الجزيئي. دراستنا تقدم دليلا على أن مقاومة اللبتين الناجمة عن الشاذة الاتجار LepR والموهن LepR يشير في منطقة ما تحت المهاد هو سبب السمنة المرتبطة BBS. علينا أن نبرهن على القضاء على السمنة وhyperleptinemia لا يستعيد حساسية هرمون الليبتين في الفئران BBS، مشيرا إلى أن المقاومة اللبتين هو الجوهرية بدلا من الثانوية إلى hyperleptinemia والسمنة. علينا أن نبرهن أيضا أن البروتين BBS1 يتفاعل جسديا مع الإسوي إشارات من LepR، LepRb وأن البروتينات BBS مطلوبة للاتجار السليم للLepRb.
وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن البروتينات BBS توسط الاتجار LepRb بين جولجي ومناطق محددة من غشاء البلازما (مثل الدهون طوف، الغشاء الهدبي). في غياب البروتينات BBS، منزعجة الاتجار LepRb والموهن LepRb الإشارات. وهذا يتفق مع النتائج السابقة أن البروتينات BBS ضرورية لتوطين G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs) لأهداب الخلايا العصبية
(30). على الرغم من أننا اختبار العديد من الأجسام المضادة ضد LepR، لم نكن قادرين على كشف LepRb في شرائح مخ الفأر. قد يكون هذا بسبب انخفاض مستوى سطح التعبير ودوران سريع للLepRb
(26، 27). ومع ذلك، فقد تم العثور على LepRb في هدب من الخلايا الظهارية حاسة الشم
(31)، مما يوحي بأن LepRb قد حصر إلى هدب من الخلايا العصبية المهاد.
من مفارز BBSome أظهرت BBS1 فقط التفاعل الجسدي مع LepRb. أثبتنا سابقا أن BBS1 أيضا تفاعلت مع Rabin8، وهو عامل الصرف الناتج المحلي الإجمالي / GTP لRab8
(9). هذه الملاحظات تثير احتمال أن BBS1 هو الوحيدات ملزم البضائع من BBSome. وبالتالي، فإنه من مصلحة لاختبار ما إذا كان GPCRs mislocalized في BBS الخلايا العصبية متحولة (على سبيل المثال Sstr3 وMchr1) تتفاعل أيضا مع BBS1
(30). خلايا ومع ذلك، عيوب الاتجار LepRb المماثلة الملحوظة في BBS2 المنضب وعدم وجود ارتباط الوراثي، النمط الظاهري واضح بين مختلف الطفرات BBS تشير إلى أن سلامة BBSome مهمة لوظيفتها في الاتجار وأن فقدان أي مفارز BBSome يمكن أن تؤدي إلى نفس النمط الظاهري (mistrafficking من البضائع).
ومن المثير للاهتمام، في BBS الحيوانات فقدان وظيفة LepRb يبدو أن تكون انتقائية. في الواقع، على الرغم من أن التعبير عن
Agrp، نبي وPOMC تنظم وقبل كل شيء ليبتين
(1)، تأثر فقط التعبير الجيني
POMC في الفئران BBS. وهكذا، تظهر فقدان العمل ليبتين أن يقتصر على الخلايا العصبية POMC. الاجتثاث الجيني للLepRb تحديدا في الخلايا العصبية POMC يؤدي إلى فرط الأكل وزيادة كتلة الدهون في الفئران
(32، 33). في الفئران BBS، الموهن LepRb يشير في الخلايا العصبية POMC يرجح السبب الرئيسي للسمنة. هذه النتائج متسقة مع النتائج الأخيرة التي دافنبورت
وآخرون. (34) تبين أن تعطل بروتينات النقل intraflagellar، Tg737 أو Kif3a، وهي مطلوبة لتكون الأهداب، وتحديدا في الخلايا العصبية أسفرت POMC في فرط الأكل والبدانة لدى الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، في حين أن الفئران BBS مقاومة لعمل هرمون الليبتين في خفض وزن الجسم وتناول الطعام، لديهم متعاطفة / استجابة القلب والأوعية الدموية الحفاظ على ليبتين
(11)، ودعم الفقدان الانتقائي وظيفة LepRb في الفئران BBS. في الواقع، لم تلغ اللبتين إشارات تماما في BBS الفئران. جزء من الإشارات LepRb موجود كما هو مبين من خلال تفعيل STAT3 المتبقية بعد العلاج ليبتين. وهكذا، يبدو أن البروتينات BBS لازما ل"فعالة" يشير LepRb، وهو أمر ضروري للسيطرة على سلوك التغذية، في حين أن مستوى "منخفض" من LepRb الإشارات ما زالت transduced في غياب البروتينات BBS وهذا المستوى من الإشارات غير كافية لزيادة متعاطفة النشاط العصبي وضغط الدم. توطين LepRb إلى مجال محدد في غشاء البلازما قد تكون هناك حاجة لهذا يشير الى "فعالة"، في حين LepRb في أماكن أخرى من غشاء البلازما قد تكون كافية لتنبيغ مستوى "منخفض" للإشارة. بدلا من ذلك، شرط البروتينات BBS في إشارة LepRb قد تكون محددة لبعض أنواع الخلايا و / أو مؤثرات المصب. هذه هي الأسئلة المهمة التي تستدعي إجراء المزيد من الدراسات.
في البشر، وقد تم الإبلاغ عن المتغيرات من
BBS2، BBS4 وBBS6 الجينات لتترافق مع السمنة في الأفراد BBS غير
(35). في الواقع، كان مرتبطا البديل في الجين
BBS2 إلى السمنة الكبار المشتركة، وارتبطت الأشكال في
BBS4 وBBS6 الجينات مع البدانة في مرحلة الطفولة المبكرة الحدوث المشتركة والشائعة السمنة المرضية الكبار. إذا كانت المتغيرات محددة من الجينات المرتبطة بالسمنة
BBS مشتركة تؤثر إشارات LepRb و / أو الاتجار يزال يتعين تحديد.
باختصار، حددنا عيب معين أن تمثل البدانة في نماذج الماوس من BBS. النتائج التي توصلنا إليها تشير إلى أن mistrafficking ويشير الموهنة للLepRb هو السبب الرئيسي لاختلال توازن الطاقة مما يؤدي إلى السمنة في BBS. ويمثل هذا العيب آلية المرضية جديدة للمقاومة اللبتين مع الآثار المحتملة للسمنة الإنسانية المشتركة.
للحصول على وصف مفصل للمواد وطرق، الرجاء الاطلاع على
المواد التكميلية، التي تصدر عن دعم المعلومات على الموقع
الوراثة الجزيئية البشرية.
الحيوانات
جيل من
Bbs2 - / -،
Bbs4 - / -
وBbs6 - وصفت الفئران والتنميط الجيني سابقا (- /
+15 -
+17). وافقت جامعة أيوا جنة البحوث الحيوانية كافة البروتوكولات.
وتم إيواء الضوابط حسب نوع الجنس والعمر المتطابقة والفئران BBS في أقفاص الفردية في 6-8 أسابيع من العمر
Bbs2 - / -،
Bbs4 - / -
وBbs6 - / - أعطيت الحيوانات 70-80٪ من المواد الغذائية التي يستهلكها wild- نوع يتحكم كل يوم حتى اليوم قبل العلاج ليبتين. وتم تجهيز الحيوانات مع ICV حقنة عادية كما هو موضح سابقا
(36). مركبة أو ليبتين الماوس المؤتلف (2 ميكروغرام في 1 ميكرولتر، أنظمة R & D، مينيابوليس، مينيسوتا) تم حقن ICV. تم التضحية الفئران 24 ساعة بعد تناوله ICV اللبتين، وتم قياس كمية الغذاء ووزن الجسم. لSTAT3 تحليل الفسفرة، تمت إزالة الطعام 18 ساعة قبل حقن ICV. تم حقن هرمون الليبتين أو مركبة ICV والحيوانات التضحية في وقت لاحق 2 ساعة قبل CO 2 الاختناق. الوطاء تم تشريح بسرعة والمتجانس في المخزن المؤقت تحلل. تم تحميل مقتطفات من البروتين على 4-12٪ NuPAGE مكرر تريس المواد الهلامية وتحليلها بواسطة immunoblotting.
حسب نوع الجنس والعمر المتطابقة الضوابط من النوع البري
وBbs2 - / -
وBbs6 - / - تم إيواء الحيوانات في أقفاص الفردية في 9-13 أسابيع من العمر مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء. بعد أسبوعين، تم زرع الفئران مع ICV حقنة عادية كما هو موضح أعلاه. تم قياس وزن الجسم وتناول الطعام يوميا لمدة أربعة أيام متتالية قبل الحقن ICV وتستخدم القيم الأساسية. لكل الوراثي، والفئران التي عولجت مع مركبة أو MTII والمطابقة الوزن. تم التضحية الحيوانات 24 ساعة بعد MTII (1 ميكروغرام في 1 ميكرولتر؛ فينيكس الصيدلة شركة، بورلنجام، CA) أو الحقن المركبة CO 2 الخنق، ووزن الجسم، واستهلاك الغذاء وأوزان البني الأنسجة الدهنية والدهون الإنجاب كما تم قياس موضح سابقا
(11، 25، 36). تم استخراج الحمض النووي الريبي من الماوس الوطاء باستخدام TRIzol الكاشف (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا). تم تصنيعه DNA مكملة من 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع وتستخدم لQPCR مع معدل الذكاء SYBR الخضراء Supermix (بيو راد، هرقل، CA) وMx3000P نظام QPCR (Stratagene، لا جولا، كاليفورنيا). تم احتساب النسبي التعبير الجيني من خلال طريقة ΔΔCt التالية التطبيع مع RPL19
(37). وتأكدت المنتجات PCR من خلال تحليل تذوب منحنى والتسلسل. وتظهر تسلسل التمهيدي في
التكميلية مادة النص.
تم perfused الفئران مع بارافورمالدهيد 4٪ / 0.5٪ غلوتارالدهيد في الفوسفات مخزنة المالحة (2.5 مل / دقيقة، 50 مل). وقد اقتطعت الدماغ كله والمحتضنة في نفس ليلة وضحاها تثبيتي في 4 ° C ثم نقل إلى 30٪ محلول السكروز. تم العقول مقطوع vibratome مع 45 ميكرون سمك. تم permeabilized أقسام التعويم الحر في المياه المالحة الفوسفات مخزنة مع 0.25٪ تريتون X-100 (0.25٪ تريتون X-100)، سدت 3٪ مصل الماعز العادي ومزينة أرنب الأجسام المضادة لمكافحة POMC (1: 4000)، الماعز البيروكسيديز مفتش المضادة للأرنب (1: 200) وVectastain النخبة ABC مجموعة (المتجهات مختبرات، بورلنجام، CA).
ترنسفكأيشن وشارك في مناعي
و transfected الخلايا HEK293T في لوحات ستة جيدا مع 1 ميكروغرام من CS2FLAG-LepR و1 ميكروغرام من أشار HA الموسومة البروتينات BBS باستخدام FuGENE HD (روش العلوم التطبيقية، انديانابوليس، IN). تم immunoprecipitated لست] الخلية مع مكافحة Myc على (9E10، سانتا كروز، سانتا كروز، كاليفورنيا) أو مكافحة HA (F-7؛ سانتا كروز، سانتا كروز، كاليفورنيا) الأجسام المضادة مترافق إلى الاغاروز. وقد تم تحليل البروتينات التي عجلت القياسية دوديسيل الصوديوم وكبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام وimmunoblotting.
المناعي
وكانت المصنفة ARPE 19 الخلايا على الزجاج زلات غطاء في 24 لوحات جيدا ومع transfected جميع 1 ميكروغرام من الحمض النووي باستخدام FuGENE HD (روش، انديانابوليس، IN). تم إصلاح الخلايا مع الميثانول لمدة 6 دقائق في -20 درجة مئوية، ومنعت مع 5٪ BSA و 3٪ مصل الماعز العادي وزينت مع الأجسام المضادة الأولية المشار إليها. واستخدمت اليكسا الدقيق 488 الماعز المضادة للماوس مفتش (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا) واليكسا الدقيق 568 الماعز المضادة للأرنب مفتش (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا) للكشف عن الأجسام المضادة الأولية.
التحليل الاحصائي
وأعرب عن النتائج كما يعني ± SEM. تم إجراء مقارنات بين المجموعات عن طريق باتجاه واحد أو تحليل التباين الثنائي (ANOVA) مع طريقة فيشر LSD التحليل البعدي للمقارنات متعددة البشرى، حسب الاقتضاء. P <0.05 اعتبرت أن تكون ذات دلالة إحصائية.
« آخــر المشـاركــات »
11-23-2015, 08:52 PM
شرط بارديه-بيدل البروتينات متلازمة ليبتين مستقبلات الإشارات
العرض الشجري