عرض مشاركة واحدة
  #7  
قديم 11-22-2015, 08:38 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي Spastin وatlastin، اثنين من البروتينات المتحورة في راثي المهيمنة الشلل النصفي التشنجي وراثي، وشركاء ملزمة

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/15/2/307.full


ملخص

وparaplegias تشنجي وراثية نقية (شركائنا HSPs) هي مجموعة من الظروف التي يوجد فيها تقدمية تعتمد على طول انحطاط الغايات البعيدة للمحاور السبيل القشري، مما أدى إلى شلل تشنجي في الساقين. في معظم الأحيان يتم توريث شركائنا HSPs نقية في نمط وراثي جسمي وتسبب عادة من قبل الطفرات إما في spastin SPG4 الجينات أو في atlastin SPG3A الجينات. تحديد الشركاء ملزم للspastin، قمنا بإجراء الخميرة شاشة يومين الهجين على مكتبة [كدنا الدماغ، وذلك باستخدام spastin كطعم. بشكل ملحوظ، وكلها تقريبا من المتفاعل استنساخ فريسة إيجابية مشفرة لatlastin. لقد تحققنا من أهمية الفسيولوجية لهذا التفاعل باستخدام المشارك مناعي، الجلوتاثيون S -transferase المنسدلة والخلايا التجارب المشارك الترجمة. وتبين لنا أن المجال spastin اللازمة للربط إلى atlastin يكمن داخل N-80 محطة بقايا من البروتين، وهي المنطقة التي هي موجودة فقط في الغالب حشوية، كامل طول الإسوي spastin. وتشير هذه البيانات إلى أن spastin وظيفة atlastin في نفس مسار الكيمياء الحيوية، وأنها هي وظيفة حشوية من spastin وهو أمر مهم لإمراض HSP. كما أنها توفر المزيد من الأدلة على وجود دور الفسيولوجية والمرضية من spastin في ديناميات غشاء.
مقدمة

وparaplegias تشنجي وراثي (شركائنا HSPs) هي مجموعة متنوعة من الظروف العصبية مصممة وراثيا التي تشترك كل ميزة السريرية الرئيسية من الشلل التشنجي التدريجي في الأطراف السفلية. فإنها تصنف تقليديا كما نقية، أو عندما يترافق الشلل النصفي التشنجي بمظاهر سريرية أخرى بارزة، المعقدة (+1 - 3). ويعتبر النقي HSP عموما كنوع الأكثر شيوعا في شمال أوروبا وأمريكا الشمالية (4). في شركائنا HSPs نقية، والخلايا أهم إصابة هي الخلايا العصبية الحركية الجهاز القشري (غالبا ما تسمى "الخلايا العصبية الحركية العليا)، وتنعكس الصورة السريرية للشلل سفلي تشنجي التدريجي في النتائج المرضية التدريجي، طول التابعة، البعيدة 'dying- عودة 'انحطاط المحاور السبيل القشري (1). تحديد الجينات المسؤولة عن شركائنا HSPs وتوضيح وظيفة البروتينات المقابلة هو بداية لتوفير معلومات هامة في المسارات الجزيئية التي هي مهمة للحفاظ محور عصبي والحركية وظيفة الخلايا العصبية.
وقد تم تعيين ثمانية جسمية مهيمنة مواضع HSP نقية دراسات الربط الوراثية (إعادة النظر في 1،2،5). وقد تم إحراز تقدم سريع في تحديد جينات المرض في هذه المكاني، مع خمسة، atlastin (SPG3A)، spastin (SPG4)، NIPA1 (SPG6)، KIF5A (SPG10) وHSP60 (SPG13)، بعد أن تم عزلها حتى الآن (6 - 10). الطفرات في spastin وatlastin هي الأكثر شيوعا وتقدر لحساب 40 و 10٪ من الأسر HSP نقية جسمية مهيمنة على التوالي (5، 11 - 13).
وأعرب عن نص spastin على نطاق واسع داخل الجهاز العصبي والأنسجة في غير العصبية، ولكن يتم التعبير بشدة في الفئات الفرعية من الخلايا العصبية (7، 14، 15). وقد اقترحت الدراسات Immunolocalization في مجموعة متنوعة من الأنسجة وأنواع الخلايا عموما أن البروتين على حد سواء توزيع حشوية والنووي (+14 - 17). في الآونة الأخيرة، أصبح من الواضح أن هذا هو بسبب الفرق توطين اثنين إيسفورمس الرئيسية للبروتين: شكل اقتطاع N-المحطة الطرفية النووي وحشوية، في حين يتم تصدير شكل كامل طول أقل وفرة بنشاط من النواة إلى السيتوبلازم ( 18). وقد وصفت توزيع حشوية كما منقط ومحيط بالنواة في دراسة واحدة (16)، في حين أنه في آخر، تم العثور spastin في المناطق الخلوية هيولية تحتوي على الأنابيب الدقيقة الحيوية، والتي تضمنت في خط الخلية العصبية محور عصبي القاصي ونقاط فرع محور عصبي (17). في الأنسجة العصبية البشرية، يقع spastin في السيتوبلازم ومتشابك محطات عدة أنواع الخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا العصبية الحركية، وإن كان في غيرها من أنواع الخلايا العصبية، تم الكشف عن ذلك في النواة (15).
وفيما يتعلق ظيفة حشوية من spastin، الرئيسيتين، وربما ذات الصلة، وقد اقترحت الأدوار الخلوية. Spastin هو AAA أتباز ترتبط ارتباطا وثيقا في تسلسل لP60 katanin، وهو أنيبيب قطع البروتين، ومجموعة متنوعة من البيانات تشير إلى أن spastin من المرجح أن يكون لها دور في الأنابيب الدقيقة قطع (19، 20). في الخلايا المستزرعة معربا عن الموسومة حاتمة spastin، ارتبط التعبير عن بروتين مع ظهور حزم أنيبيب كسر في غضون السيتوبلازم. في هذه التجارب، والبروتين المترجمة إلى منقط منفصلة الهياكل حشوية لا تقابل العضيات معروفة، ولكن تذكر من تلطيخ منقط ينظر في بعض الدراسات الأجسام المضادة لبروتين الذاتية (19). وعلاوة على ذلك، أدى التعبير عن تحور-أتباز خلل spastin في ضرب خيوط حشوية التي تحتوي على واحدة الأنابيب الدقيقة (19، 21). هذه النتائج متوافقة مع توطين spastin الذاتية للمناطق حشوية الغنية في الأنابيب الدقيقة الحيوية. بيانات من نماذج ذبابة الفاكهة أيضا دعم وجود علاقة بين ذبابة الفاكهة spastin (D spastin) ومنظمة أنيبيب في الخلايا العصبية والأنسجة الأخرى (22، 23، 24).
وبصرف النظر عن دوره في تنظيم أنيبيب، كما أشير إلى أن spastin قد يكون متورطا في أحداث المرور غشاء الخلايا. وقدم هذا الاقتراح لأول مرة عندما كان من المسلم به أن spastin له أنيبيب N-محطة التفاعل والاتجار (MIT) المجال (25، 26). معظم، إن لم يكن كلها، والبروتينات الأخرى التي تحتوي على هذا النطاق لها أدوار في حركة الغشاء (26). وقد عززت الأدلة على تورط spastin في أحداث المرور غشاء مؤخرا تعريفنا لمنطقة CHMP1B البروتين endosomal كشريك ملزم للspastin (27). CHMP1B يموضع إلى الإندوسومات ويرتبط مع ESCRT-III (endosomal الفرز المعقدة اللازمة لنقل-III)، وهو بروتين معقد الذي يعمل في فرز بروتينات ubiquinated أحادية للجسم عديد الحويصلات، حجرة التقامي prelysosomal (إعادة النظر في 27). حددت هذه الدراسة أيضا بروتين الغشاء جولجي، gp25L2، كشريك محتمل ملزم لspastin، على الرغم من عدم يتميز هذا التفاعل تماما حتى الآن (27). كما ترتبط العديد من الفعاليات المرورية غشاء بالنقل القائم على أنيبيب، فمن غير المستبعد أن حركة الغشاء والأدوار التي تنظم أنيبيب من spastin قد تكون بين ذات الصلة.
يتكون هذا الجين atlastin من 14 الإكسونات، الذي رمز لبروتينا 558 الأحماض الأمينية طويلة (6). يتم التعبير عن الجينات في العديد من أنسجة الجسم، مع أعلى التعبير في الدماغ والحبل الشوكي (6). مع استثناءات نادرة، والطفرات في بداية مرحلة الطفولة atlastin سبب HSP. وكانت معظم الطفرات atlastin نشرت حتى الآن الطفرات مغلطة، مع طفرة انزياح الإطار وصفه (28 - 34).
البروتين atlastin هو GTPase رواية مشابهة لأفراد الأسرة dynamin من GTPases كبيرة (6). فقد اثنين من المجالات عبر الغشاء المفترضة مع طوبولوجيا غشاء مما أدى إلى N- وC-تيرميني التعرض إلى السيتوبلازم (35). الموقع GTPase نشطة وتتشكل من بقايا في ثلاثة أفكار، وP-حلقة، DxxG وRD الزخارف. قد oligomerize البروتين لتشكيل homotetramers (35).
وقد تمت دراسة توزيع الخلوي للatlastin في أقسام الدماغ الفئران (35). هنا، كانت خلايا إيجابية atlastin الأكثر وفرة في الصفيحة V من القشرة الدماغية، مع كل من سوما الخلايا العصبية وشجيري شجرة تحتوي على atlastin. على المستوى التحت خلوية في الفئران مثقف الخلايا العصبية تحت القشرية، وatlastin تقع في الغالب في جهاز رابطة الدول المستقلة -Golgi، مع منقط تلطيخ ينظر أيضا في المحاور والتشعبات. واعتبر بعض محدود شارك في التعريب مع الشبكة الإندوبلازمية (ER) علامات أيضا (35). يبقى دور وظيفي دقيق لatlastin في غشاء جولجي أو في غيرها من مواقع عضية الغشاء إلى توضيح.
في هذه الدراسة، شرعنا في اكتساب رؤى إضافية إلى وظيفة spastin، من خلال تحديد الشركاء ملزم جديد للبروتين. وجهت لنا السابقة الخميرة spastin شاشة يومين الهجين ضد مكتبة erythroleukaemia كدنا] (27). من أجل تحديد الشركاء ملزم التي قد تكون مهمة لوظيفة spastin في النظام العصبي المركزي، كررنا الخميرة شاشة يومين الهجين باستخدام مكتبة [كدنا مخ الجنين. بشكل ملحوظ، الواردة عن ما يقرب من الحيوانات المستنسخة التفاعل الإيجابي كدنا] atlastin، مما يشير بقوة إلى أن هذين البروتينات HSP تتفاعل مع بعضها البعض. لقد أكد هذا التفاعل المحتملين من خلال التجارب المشتركة مناعي وسحب إلى أسفل، جنبا إلى جنب مع دراسات شارك في توطين باستخدام الموسومة حاتمة من النوع البري والبروتينات متحولة في خطوط الخلايا العصبية وغير العصبية. معا، وتوفر هذه البيانات والأدلة التجريبية الأولى التي اثنين من البروتينات المشاركة في HSP التفاعل بأنفسهم. أنها توحي بأن spastin وatlastin المشاركة في نفس مسار الكيمياء الحيوية وعلم الأمراض الجزيئي أن من spastin وatlastin HSP هو ذات الصلة. كما أنها توفر دليلا إضافيا على أن spastin تشارك في أحداث المرور الغشاء.

النتائج

الخميرة اثنين الهجين، الجلوتاثيون S -transferase (GST) المنسدلة وشارك في مناعي التجارب تحدد atlastin كشريك ملزم من spastin

استخدمنا كامل طول spastin البروتين ك "الطعم" لفحص الخميرة الإنسان يومين الهجينة مكتبة كدنا] دماغ الجنين عالية التعقيد (Clontech)، وذلك باستخدام الأساليب المذكورة سابقا (27). هذه الشاشة ولدت 15 استنساخ مضاعفا الإيجابية التي نمت على انتقائية وسائل الإعلام التي تفتقر إلى الأدينين وكانت ايجابية للنشاط β غالاكتوزيداز. عندما تم اختبار هذه التفاعلات الأساسية في الخميرة الطازجة، تم العثور على ثمانية على حد سواء استنساخه والطعم محددة، مع إعطاء قوي النشاط β غالاكتوزيداز والنمو القوي في المتوسط ​​انتقائية تفتقر التربتوفان، ليسين والأدينين (-W / L / A). بشكل ملحوظ، ولكن كل اثنين من الإيجابية "فريسة" استنساخ الواردة atlastin تسلسل الترميز.
من أجل التحقق من مدى أهمية التفاعل المفترض بين spastin وatlastin، قمنا أولا من التجارب GST المنسدلة. انسحب GST-spastin بنجاح أسفل atlastin من المحللة من خلايا عابر مع ناقلات التعبير الثدييات يحتوي ج. Myc على الموسومة atlastinΔTM (MYC-atlastinΔTM؛ الشكل 1)، مشيرا إلى أن اثنين من البروتينات قادرة على التفاعل الكيميائي (الشكل. 2 A). نحن تتميز بجانب المجالات البروتين spastin اللازمة للتفاعل مع atlastin، باستخدام الخميرة اثنين الهجين وGST التجارب المنسدلة. اختبرنا atlastin ناقلات فريسة ضد الخميرة ناقلات الطعم يومين الهجينة التي تحتوي على إدراج الترميز لعدة أشكال اقتطاع من spastin، spastinΔAAA، spastinΔN1 وspastinΔN2 (الشكل 1). وجدنا أن الخميرة واستمر التفاعل هجين اثنين مع spastinΔAAA الطعم متجه، لكنه خسر عندما استخدمت spastinΔN1 وspastinΔN2 الطعوم (الشكل 2 B). المقايسات أسفل سحب باستخدام GST-atlastinΔTM ولست] خلية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع أشكال متحولة من spastin كانت أيضا بما يتفق مع هذه النتائج؛ كان GST-atlastinΔTM قادرة على هدم MYC-spastinΔAAA وMYC-spastinK388R (شكل من أشكال spastin تحتوي على طفرة مغلطة الأمراض المرتبطة)، ولكن ليس MYC-spastinΔN1 أو spastinΔN2-GFP، من لست] من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع بناء ذات الصلة (الشكل . 2 C). وتشير هذه البيانات إلى أن منطقة spastin المسؤولة عن التفاعل مع atlastin تكمن في N-محطة من البروتين، من بقايا 1-80. وقد أظهرت البيانات الأخيرة أن spastin فقد اثنين من مواقع الترجمة بدء، الأولى في كودون 1 والثانية في كودون 87، مما أدى إلى إنتاج اثنين إيسفورمس spastin الرئيسية، نادر، في الغالب حشوية، شكل كامل طول (~68 كيلو دالتون حجم) وأكثر وفرة أقصر، الإسوي النووي وحشوية (~60 كيلو دالتون) (18). الوضع تعقيدا بسبب وجود أحداث الربط بديلة، مما يؤدي إلى وجود إصدارات اكسون طفيفة 4 حذف للإيسفورمس طويلة وقصيرة (في ~64 و 55 كيلو دالتون، على التوالي). لذا بيانات التفاعل لنا المجال تشير إلى أن فقط طويلة (أي 68 و 64 كيلو دالتون) إصدارات الإسوي من spastin قادرة على التفاعل مع atlastin.

الشكل 1. التركيبات المستخدمة في هذه الدراسة. رسم تخطيطي يظهر بنية المجال البرية من نوع (WT) spastin وatlastin، جنبا إلى جنب مع هيكل إدراج الأخرى المستخدمة في التركيبات. وتعطى الترقيم الأحماض الأمينية فوق كل بناء، في حين يتم عرض موقف طفرة نقطة K388R التي شملتها الدراسة في الخط الرمادي فوق التوضيح spastin WT. HR، المنطقة مسعور. AAA، AAA أتباز كاسيت. GTPase، GTPase كاسيت. TM، مجال الغشاء.


الشكل 2. Spastin وatlastin تتفاعل كيميائيا.
> كان يستخدم (A) GST-spastin في تجربة المنسدلة باستخدام المحللة خلية من خلايا هيلا مع transfected MYC-atlastinΔTM. واعتبر فرقة من الحجم الصحيح لMYC-atlastinΔTM في حارة المنسدلة (حارة 4)، ولكن ليس في الممرات من التجارب التي تفتقر إلى البروتين GST (حارة 1)، والتجارب باستخدام فارغة ضريبة السلع والخدمات بدلا من GST-spastin (حارة 2 )، أو التجارب التي تم فيها إضافة أي المحللة خلية (حارة 3). ونفذت (B) التحقيق في المجالات spastin المسؤولة عن التفاعل مع atlastin خارج باستخدام الخميرة اثنين الهجين. يظهر سيطرة العمود 1 نمو المستعمرات مضاعفا على وسائل الإعلام التي تفتقر التربتوفان ويسين (-W / L) لتحديد وجود كل من الطعم وناقلات فريسة. ويبين العمود 2 نمو المستعمرات مضاعفا على وسائل الإعلام التي تفتقر التربتوفان، ليسين والأدينين (-W / A / L)، الأمر الذي يتطلب تفعيل مراسل الجين أدي، في حين أن العمود السيطرة 3 يظهر نمو المستعمرات مضاعفا على وسائل الإعلام التي تفتقر التربتوفان، يسين والحامض الاميني (-W / H / L)، الأمر الذي يتطلب تفعيل صاحب مراسل الجينات. في كل حالة، تم استخدام spastin أو متحولة spastin كما البروتين "الطعم"، في حين كان يستخدم atlastin باسم 'فريسة'. كامل طول spastin وspastinΔAAA التفاعل مع atlastin، ولكن spastinΔN1 وspastinΔN2 لا. لم يكن التفاعل الحالي مع فريسة غير محددة (LSM2). تجارب (C) GST المنسدلة باستخدام GST-atlastinΔTM مقابل لست] خلية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع ذكر يبني أكدت الخميرة النتيجتين الهجينة. كان البروتين GST الانصهار قادرة على هدم MYC-spastinΔAAA وMYC-spastinK388R، ولكن ليس MYC-spastinΔN1 أو spastinΔN2-GFP. (D) المشارك مناعي من عابر. MYC-spastin وatlastin-GFP في الخلايا HEK293T. بعد أربع وعشرين ساعة ترنسفكأيشن، وimmunoprecipitated البروتينات الموسومة (IP) باستخدام الأجسام المضادة بولكلونل مكافحة GFP وimmunoblotted (IB) مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للMYC. وكانت فرقة من الحجم المتوقع لtransfected كامل طول MYC-spastin شارك في immunoprecipitated مع atlastin-GFP. كان لا الفرقة الحالية عندما تم حذف الأجسام المضادة لمكافحة GFP من رد فعل مناعي. (E) محاولة المشارك مناعي من عابر. MYC-spastin وناقلات فقط EGFP كعنصر تحكم السلبية لل(D). لم يشارك immunoprecipitated-MYC-spastin مع GFP. لقطع (D) و (E)، وتبين الممرات إدخال ألفا-MYC وα-GFP immunoblots الكسور المدخلات، مؤكدا التعبير من البروتينات ذات الصلة في الخلية لست] تستخدم لimmunoprecipitations. (F) spastin الذاتية وatlastin موجودة في الخلايا NSC34. تم تحديد Spastin باستخدام الأجسام المضادة spastin S51. هذه الأجسام المضادة يكشف عن ثلاث فرق في هذا صمة عار، الموافق إيسفورمس مختلفة من spastin كامل طول (68 كيلو دالتون، السهم إلى اليمين من الممر موقف علامات)، شكل قصيرة (60 كيلو دالتون) والبديل النموذج القصير تفتقر اكسون 4 (55 كيلو دالتون). اكسون كامل طول الإسوي تفتقر 4 (64 كيلو دالتون) هو من هذا القبيل وفرة المنخفضة التي لا ينظر إليها على هذا وصمة عار. باستخدام 5409 الأجسام المضادة لمكافحة atlastin، شوهدت فرقة واحدة من ~55 كيلو دالتون. (G) في ظل ظروف تغيير طبيعة، وimmunoprecipitated atlastin بقوة من خلايا NSC34 من قبل الضد 5409 atlastin. يظهر الممر الأيسر والمحللة خلية الإدخال، بينما يظهر في الممر الأيمن لimmunoprecipitate. وقد نشف على حد سواء مع الأجسام المضادة atlastin. (H) atlastin الذاتية وMYC-spastin وشارك في immunoprecipitated من خلايا NSC34. كان يستخدم لمكافحة atlastin 5409 أجسام مضادة لimmunoprecipitate في ظل ظروف تغيير طبيعة وأجريت immunoblotting استخدام الألغام المضادة MYC. فرقة من حجم المتوقع لMYC-spastin موجودة في المحللة المدخلات وفي immunoprecipitate. وكانت هذه الفرقة غائبة عندما تم استخدام الأجسام المضادة السيطرة زائف (مكافحة GFP) لتنفيذ مناعي. العلامات النجمية علامة على موقف المناعي كانت أيضا موجودة عندما تم حذف الأجسام المضادة لمكافحة MYC الأساسي من إجراء immunoblotting (لا تظهر البيانات) العصابات هذه. يتم عرض موقف العصابات علامة ذات الصلة إلى اليسار من كل وصمة عار.

حاولنا المقبل للتحقق من ملاءمة الفسيولوجية للتفاعل spastin atlastin من خلال التجارب المشتركة مناعي. شاركنا immunoprecipited-حاتمة الموسومة MYC spastin وatlastin-GFP، معربا عن عابر هذه البروتينات في الخلايا HEK293T وimmunoprecipitating مع مكافحة GFP الأضداد. immunobloting اللاحقة من الراسب مع مكافحة MYC كشفت عن وجود عصابة من حجم المتوقع ل-MYC spastin (~68 كيلو دالتون؛ الشكل 2 D). وكانت هذه الفرقة لم تكن موجودة عندما تم حذف الأضداد GFP من رد فعل مناعي أو عندما تم تنفيذ مناعي من استخدام الخلايا transfected المشترك مع-MYC spastin وناقلات GFP فارغة (الشكل 2 E).
وأخيرا، حاولنا إجراء التجارب المشتركة مناعي باستخدام الأجسام المضادة لspastin الذاتية وatlastin. كنا اثنين من الأجسام المضادة التي نشرت في هذه التجارب. كان أول S51، الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة لمكافحة spastin (هدية كريمة من ايلينا Rugarli) (17). هذه الأجسام المضادة يمكن الكشف عن إيسفورمس spastin الرئيسية في الخلية لست] NSC34 (الشكل 2 F)، وقادر على immunoprecipitating spastin. كان الضد الثاني الأرنب بولكلونل مكافحة atlastin الأجسام المضادة (5409 وهدية عينية من كريغ بلاكستون) (35). هذه الأجسام المضادة يكشف عصابة قوية واحدة تقريبا في حجم توقع لatlastin (ج 55 كيلو دالتون) على النشاف الغربي من NSC34 المحللة خلية (الشكل 2 F). على مناعي خلايا NSC34 في ظل ظروف غير تغيير طبيعة استخدام إما spastin S51 الأجسام المضادة أو الأجسام المضادة atlastin، كنا قادرين على إثبات أي شريك مناعي الشريك ملزم المفترض الذاتية. كما كنا بالقلق من أن مناعي من atlastin من الأجسام المضادة atlastin كان ضعيفا في ظل ظروف غير تغيير طبيعة، ونحن التحقيق في قدرة هذه الأجسام المضادة إلى immunoprecipitate atlastin من خلايا NSC34 في ظل ظروف تغيير طبيعة وجدت مناعي قوي (الشكل 2 G). لذا أجرينا التجارب المشتركة مناعي في ظل ظروف تغيير طبيعة، علاج الخلايا مع dithiobis الكيميائية عبر رابط [succinnimidyl بروبيونات] (DSP) قبل تحلل، من أجل الحفاظ على تفاعلات البروتين البروتين. ومع ذلك، كنا لا نزال غير قادرين على إثبات أي شريك مناعي من spastin الذاتية (لا تظهر البيانات).
نحن افترضنا أن السبب في أننا لم يستطع إثبات أي تفاعل بين البروتينات الذاتية كان بسبب وفرة منخفضة جدا من كامل طول 68 كيلو دالتون spastin (الشكل 2 F)، وشكل قادر على التفاعل مع atlastin. في ضوء ذلك، بحثنا ما إذا كان توفير إضافي كامل طول spastin خارجية المنشأ قد يسمح لنا لإظهار المشترك مناعي مع atlastin الذاتية ووجدنا أن هذا هو الواقع بالفعل. عندما كنا الأجسام المضادة atlastin تحت تغيير طبيعة الظروف لimmunoprecipitate atlastin من خلايا NSC34 معربا عن MYC-spastin، وجدنا أن MYC-spastin كان المشارك immunoprecipitated (الشكل 2 H). لم MYC-spastin المشارك immunoprecipitated عندما تم استخدام الأجسام المضادة immunoprecipitating زائفة (الشكل 2 H).
وباختصار، كنا قادرين على التعرف على التفاعل بين spastin وatlastin بواسطة الخميرة اثنين الهجين، GST المنسدلة والتجارب المشتركة مناعي. وتوفر هذه النتائج دليلا قويا جدا أن spastin وatlastin قادرة على الربط مع بعضها البعض وأن هذا التفاعل له أهمية فسيولوجية.

atlastin الموسومة حاتمة وspastin شارك في توطين في خلايا هيلا وNSC34

وبعد إثبات وجود تفاعل بين spastin وatlastin، وذهبنا بعد ذلك إلى تحديد ما إذا كان هناك أي توطين المشترك بين البروتينات في خلايا الثدييات، وإذا كان الأمر كذلك حيث كان الموقع للتفاعل، عن طريق فحص التوزيع داخل الخلايا حاتمة البروتينات -tagged.
قبل فحص ما إذا كان spastin وatlastin أظهرت الخلايا شارك في الترجمة، وأنشأنا توزيع الخلايا في خلايا الثدييات من الإصدارات الموسومة حاتمة من atlastin، وهذا لم يسبق وصفه. لتقليل احتمالات التغيرات التي يسببها العلامة في التوزيع، التي قطعناها على أنفسنا بنيات معربا إما N-محطة ج-Myc- أو الإصدارات الموسومة GFP C-محطة من كامل طول atlastin ودرست نمط التعبير عن كل بناء المناعي باستخدام متحد البؤر مجهر. في كل حال، يبدو الموسومة حاتمة atlastin في نمط شبكي في جميع أنحاء سيتوبلازم خلايا هيلا عابر.. هذا النمط تلطيخ شبكي بقوة شارك المترجمة مع calreticulin، علامة من ER (الشكل 3 A-F)، ومع الأجسام المضادة لاثنين من البروتينات ER أخرى، PDI (بروتين ثاني كبريتيد مزامرة)، وهو بروتين lumenal، وsec61α، وهو ER بروتين الغشاء (لا تظهر البيانات). في ضوء التفاعل بين spastin وatlastin، والعلاقة بين spastin والأنابيب الدقيقة، درسنا أيضا ما إذا كان atlastin شارك المترجمة مع تويولين. وجدنا جزئي شارك في التعريب بين atlastin الموسومة حاتمة والأجسام المضادة لمكافحة تويولين YL1 / 2 (الشكل 3 G-I)، رغم عدم وجود تأثير الإجمالي لatlastin التعبير على العمارة أنيبيب. هذا التعريب المشترك بين atlastin والأنابيب الدقيقة وربما ليس من المستغرب، كما هو معروف في ER أن يكون لها ارتباط وثيق مع الإطار أنيبيب. اختبرنا أيضا لاشتراكهما في التعريب بين atlastin الموسومة حاتمة وبطارية من علامات الأضداد الأخرى، والتي شملت EEA1 (لالإندوسومات المبكر)، M6PR (لالإندوسومات المتأخرة وشبكة -Golgi غير المشبعة)، Lamp1 (لالجسيمات الحالة)، GM130 (ل جهاز جولجي) وTGN46 (لشبكة -Golgi غير المشبعة). وجدنا بعض محدود شارك في التعريب بين atlastin-GFP وM6PR (الشكل 3 J-L) وGM130 (الشكل 3 M-O)، على الرغم من أننا لا يمكن أن يكون متأكدا ما إذا كان هذا قد يعكس ببساطة حقيقة أن العضيات هذه العلامات كشف وتقع على مقربة من مركز أنيبيب المنظمة، حيث التعبير عن علامات ER هي أيضا قوية جدا.

الشكل 3. حاتمة الموسومة النوع البري ومتحولة atlastin شارك في توطين مع ER وأنيبيب علامات. الصور تظهر خلايا هيلا المسمى مع علامة الضد هو مبين في (A، D، M). (B، E،K، N) إظهار نمط التعبير في نفس الخلايا، عابر. مع بناء يظهر في كل لوحة. لون النص في كل من هذه اللوحات يمثل لون الصورة في المقابلة وحات المدمجة (C، F،L، O). كلا N-محطة-MYC الموسومة (A-C) والموسومة GFP C-محطة (D-F) atlastin شارك في توطين بإحكام مع calreticulin. من النوع البري atlastin أيضا جزئيا شارك يموضع مع علامة أنيبيب YL1 / 2 (G-I). كان هذا التعريب شارك الأقوى في المنطقة محيط بالنواة. وهناك أيضا الجزئي شارك في التعريب مع الراحل endosomal المانوز-6-فوسفات مستقبلات (M6PR) (J-L) وGM130 جولجي علامة (M-O)، لا سيما في منطقة محيط بالنواة التنسيق حيث أظهر atlastin تعبير قوي. الخلايا كانت ثابتة 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. الحانات حجم تشير إلى 10 ميكرون.

بالإضافة إلى التجارب في خلايا هيلا، درسنا نمط التعبير عن الموسومة حاتمة atlastin في ماوس المحرك نوع من الخلايا العصبية، NSC34. ويستمد هذا نوع من الخلايا الهجين من الانصهار بين الفأر الشوكي الخلايا العصبية الحركية الحبل وخط الخلية العصبية والعديد من التشريحية، الدوائية والكهربائية خصائص الخلايا العصبية (36). لج. Myc على وatlastin -GFP الموسومة، وكان نمط التعبير في الخلايا NSC34 مشابهة جدا لتلك التي المقابل البروتين في خلايا هيلا. كان Atlastin التعبير موجودة في كل خلايا الجسم وملحقات محوار (لا تظهر البيانات).
بعد أن أنشأ التوزيع داخل الخلايا الموسومة حاتمة atlastin، درسنا شارك في توطين spastin الموسومة حاتمة وatlastin في خلايا هيلا (الشكل 4 A-G) وNSC34 الخلايا (الشكل 4 H-J). وجدنا جزئي لكنه واضح شارك في التعريب بين spastin وatlastin البروتينات وهذا لا يعتمد على طبيعة أو موقع العلامة حاتمة المستخدمة. كان في توطين شارك في خلايا هيلا عادة في نقاط وحشوية / الأنابيب الصغيرة، والتي أيضا شارك المترجمة مع calreticulin ER علامة (الشكل 4 A-G). في الخلايا NSC34، وقع شارك في التعريب في سوما وneurites التي (الشكل 4 H-J).

الرقم 4. حاتمة الموسومة atlastin وspastin شارك في توطين في خلايا هيلا وNSC34. خلايا هيلا (A - G و K - W) أو خلايا NSC34 (H - J) كانت المشترك مع transfected MYC-spastin وatlastin-GFP (A-J)،-MYC spastin وحدها (K-M)، MYC-spastinK388R وatlastin-GFP (N-Q)، MYC-spastinK388R وحدها (R-T) أو MYC spastin وGFP-VPS4-EQ (U-W). وصفت الخلايا هو مبين في (D-G) و (K-T) أيضا مع ER علامة المضادة للcalreticulin (F، L، P، S). (C، G، J، M، Q، T، W) تظهر الصور المدمجة من الخلايا هو موضح في (A و B)، (D-F)، (H وI)، (K و L)، (N ف)، (R و S) و (U و V)، على التوالي، مع لون النص في كل لوحة تشير إلى صورة ملونة في الصورة المدمجة. في كل من الخلايا هو موضح في (A-J)، هناك محدد شارك في التعريب بين spastin وatlastin البروتينات. كل من البروتينات المترجمة المشترك (D-G) وMYC spastin أعرب وحدها (K-M) كما شارك في توطين مع calreticulin. في الخلايا NSC34 (H-J)، واعتبر المشارك التعريب في كل من سوما ومحوار ملحقات. في الخلايا معربا عن spastin متحولة والبرية من نوع atlastin (N-Q)، وإعادة توزيع atlastin وcalreticulin للمشاركة في توطين مع spastin متحولة في خيوط. خارجي التعبير atlastin ليس من الضروري لcalreticulin ليتم إعادة توزيعها بهذه الطريقة (R-T). وكانت نسبة من-MYC spastin التعبير أيضا على الإندوسومات، كما شارك جزئيا المترجمة مع GFP-VPS4-EQ (U-W، السهام). الخلايا كانت ثابتة 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. الحانات حجم تشير إلى 10 ميكرون.

كما الموسومة حاتمة spastin شارك المترجمة مع atlastin على ER، نحن مصممون المقبل ما إذا كانت بعض spastin الموسومة حاتمة غير موجودة على ER في غياب atlastin خارجي أو ما إذا كان التعبير عن atlastin تسبب في إعادة توزيع spastin إلى ER. وجدنا كبير شارك في التعريب في نقاط ووالأنابيب من مجموعة فرعية من بين MYC spastin مع calreticulin (الشكل 4 K-M)، ولكن هذا لم يكن قويا كما كان توطين ER عندما كان MYC-spastin المشارك أعرب مع atlastin-GFP (الشكل 4 D-G)، مما يشير إلى أن شاركت في التعبير مع atlastin تسبب توظيف spastin لER، ربما لأن مواقع الربط إضافية قدمت هناك من atlastin التعبير. عندما أبديت-GFP spastin وspastin-GFP وحده، وكان شارك في التعريب مع calreticulin الحالي، ولكن ذاتي محدود أكثر من ذلك مع MYC-spastin أيضا.
درسنا القادم ما إذا كانت atlastin شارك المترجمة مع أشكال أتباز معيبة من spastin. درسنا آثار atlastin التعبير على طفرة spastin المسببة للأمراض، K338R. طفرة K388R spastin تلغي وظيفة أتباز ويرتبط مع وضع غير طبيعي، والنمط الظاهري الخيطية عندما أعرب في الخلايا المستزرعة. شعيرات طبيعية جزئيا شارك توطين مع علامات الأنابيب الدقيقة (19، 27). وجدنا أن متحولة spastin الاحتفاظ مظهر الخيطية عندما تم تغيير مع الموسومة حاتمة atlastin وأن توزيع atlastin-أعرب شارك بشكل كبير بحيث أظهر بروتين قوي شارك في التعريب مع خيوط غير طبيعية (الشكل 4 N-Q). في الخلايا NSC34، وخيوط غير طبيعية امتدت إلى عمليات محوار، وكان ينظر قوي شارك في توطين هنا، وكذلك في سوما (لا تظهر البيانات). ورافق إعادة توزيع atlastin بواسطة إعادة توزيع calreticulin، والتي أيضا شارك المترجمة مع خيوط spastin متحولة (الشكل 4 P). واعتبرت إعادة توزيع مماثل للER عندما أعرب عن MYC-spastinK388R في خلايا هيلا في غياب atlastin الخارجية (الشكل 4 R-T).
وقد اقترحنا في وقت سابق ان بعض التعبير spastin قد يكون على الإندوسومات، على أساس البيانات التي تظهر التفاعل بين spastin وCHMP1B البروتين endosomal. وصفناها أيضا colocalization بين-MYC spastin وGFP الموسومة علامة endosomal RhoB (27). ومع ذلك، استخدمت تجاربنا السابقة شارك في توطين وRhoB بناء الموسومة GFP (Clontech) التي كانت غير لائقة، حيث أنه يشتمل على حاتمة ج. Myc على. وبالتالي فإننا إعادة التحقيق توطين endosomal من spastin أعرب عابر من خلال فحص خلايا هيلا التعاون مع transfected-MYC spastin وN-محطة-GFP الموسومة الثدييات VPS4-E235Q (هدية عينية من بول وايتلي) (37). البروتين GFP-VPS4-E235Q-أتباز خلل يتراكم على الإندوسومات تورم، التي تحتفظ مكونات المجمع ESCRT-III على الأغشية الحد منها (37). وجدنا كبير جزئي شارك في التعريب بين MYC-spastin وGFP-VPS4-E235Q، مما يشير بقوة إلى أن جزء من السكان من spastin موجود على الأغشية endosomal (الشكل 4 U-W). ولذلك يبدو من المرجح أن spastin يمكن أن تكون موجودة على اثنين على الأقل من سكان الغشاء، الإندوسومات وER.
من أجل الحصول على مزيد من المعلومات حول تكوين شعيرات المرتبطة أتباز معيب spastin، ونحن التحقيق على الصعيد التركيبية. نحن عابر شارك transfected خلايا هيلا مع MYC-spastinK388R وatlastin-GFP وفحص الخلايا تحت المجهر الالكتروني. وجدنا حزم من الأنابيب الدقيقة في سيتوبلازم خلايا transfected المشترك (الشكل 5 A). كان الأنابيب الدقيقة الفردية ضمن هذه الباقات مظهر غير طبيعي، وجود التصدعات الإلكترون الكثيفة.ورأينا أيضا هياكل حشوية مع مثل العسل مظهر غير طبيعي في هذه الخلايا (الشكل 5 B) وكانت هذه الهياكل المستمر في بعض الأحيان مع ER (الشكل 5 B) أو الغلاف النووي (الشكل 5 C). في بعض المقاطع، كانت الهياكل العسل متجاورة مع حزم أنيبيب غير طبيعية (الشكل 5 D).

الرقم 5. فإن التركيب الدقيق للخيوط المرتبطة أتباز معيب
spastin.> وعلى الصعيد المجهر الالكتروني، وخلايا transfected المشترك مع MYC-spastinK388R وكان atlastin-GFP حزم غير طبيعية من الأنابيب الدقيقة في السيتوبلازم (A). كانت الأنابيب الدقيقة إلكترون طلاء كثيفة غير عادية. وشوهدت أيضا هياكل العسل كثيفة، وفي بعض الأماكن، وكانت هذه المستمر مع ER (B، رأس السهم) أو مع الغشاء النووي (C، السهام). في بعض الحالات، كانت متجاورة مع حزم أنيبيب غير طبيعية (D، السهم). تظهر جميع لوحات خلايا هيلا التي تم إصلاحها 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. ويمثل حجم شريط 200 نانومتر. جميع الصور هي في نفس التكبير.

نقاش

في هذه الدراسة، كنا الخميرة نهج هجين اثنين لتحديد الشركاء المحتملين لالمتفاعل spastin، وهو بروتين تحور في جسمية مهيمنة النقي HSP. بشكل ملحوظ، حدد هذا النهج atlastin، بروتين آخر تحور في جسمية مهيمنة النقي HSP، كشريك ملزم spastin المحتملين. نحن التحقق من أهمية هذا التفاعل في خلايا الثدييات من قبل مجموعة متنوعة من الأساليب، والتي توفر معا أدلة دامغة على أن spastin وatlastin شركاء ملزم صحيح. هذا التفاعل هو اول دليل على وجود علاقة وظيفية مباشرة بين اثنين من البروتينات المشاركة في HSP. وجودها تشير بقوة إلى أن spastin وatlastin المشاركة في نفس مسار الكيمياء الحيوية وعلم الأمراض الجزيئي أن من spastin وatlastin HSP مرتبط.
ومن المسائل التي كانت دراستنا غير قادرة على معالجة قاطع الموقع التحت خلوية من التفاعل spastin atlastin. لدينا البيانات مع البروتينات الموسومة حاتمة تشير إلى أن تتفاعل على ER، كما وجدنا أن atlastin الموسومة حاتمة بقوة شارك المترجمة مع علامات ER (وإلى حد أقل مع جهاز جولجي)، أن-حاتمة الموسومة كامل طول spastin أظهر جزئي، ولكن واضح، وشارك في التعريب مع calreticulin ER علامة وأنه عندما شارك أعرب، الموسومة حاتمة كامل طول spastin وatlastin شارك المترجمة مع بعضها البعض ومع calreticulin. فمن الممكن أن مجموعة فرعية من spastin الذاتية قد يكون موجودا على لائحة أو الدراسات immunolocalization شبكة السابقة أنيبيب متجاورة لم فحص على وجه التحديد ما إذا كانت نسبة من التعبير حشوية من spastin قد تكون في أو قريبة جدا من ER. على الرغم من أن الدراسة immunolocalization السابقة وجدت بعض atlastin الذاتية على ER، الموقع الرئيسي للبروتين الذاتية على جهاز جولجي، وهو الموقع الذي كان أقل وضوحا مع الموسومة حاتمة atlastin (35). ويمكن أن تشمل تفسيرات لهذا التفاوت والمناعي عبر رد فعل من الأجسام المضادة atlastin مع بروتين آخر، فإن وجود ER وجولجي أشكال atlastin مع حساسية مختلفة / الحواتم المتاحة لالأجسام المضادة أو آثار العلامة حاتمة على توطين البروتين. ومع ذلك، كان التعريب أننا لاحظنا مستقلة عن موقع أو طبيعة العلامة حاتمة المستخدمة. التعبير عابر atlastin ربما كان لها تأثير على توزيعه، مع الإفراط في التعبير تشبع ER إلى جولجي مسارات النقل أو تؤثر على التوازن بين تقدمي ورجعية مسارات ER / جولجي، مما أدى إلى زيادة نسبية في ER تلطيخ بالمقارنة مع نمط الذاتية . وأخيرا، كان التوزيع المستمر للatlastin التي رأيناها في جميع أنحاء ER يست نموذجية للكتل مجمعة مميزة من الإفراط أعرب البروتينات التي تتجمع في ER. سوف تكون هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات مع spastin وatlastin الأجسام المضادة إضافية لإيجاد حل نهائي للموقع التحت خلوية من التفاعل spastin atlastin.
أم لا توطين atlastin الأصلي هو الغالب في ER، في جولجي، أو على حد سواء، وحقيقة أنه يتفاعل مع spastin يجعل من المرجح جدا أن spastin تنشط في موقع الغشاء أكثر من واحد. حددنا سابقا CHMP1B البروتين endosomal كشريك ملزم للspastin ونحن نبين هنا أن كامل طول spastin جزئيا شارك يموضع مع GFP-VPS4-E235Q، علامة endosomal (27). ولذلك صورة تظهر من spastin كما بروتين التنظيم أنيبيب التي يمكن تجنيده من قبل البروتينات محول مختلفة لعدة مواقع غشاء، حيث يمكن أن تلعب دورا في تنظيم المحليين من الأنابيب الدقيقة، وربما إلى جانب لحركة العضيات بغشاء (خاصة في المحاور) و / أو إعادة تشكيل بنية عضية، أو حتى يكون لها دور منفصل تماما لا علاقة لها وظيفتها قطع أنيبيب. العوامل التي تؤثر على توظيف spastin لموقع واحد مقابل أخرى غير معروفة حتى الآن، ولكن سوف يكون من المهم توضيح الخاصة بهم في زيادة فهم دور الفسيولوجية الدقيق للبروتين.
قد يكون Spastin أيضا وظائف أخرى لا علاقة لها تفاعلات الغشاء. وأشارت العديد من الدراسات باستخدام الأجسام المضادة لspastin الذاتية أنه في بعض أنواع الخلايا أو في بعض مراحل دورة الخلية، قد يكون spastin توطين النووي (14، 15، 17). هذا spastin النووية تتكون في الغالب من القصير الإسوي اقتطاع N-محطة وظيفتها غير معروفة حاليا (18). سيناريو أحد أفراد العائلة AAA وجود مواقع متعددة من العمل ليس غير مسبوق، مع العديد من الأمثلة الموثقة من البروتينات AAA الفردية ممارسة وظيفة محددة، وغالبا ما تنطوي على تنظيم البروتين الركيزة التشكل، في مواقع متعددة داخل الخلايا العمل (38، 39).
درسنا المجالات spastin التي تتوسط التفاعل مع atlastin، والمنطقة المسؤولة يقيمون داخل بقايا 80 الأولى من البروتين (الشكل 6). وهكذا، إلا أن الغالب حشوية، كامل طول الإسوي spastin يحتوي على المنطقة المسؤولة عن ملزم لatlastin، مما يشير إلى أنها هي وظيفة هذا الإسوي التي تكتسي أهمية مباشرة لإمراض HSP. ومن المثير للاهتمام، وأثرى كامل طول الإسوي في الدماغ والحبل الشوكي، والمواقع التشريحية للHSP علم الأمراض (18). المنطقة ملزم atlastin تتداخل المجال (بقايا 50-87) هي المسؤولة عن الربط إلى الأنابيب الدقيقة والبروتين NA14 centrosomal، ولكن تتميز عن المنطقة التي تتفاعل مع CHMP1B (بقايا 81-194) (17، 19، 27) . وهكذا، يبدو أن تنعكس المواقع والوظائف spastin المختلفة التي تمت مناقشتها في وقت سابق وجود مواقع للبروتينات محول مختلفة في المنطقة-N محطة لها صفة الإلزام.

الرقم 6. كارتون الرسم البياني للتفاعل بين spastin وatlastin. منطقة atlastin مسؤولة عن الربط لspastin تكمن N-محطة لأول TM. لspastin، المنطقة المسؤولة عن ملزم لatlastin يكمن داخل بقايا 80 الأولى من البروتين. هذا التداخل في المنطقة من البروتين (بقايا 50-87) هي المسؤولة عن الربط إلى الأنابيب الدقيقة، ولكن يختلف من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وAAA أتباز المجالات.

يعرض دراستنا أيضا مزيد من المعلومات حول تكوين شعيرات الخلايا نشاهد في التعبير عن المسوخ spastin أتباز معيبة. على الرغم من أنه من غير المرجح أن هذه الخيوط هي ذات الصلة لتلك الطفرات التي تسبب haplo spastin-قصور وأنه من الممكن أن أنها تمثل الإفراط في التعبير الحرفية، قد يكون تكوينها ذات الصلة HSP الناجمة عن الطفرات spastin أتباز مغلطة. على مستوى المجهر الضوئي، atlastin الموسومة حاتمة وcalreticulin ER علامة كان كلا إعادة توزيعها على حزم أنيبيب غير طبيعية. في المجهر الإلكتروني في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع MYC-spastinK388R وatlastin-GFP، لاحظنا المجمعة الأنابيب الدقيقة والهياكل العسل غير طبيعية، والتي كان ينظر إليها في بعض الأحيان بالاشتراك مع حزم أنيبيب. في بعض الحالات، كان من الواضح أن الهياكل العسل كانت مستمرة مع ER العادي ومع الغلاف النووي، مما يشير إلى أنها قد تمثل ER غير طبيعي. وليس من الواضح ما إذا كانت إعادة تنظيم ER الذي شهدناه هو نتيجة للربط المباشر بين spastin متحولة وatlastin أو ما إذا كان لها تأثير غير مباشر عن طريق إعادة تنظيم شبكة أنيبيب المرتبطة ER، على الرغم من أنه يبدو واضحا أن خيوط ترتبط ارتباطا وثيقا مع مكونات الغشاء.
وباختصار، حددنا اثنين من البروتينات HSP، spastin وatlastin، كشركاء ملزم. هذا يشير إلى أن التسبب في HSP الناجمة عن طفرة في هذه البروتينات اثنين يرتبط في الأساس، ويوفر أول دليل تجريبي HSP قد تكون ناجمة عن خلل في البروتينات التي هي أعضاء في نفس مسار الكيمياء الحيوية. وهناك فهم أكثر تفصيلا وظيفة هذا المسار تعطي ليس فقط الأفكار الرئيسية في أسباب التنكس العصبي في HSP والحالات العصبية وربما غيرها ولكن يجب أيضا توضيح الآليات الجزيئية التي تعتبر مهمة للالمسالك طويلة صيانة العصبية.

المواد والأساليب

بناء الخميرة اثنين الهجين، GST والمناعي ناقلات

شيدت الخميرة Spastin يومين الهجين والتعبير الثدييات بنيات كما هو موضح سابقا (27، 40). وتضخمت بنيات Atlastin كل قراءة دليل PFX البلمرة (إينفيتروجن) PCR من IMAGE استنساخ 3869877، وذلك باستخدام بوابة TM (إينفيتروجن) إعادة التركيب استنساخ الاشعال المتوافقة مع نظام مصمم من تسلسل [كدنا مرجعية لكل الجينات. ليبني [كدنا مبتورة، PFX أجريت PCR خارج باستخدام المناسبة عبارة (إينفيتروجن) إعادة التركيب استنساخ الاشعال المتوافقة مع نظام مصمم من داخل كدنا] إشارة. تم بناء ناقلات دخول بوابة نظام إعادة التركيب استنساخ pENTR201 و / أو pENTR207 تحتوي على cDNAs تضخيم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم التحقق من تسلسل الدخول يبني ناقلات بواسطة التسلسل على ABI377 أو 3700 المنظم، وذلك باستخدام BigDyeDT الكيمياء (النظم البيولوجية التطبيقية).
ثم تم subcloned النصوص atlastin إلى ناقلات بوابة المتوافقة مع pcDNA3-C-Myc على و / أو pEGFP-N، الذي تضمن 5'-MYC أو 3'-GFP الحواتم، على التوالي. تم التحقق من التوجه للتسلسل atlastin داخل بنيات بواسطة التسلسل المباشر على ABI377 أو 3700 المنظم.
لإنتاج بنيات كدنا] GST الانصهار، وتضخمت كامل طول كدنا] spastin وatlastinΔTM كدنا] بواسطة PCR باستخدام PFU توربو ® إنزيم البلمرة (Stratagene). وقد صممت هذه البادئات المستخدمة في رد فعل لإنتاج منتج PCR مع 5 'و 3' ينتهي متوافقة مع GST الجينات الانصهار ناقلات، pGEX-4T-3 (أمرشام العلوم البيولوجية). بعد التقييد مع غير الأول وسال I (نيو إنجلاند Biolabs)، كان ligated المنتج PCR في ناقلات التعبير باستخدام T4 DNA يغاز (نيو إنجلاند Biolabs). تم التحقق من تسلسل يبني في وقت سابق.

إنتاج البروتينات GST الانصهار

تحويل GST الانصهار بناء إلى أجري BL21 (DE3) خلايا pLysS وفقا لتعليمات الشركة المنتجة (إينفيتروجن). أجريت إنتاج sonicates البكتيرية على نطاق واسع، وبعد ذلك GST الانصهار تنقية البروتين وفقا لتعليمات نظام GST الجينات الانصهار في أمرشام العلوم البيولوجية ".

الخميرة يومين الهجينة فحص مكتبة، المقايسات مراسل وتحديد البروتينات التفاعل

وقد أجريت الخميرة فحص هجين اثنين مع الطعم استنساخ spastin خارج كما هو موضح سابقا، باستثناء أجريت الشاشة ضد دماغ الجنين مكتبة كدنا] صانع عيدان الثقاب (Clontech) (27). للتعرف على التفاعل البروتينات، تم إدراج فريسة تضخيم مباشرة من الخميرة باستخدام بادئات ناقلات محددة، كما هو موضح سابقا، وكان التسلسل 3-5 ميكرولتر من كل منتج PCR كما هو موضح سابقا (27).
كما تم البحث في تسلسل فريسة ضد الإصدارات التي تعقد محليا من الانسان العاقل Unigene وقواعد البيانات EMBLminus باستخدام BLAST الآلي (41) الخوارزمية. استخدمت بنيت خصيصا حدات بيرل والكتابات على prefilter وتنسيق الإخراج BLAST الخام وتحديد ما إذا كان تسلسل 5 'قراءة تتداخل مع منطقة تشفير البروتين من الجين. مباريات فقط لمناطق تشفير البروتين المعروف والتكنولوجيات السليمة بيئيا التي لم تدرج إطار القراءة المفتوح الذي يعرف بأنه ايجابيات. تم استبعاد مباريات ل3'-UTRs والحمض النووي الجيني مع عدم وجود التنبؤ الجينات المرتبطة بها. مفرد، استبعدت أيضا التكنولوجيات السليمة بيئيا unspliced ​​التي لم تتوافق مع أي توقعات الجينات.

إعادة تأكيد وخصوصية اختبار الخميرة المقايسات يومين الهجينة

لإعادة اختبار كل تفاعل في الخميرة الطازجة، تم استنساخ المنتج PCR فريسة باستخدام بوابة نظام إعادة التركيب الاستنساخ في بوابة متوافق pGAD-G ناقلات، كما هو موضح سابقا. المختصة MAT تحولت α خلايا الخميرة PJ69-4A وتزاوج كما هو موضح سابقا. تم تزاوج هم مع الطعم ذات الصلة، واثنين من الطعوم ذات صلة مختلفة أو الطعم متجه فارغة، ثم حضنت ل> 5 ساعات على لوحات YPAD. وقد تم اختيار Diploids على SD-أورا / لوي قبل الاختبار لتفعيل مراسل عن طريق تكرار على SD-أورا / لوي / آدي.

الأجسام المضادة

الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للMYC الأساسي (الماوس استنساخ 4A6) تم الحصول عليها من شمالي ولاية (نيويورك). تم الحصول على وحيدة النسيلة الأجسام المضادة لمكافحة أنيبيب (الفئران استنساخ YL1 / 2) ومكافحة GFP الأضداد الأرنب بولكلونل من Abcam (كامبردج). تم الحصول على الأرنب بولكلونل المضادة للcalreticulin الضد من Calbiochem (سان دييغو). تم الحصول على الأغنام بولكلونل المضادة للTGN46 من Serotec (أكسفورد)، وكان الأرنب بولكلونل مكافحة M6PR والماوس وحيدة النسيلة المضادة للLamp1 الأجسام المضادة المتوفرة في المنزل. تم الحصول على الماوس وحيدة النسيلة المضادة للEEA1 والماوس وحيدة النسيلة المضادة للGM130 من مختبرات تنبيغ دينار بحريني (أكسفورد). تم الحصول على الأجسام المضادة البيروكسيديز مترافق الثانوية للالنشاف الغربي من سيجما. تم الحصول على الأجسام المضادة الثانوية Alexafluor المسمى لالمناعي من المسابر الجزيئية (ولاية أوريغون). كان S51 أرنب المضادة للspastin الأجسام المضادة بولكلونل هدية كريمة من ايلينا Rugarli والأرنب مكافحة atlastin كان 5409 الضد هدية عينية من كريغ بلاكستون.

زراعة الخلايا، وترنسفكأيشن المناعي

وكانت المصنفة خلايا هيلا على العقيمة زلات غطاء زجاجي في لوحات ستة جيدا (~0.5 × 10 5 خلايا / جيد). بعد 24 ساعة، و transfected الخلايا مع ~400 نانوغرام من الحمض النووي ناقلات، وذلك باستخدام كاشف ترنسفكأيشن Effectene® (QIAGEN)، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. بعد ترنسفكأيشن، وحضنت الخلايا لمدة 24 أو 48 ساعة في المتوسط ​​RPMI-1640 (سيغما) تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) (سيغما)، و 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (سيغما) و 2 م مل -glutamine (سيغما). وقد حافظت خلايا NSC34 في تعديل متوسطة Dulbecco والنسر (لايف تكنولوجيز)، على أن تستكمل في نفس الطريق باعتبارها وسيلة RPMI-1640 تستخدم لخلايا هيلا. كانت المصنفة خلايا NSC34 في 1 × 10 5 إلى لوحات ستة جيدا تحتوي على زلات غطاء زجاجي المكسوة مسبقا والمحمولة مع بولي د -lysine (سيغما). ثم تم transfected أنها عابر مع Effectene ترنسفكأيشن الكاشف (QIAGEN)، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، لمدة 24-48 ساعة قبل التثبيت.
بعد ترنسفكأيشن، وكانت تغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني (سيغما) وثابت مع 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني، في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وجرفت المياه خلايا ثابتة في برنامج تلفزيوني قبل permeabilized في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 (سيغما) أو 0.05٪ سابونين (سيغما، وتستخدم مع M6PR وLamp1 الأجسام المضادة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقيقة. خلايا Permeabilized ثم تم غسلها ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني، المحتضنة لمدة 15 دقيقة في عرقلة الحل (PBS، و 10٪ FBS، ± 0.05٪ سابونين) ومن ثم نقلها إلى عرقلة الحل الذي يحتوي على الأجسام المضادة حاتمة محددة المناسب في التخفيف المناسبة. بعد 60 دقيقة الحضانة، وجرفت المياه زلات غطاء ثلاث مرات في عرقلة الحل ثم تم حضنت لمدة 60 دقيقة في عرقلة العازلة التي تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية المناسبة، بتركيز 1/300. تم زلات غطاء ثم يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني ومرة واحدة في H المقطر 2 O، وبعد ذلك تم تركيبه في Vectashield TM (ناقلات مختبرات شركة) المتوسطة على شريحة زجاجية. وقد تم تحليل عينات الملون على زايس 510 المجهر متحد البؤر ميتا. وسجلت الصور باستخدام LSM صورة محلل البرمجيات، وتمت معالجة البيانات في وقت لاحق باستخدام برامج أدوبي فوتوشوب والمصور.

المجهر الإلكتروني

وأجري تثبيت وتجهيز أقسام للفحص المجهري وفقا لأساليب موضح سابقا (42).

التجارب المشتركة مناعي

عن محاولة المشارك مناعي من spastin الذاتية وatlastin في ظل ظروف غير تغيير طبيعة، كانت مطلية خلايا NSC34 untransfected إلى ثلاث لوحات 15 سم في 1 × 10 7. بعد مرور أربع وعشرين ساعة، وجرفت المياه خلايا متكدسة في برنامج تلفزيوني و lysed في 1 مل الجليد الباردة NP-40 العازلة تحلل (انظر 27 وصفة). ثم إزالة قسامة 100 ميكرولتر لاستخدامها بوصفها جزء مدخلات المركزة. وقدم حجم NSC34 المحللة تصل إلى 10 مل، وكان هذا الانقسام إلى اثنين من الكسور. جزء 1 يمثل مجموع المحللة الخلية، في حين تم طرد جزء 2 في 000 13 غرام لمدة 5 دقائق وطاف إزالة لاستخدامها بوصفها جزء القابلة للذوبان. ثم تم تقسيم كل من الكسور الى مزيد من 2.5 مل عينات لإيجابية / تحكم المشترك immunoprecipitations. ثم أضاف مكافحة atlastin أو مصل بولكلونل المضادة للspastin ل+ كسور في 1/100، في حين تم ادراج مكافحة GFP (ab290 Abcam) الأجسام المضادة للسيطرة على الكسور. ثم تم تحضين الكسور على طاولة هزاز في 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. بعد حضانات الضد، تم إضافة 200 ميكرولتر من الطين 50٪ من البروتين-A حبات سيفاروز (سيغما) في NP-40 العازلة تحلل لجميع الكسور وحضنت بين عشية وضحاها على طاولة هزاز في 4 درجات مئوية. بعد حضانات البروتين الأجسام المضادة المعقدة، تم عزل بروتين-A حبات سيفاروز بواسطة الطرد المركزي وجيزة ثم تغسل خمس مرات لمدة 20 دقيقة في 10 مل NP-40 العازلة تحلل. ثم إزالة طاف غسل النهائي وكان معلق حبات في 2 × SDS-PAGE عينة العازلة. ثم تم إجراء SDS-PAGE وimmunoblotting نفذت مع أمصال مضادة المناسب.
لخلايا HEK293T عابر.، كانت مطلية الخلايا إلى قسمين 15 سم وحات في 1 × 10 7، وبعد 24 ساعة، خلايا وشارك transfected مع atlastin-GFP وMYC spastin أو pEGFP وMYC spastin. بعد أربع وعشرين ساعة ترنسفكأيشن، كانت هي lysed الخلايا في 1 مل الجليد الباردة العازلة تحلل، وقسامة 100 ميكرولتر إزالة لاستخدامها بوصفها جزء مدخلات المركزة. ثم تم معالجة الخلايا كما هو موضح لخلايا NSC34. تمت إضافة الجسم المضاد بولكلونل مكافحة GFP (Abcam ab290) ل+ الكسور الأجسام المضادة في 1/1000، و+/- ثم تم تحضين الكسور الأضداد على طاولة هزاز في 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. وأجري مزيد من المعالجة بها في وقت سابق.
تم استخدام البروتوكول المعدل ل-immunoprecipitations شارك نفذت في ظل ظروف تغيير طبيعة. وقد أجريت هذه التجارب في الخلايا NSC34 باستخدام ظروف تغيير طبيعة في وجود الكيميائي عبر رابط DSP (بيرس). تم حصاد الخلايا NSC34 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 م م DSP وحضنت لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. 1 م تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH7.5، وأضيف إلى تركيز النهائي من 10 م م لإرواء النشاط DSP وحضنت الخلايا لمدة 15 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة. ومعلق الخلايا في 100 ميكرولتر لكل 1 × 10 7 خلايا تغيير طبيعة العازلة تحلل تحتوي على 1٪ SDS، 50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 5 م م EDTA، الدناز الأول (سيغما) ومثبطات الأنزيم البروتيني (روش). ثم تم تخفيفه المحللة التشويه والتحريف إلى غير تغيير طبيعة العازلة تحلل تحتوي على 1٪ تريتون X-100، 50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 300 م م كلوريد الصوديوم، 0.5 م م EDTA ومثبطات الأنزيم البروتيني إلى تركيز النهائي من 0.1٪ SDS. تم تطهير الكلي المحللة الخلية بواسطة الطرد المركزي في 000 دورة في الدقيقة 13 لمدة 10 دقيقة والإبقاء على جزء قابل للذوبان. تم precoupled الخرز البروتين-A سيفاروز إلى 20 ميكروغرام من مكافحة atlastin (5409) الأجسام المضادة بولكلونل وإلى عنصر تحكم الضد زائف (مكافحة GFP Abcam 6556)، في وجود DSP. وتطفأ النشاط DSP مع 10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، في وقت سابق. ثم تم المضافة إلى جانب الأجسام المضادة الخرز البروتين-A سيفاروز إلى الخلية لست] القابلة للذوبان. سمح مجمعات للمستضد لتشكيل عند 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. وكانت حبات ثم معزولة وغسلها عدة مرات في حالة عدم تغيير طبيعة العازلة تحلل. تم المشقوق DSP عبر ربط بإضافة SDS-PAGE عينة العازلة التي تحتوي على 5٪ β المركابتويثانول عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والبروتينات تم حلها بواسطة SDS-PAGE.

البروتين GST الانصهار التجارب المنسدلة

تم غسلها الخرز الجلوتاثيون-سيفاروز (أمرشام العلوم البيولوجية) في منطقة عازلة المنسدلة التي تتألف من 1٪ NP-40 و PBS حل مع مثبطات الأنزيم البروتيني (أقراص كوكتيل الكامل البسيطة مثبط البروتياز، روش التشخيص) وتتكون لالطين 50٪ في هذا المخزن المؤقت. و transfected خلايا هيلا عابر مع بنيات ناقلات التعبير عن الموسومة حاتمة spastin أو atlastin، وذلك باستخدام مجموعة Effectene ترنسفكأيشن (QIAGEN)، كما هو موضح سابقا. تم حصاد الخلايا 24-48 ساعة بعد ترنسفكأيشن في غسل العازلة وتجميد / إذابة إلى -20 ° C.
تألف رد فعل المنسدلة 50 ميكرولتر من 50٪ الخرز الجلوتاثيون-سيفاروز، 500 العصارة الخلوية الخلية ميكروغرام و 100 ميكروغرام البروتين GST الانصهار. وجاء إجمالي حجم ما يصل الى 0.5 مل في أنبوب 1.5 مل مع العازلة المنسدلة (1٪ NP-40، PBS، 5 م م MgCl 2 و 5 م م ATP). سيطرة سلبية GST استخدمت مبلغ-متساو المولي من البروتين GST. وحضنت الأنابيب عند 4 درجات مئوية على الدورية بين عشية وضحاها عجلة القيادة. وقد نسج الخرز في 13 000 لمدة 15 ق في أعلى الطرد المركزي مقاعد البدلاء ثم تغسل مع 1 مل من العازلة. وتكررت هذه الدورة أربع مرات. قبل غسل الرابع، تم نقل مزيج المنسدلة لتنظيف أنابيب 1.5 مل للقضاء على أي ممكن ملزمة من البروتين إلى داخل أنبوب من البلاستيك. ومزال بروتين منضمة إلى حبات بعد أربعة دورات الغسيل / تدور مع 55 ميكرولتر من SDS عينة العازلة (188 م م تريس، 6٪ SDS، 30٪ الجلسرين، 0.03٪ برموفينول الأزرق، و 10٪ β المركابتويثانول، ودرجة الحموضة 6.8). تم تسخين العينات إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم نسج على 000 13 سرعة في أعلى الطرد المركزي مقاعد البدلاء لمدة 15 ثانية. تم تحميل supernatants على 10٪ SDS-بولكرلميد هلام وimmunoblotted مع مكافحة MYC أو مكافحة GFP الأجسام المضادة الأولية حسب الاقتضاء.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس