[رافت ابراهيم]

 

http://www.hindawi.com/journals/np/2015/985083/

سيمون Hagmeyer، 1 كاتارينا Mangus (1)، توبياس M. Boeckers و 2 و أندرياس M. Grabrucker1،2

تحليل 1WG الجزيئية من Synaptopathies، قسم علم الأعصاب، Neurocenter من جامعة أولم، 89081 أولم، ألمانيا
2Institute عن التشريح وبيولوجيا الخلية، جامعة أولم، 89081 أولم، ألمانيا

تلقت 9 ديسمبر 2014؛ المنقحة 19 يناير 2015؛ قبلت 19 يناير 2015



وكشفت دراسات مختلفة حديثة أن dyshomeostasis biometal يلعب دورا حاسما في التسبب في اضطرابات عصبية مثل اضطرابات طيف التوحد (ASD). أدلة قوية تشير إلى أن تعطل التوازن العصبية من ايونات المعادن المختلفة مثل الحديد والنحاس والرصاص والزئبق وسي، والزنك قد توسط الخلل متشابك ويضعف تشكيل المشبك والنضج. هنا، أجرينا الدراسات في المختبر التحقيق في الآثار المترتبة على وجود خلل في الفلزات الانتقالية على نقاط الاشتباك العصبي glutamatergic من الخلايا العصبية قرن آمون. قمنا بتحليل ما إذا كان الخلل في أي أيون الفلز واحد يغير أرقام صحة الخلية والمشبك. وعلاوة على ذلك، قمنا بتقييم ما إذا كانت سمة الشخصي biometal للمرضى ASD تؤثر تشكيل المشبك، والنضج، وتكوين بشأن NMDA مفارز مستقبلات والبروتينات شانك. نتائجنا تظهر أن ASD مثل الملف الشخصي biometal يؤدي إلى الحد من NMDAR (NR / ابتسامة / GluN) فرعية (1) و2A، وكذلك شانك التعبير الجيني جنبا إلى جنب مع الحد من كثافة المشبك. بالإضافة إلى ذلك، يتم تخفيض مستويات بروتين متشابك من GluN2a والسيقان. على الرغم من أن الزنك هو قادرة على انقاذ التعديلات المشار إليها أعلاه، ونقص الزنك ليست مسؤولة فقط كعامل المسببة. وبالتالي، فإننا نستنتج أن تحقيق التوازن بين مستويات الزنك في ASD قد يكون هدفا رئيسيا لتطبيع التعديلات متشابك الناجمة عن dyshomeostasis biometal.
1 المقدمة

اضطرابات طيف التوحد (ASD) هي مجموعة من الاضطرابات العصبية يعتبر حاليا في إظهار من خلل متشابك أو synaptopathy [1]. ولا سيما تشكيل المشبك و / أو متشابك نقل الإشارة واللدونة قد تتأثر على أساس الجينات المرشحة التي تم تحديدها من الدراسات الجينية على نطاق واسع. ومع ذلك، على الأرجح، تسهم العوامل البيئية إلى مسببات ASD [2].

تم الإبلاغ عن وجود ارتباط قوي بين الخلل في توازن المعادن النزرة وASD في العديد من الدراسات [3]. النتائج الأخيرة تشير إلى أن ملامح metallomic من المرضى ASD تظهر العديد من التعديلات. على سبيل المثال، لوحظت أوجه القصور لالزنك، الكالسيوم، الحديد، المغنيسيوم، المنغنيز، والسيلينيوم، وكذلك زيادة تركيزات للشركة، كما والكادميوم والزئبق، والرصاص في عينات شعر من المرضى الذين يعانون من التوحد [4، 5] وعبء وأظهرت معادن سامة في المرضى الذين يعانون علاقة مع شدة التوحد النمط الظاهري [6]. هذا السيناريو المعقد دفعتنا للتحقيق التفاعل وآثار dyshomeostasis من ايونات المعادن المختلفة والتغيرات المرضية الناتجة من نقاط الاشتباك العصبي.

في الماضي، وقد أجريت العديد من الدراسات للتحقيق في ضرورتها وسمية المعادن النزرة، وذلك باستخدام الخلايا في الثقافة [7-12]. وقد حددت هذه الدراسة مختلف المعادن النزرة تعتبر في الوقت الحاضر أمرا ضروريا (biometals)، محايدة أو السامة للالفقاريات. بطبيعة الحال، كما biometals يمكن أن تكون ضارة في تركيزات عالية. وهكذا، ويستند الفرق بين العناصر السامة والأساسية على نافذة ضيقة من تركيزات، حيث ينظر إلى الوظيفة الفسيولوجية للbiometals [13]. ومع ذلك، المعادن النزرة لا تعمل كيانات منفصلة التأثير على آليات أو pathomechanisms في الخلايا ولكن توجد في حالة توازن دقيق مدبرة [3]. لدراسة هذا التوازن الذي لا يشمل فقط biometals ولكن أيضا أيونات المعادن السامة يتعرض الكائن الحي ل، على المستوى الخلوي في المختبر، ولقد نفذت تجارب على ايونات المعادن مثل الألمنيوم (آل)، الكادميوم (الكادميوم) والنحاس (النحاس) والحديد (الحديد) والزئبق (زئبق)، الماغنسيوم، الرصاص (الرصاص) والسيلينيوم (سي)، والزنك (الزنك)، وذلك باستخدام الخلايا العصبية الحصين الابتدائية.

لاختبار آثار المصب من خلل في أي أيون الفلز واحد، والتي قد تؤدي إلى تأثير الدومينو وتنتج تغييرات في جميع ايونات المعادن الأخرى، ويصف التقرير آثار ايونات المعادن الثقيلة والتفاعل بين الكادميوم والنحاس والزئبق والرصاص ، سي، و آل مع الزنك في الخلايا المستزرعة. أولا، قمنا بتحليل تأثير الزائد معدنيه المعادن النزرة واحد على مختلف المعلمات متشابك عن طريق العلاج المزمن للفئران الابتدائي الثقافات العصبية مع كلوريدات. المقبل، ونحن مصممون تأثير الزائد معدن الكادميوم والنحاس والزئبق، والرصاص في تركيبة لأن هذه المعادن كثيرا ما وصفت مرتفعة في المرضى ASD. قمنا بتحليل أيضا عما إذا كان عدم وجود الزنك والحديد، وهي سمة مشتركة في المرضى الذين يعانون من التوحد، يعدل تأثير ارتفاع الكادميوم والنحاس والزئبق، ومستويات الرصاص. وأخيرا، فإننا التحقيق ما إذا كانت مكملات الزنك قادر على التغلب على العيوب متشابك الناجمة عن المعادن النزرة الشخصي مميزة للمرضى ASD.

2. المواد والطرق
2.1. المواد

تم شراؤها ZnCl2، CuCl2، CdCl2، FeCl2، SeCl4، AlCl3، MgCl2، HgCl2، وPbCl2 من سيغما الدريخ. تم شراؤها Zinpyr-1 من سيغما الدريخ. تم شراؤها الأجسام المضادة الأولية من سيغما الدريتش (MAP2، GluN1، وShank1 لWB)، متشابك الأنظمة (الباسون، Homer1b / ج، Shank3)، ميرك ميليبور (GluN2a وGluN2b)، ونوفوس البيولوجية (Shank1 لIF). وقد وصفت الأجسام المضادة Shank2 سابقا [14]. تم شراؤها الأجسام المضادة الثانوية اليكسا من تقنيات الحياة. ما لم يذكر خلاف ذلك، تم الحصول على جميع المواد الكيميائية الأخرى من سيغما الدريخ.
2.2. الحصين الثقافة من الدماغ الفئران

تم إجراء إعداد الثقافات قرن آمون في الأساس كما هو موضح من قبل [15] من الفئران (يوم الجنينية 18، ​​E18). بعد إعداد وكانت المصنفة الخلايا العصبية الحصين على بولي ل يسين (0.1 ملغ / مل؛ سيغما الدريتش) coverslips الزجاج في لوحة 24-جيدا في كثافة 3 × 104 خلية / جيدا أو 10 سم طبق بتري في كثافة 2.5-3 × 106 خلية / طبق. وقد نمت الخلايا في Neurobasal (NB) متوسطة (لايف تكنولوجيز)، تستكمل مع ملحق B27 (لايف تكنولوجيز)، و 0.5 مم L-الجلوتامين (لايف تكنولوجيز)، و 100 U / مل البنسلين / الستربتومايسين (لايف تكنولوجيز) وحافظت على 37 درجة C في 5٪ CO2. يشار Neurobasal المتوسطة مع كل من يكمل ثلاث باسم NB +++. أجريت جميع التجارب على الحيوانات في الامتثال للمبادئ التوجيهية من أجل رفاهية حيوانات التجارب التي تصدرها الحكومة الاتحادية في ألمانيا وقبل لجنة الأخلاق المحلية (جامعة أولم)، رقم: 0.103.
2.3. مناعية

لالمناعي، كانت ثابتة الثقافات الأولية مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) /1.5٪ السكروز / PBS في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ومعالجتها لالمناعية. بعد غسل 2X 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني 1X مع 0.2٪ تريتون X-100 في RT، تم تنفيذ حظر مع 10٪ FBS / برنامج تلفزيوني 1X لمدة 1 ساعة على RT، تليها الأجسام المضادة الأولية في RT لمدة 2 ساعة. بعد 3X 5 دقائق غسل خطوة مع برنامج تلفزيوني 1X، الحضانة مع الضد الثاني إلى جانب Alexa488، تليها Alexa568، أو Alexa647 لمدة 1 ساعة على RT. تم غسلها الخلايا مرة أخرى في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة و counterstained مع دابي وغسلها لمدة 5 دقائق مع أكوا bidest والتي شنت مع Vecta جبل.
2.4. علاج الخلايا الحصين

تم علاج الخلايا لمدة 4 أيام مع ZnCl2 (10-200 ميكرون)، CuCl2 (10-200 ميكرون)، CdCl2 (1-10 ميكرون)، AlCl3 (10-500 ميكرون)، HgCl2 (1-10 ميكرون)، MgCl2 (10 -200 ميكرون)، PbCl2 (10-500 ميكرون)، SeCl4 (1-10 ميكرون) وFeCl2 (10-400 ميكرون)، أو ZnCl2 (50 ميكرومتر) وCuCl2 (120 ميكرومتر) مجموعات، ZnCl2 (50 ميكرومتر) وCdCl2 (5 ميكرومتر) مجموعات، ZnCl2 (50 ميكرومتر) وHgCl2 (5 ميكرومتر) مجموعات، ZnCl2 (50 ميكرومتر) وPbCl2 (5 ميكرومتر) مجموعات، أو ZnCl2 (50 ميكرومتر) وSeCl4 (6 ميكرومتر) مجموعات.

ولدت المعدنية نقص المتوسطة Neurobasal (لايف تكنولوجيز) باستخدام Chelex 100 الراتنج، 200-400 الجافة حجم فتحات الشباك، شكل الصوديوم (BioRad). وقد استخدم Chelex 100 الراتنج وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (طريقة دفعة) والرقم الهيدروجيني للمتوسطة إعادة ضبطها باستخدام حمض الهيدروكلوريك. بالإضافة إلى ذلك، في بعض الظروف، تم إعادة تأسيس تركيزات المعادن الأصلية لبعض أو كل المعادن بالكلاب وفقا لNeurobasal المتوسطة (1X) صياغة وسائل الإعلام السائلة باستخدام CaCl2، الحديد (NO3) 3 * 9H2O، MgCl2، وZnSO4 * 7H2O. وتمت السيطرة على فعالية عملية إزالة معدن ثقيل من المعادن ثنائي التكافؤ التي كتبها إضافة بالحث البلازما الطيفي (ICP-MS) (الجدول 1).
الجدول 1: استنفاد الأيونات ثنائية التكافؤ المعدنية بنسبة 100 Chelex تنقية وسائط النمو. Chelex الراتنج مخلبية التبادل الأيوني لديه تفضيل عالية على النحاس، والحديد، والزنك، وغيرها من المعادن الثقيلة ثنائي التكافؤ على الكاتيونات الأحادية التكافؤ مثل الصوديوم والبوتاسيوم مع الانتقائية للثنائي التكافؤ على الأيونات أحادية التكافؤ من حوالي 5000 إلى 1. للسيطرة على فعالية أيون عملية إزالة معدن ثقيل، وقد تم قياس تركيز الزنك من Neurobasal المتوسطة التي كتبها ICP-MS، قبل وبعد تطبيق Chelex. بالإضافة إلى ذلك، تم تدعيم وسط النمو مع 50 ميكرومتر ZnCl2 وتعرض بعد ذلك إلى استنزاف المعادن. في كلتا الحالتين، انخفضت مستويات الزنك أقل من الحد الكشف بعد تنقية وسائل الإعلام عن طريق العلاج Chelex.
2.5. قياس تركيزات المعادن النزرة

وقد تم قياس تركيز المعادن النزرة من وسائط النمو التي كتبها ICP-MS في "Spurenanalytisches ابوراتوريوم الدكتور باومان" (Maxhütte-Haidhof، ألمانيا).

لالفلورسنت الزنك، تلطيخ الخلايا العصبية مثقف، تم تجاهل النمو المتوسطة وتم غسلها الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. حضنت Coverslips بمحلول مكون من 5 ميكرومتر Zinpyr1 في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة عند RT.
2.6. الكيمياء الحيوية البروتين
2.6.1. تجزئة البروتين

للحصول الكسور P2 من الثقافات الحصين، تم حصاد DIV 14 الخلايا المعرضة لمركبات مختلفة من الفائدة للمرة المشار إليها والمتجانس في المخزن التجانس (320 ملي السكروز، 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4) التي تحتوي على خليط مثبط البروتياز (روش). تم إزالة الحطام الخلية ونوى بواسطة الطرد المركزي عند 3200 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة مما أدى إلى S1 طاف (جزء قابل للذوبان) وبيليه P1 (غشاء المرتبطة جزء). تم طرد Supernatants (S1) لمدة 20 دقيقة في 11200 دورة في الدقيقة، مما أدى إلى S2 (جزء قابل للذوبان) وP2 (synaptosomal جزء الخام). كان معلق الناتجة بيليه P2 العازلة في تجانس لأداء برادفورد وتحليلها بواسطة النشاف الغربي.
2.6.2. التنشيف الغربي

تم فصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE ونشف على الأغشية النيتروسليلوز. وتصور مناعية باستخدام الأجسام المضادة الثانوية HRP مترافق ونظام الكشف عن SuperSignal (بيرس، المرتفعات، والولايات المتحدة الأمريكية).
2.7. QRT PCR

أجريت التوليف حبلا الأول والكمي في الوقت الحقيقي-PCR التضخيم في خطوة واحدة، شكل أنبوب واحد باستخدام مجموعة QuantiFastTM SYBR_Green RT-PCR من QIAGEN وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة في إجمالي حجم 20 ميكرولتر وجين معين QuantiTect التمهيدي المقايسات (QIAGEN). أجريت الدراجات الحرارية والكشف الفلوري باستخدام الدوار الجينات Q الوقت الحقيقي PCR آلة (نموذج 2-بلكس HRM) (QIAGEN). تم قياس SYBR الأخضر I إشارة مراسل الصبغة. وقد تم تحليل البيانات الناتجة باستخدام الجينات HMBS كمعيار داخلي لتطبيع مستويات النص. تم تشغيل كل الوقت الحقيقي تفاعلات PCR الكمي في يثلث التقنية.
2.8. إحصائية
2.8.1. قياس المشبك

تم تنفيذ الاستحواذ وتقييم جميع الصور في ظل ظروف "أعمى". للتجارب زراعة الخلايا تم تصوير 10 خلايا لكل حالة. وقد تم الحصول على الصور مضان باستخدام المجهر تستقيم Axioscope مزودة بكاميرا زايس CCD (16 بت، 1280 × 1024 نقطة في البوصة) باستخدام Axiovision برنامج (زايس) ويماغيج 1.49i. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام Microsoft Excel لماكنتوش واختبار لأهمية استخدام اختبارات (تم توزيع جميع القيم عادة).
2.8.2. البقعة الغربية الكمي

تم إجراء تقييم العصابات من البقع الغربية (هيكل تجزئة العمل) باستخدام يماغيج. أجريت ثلاث تجارب مستقلة وتصوير البقع باستخدام نظام التصوير MicroChemi من Biostep. وقد تم اختيار الفرق الفردية وتم قياس كثافة متكاملة. وتم تطبيع جميع نطاقات البنك الدولي لبيتا-III-تويولين أو بيتا الأكتين وبلغ متوسط ​​نسب واختبارها لأهمية مع مستوى الدلالة التي حددت في 0.05 (<0.05 *؛ <0.01 **؛ <0.001 ***).
2.8.3. QRT PCR الكمي

ويستند تقدير نسبي على الجينات المرجعية الداخلية لتحديد مستويات مرنا افتراضية من الجينات المستهدفة. حسبت دورة عتبة (CT) القيم من قبل الدوار الجينات Q البرمجيات (نسخة 2.0.2). تم تحويل القيم ط م إلى مستويات مرنا الظاهري وفقا للمعادلة: مستوى مرنا الظاهري = 10 * (/ المنحدر من منحنى قياسي).
3. النتائج

في دراستنا السابقة [3]، وذكرت لنا ملامح biometal مميزة في الاضطرابات العصبية. في ASD، ومن المعروف أن العديد من المعادن النزرة أن يكون قد استنفذ أو أن تحدث في الزائدة (الجدول 2). لذلك، لفهم عواقب كل هذه التعديلات في المعادن النزرة لنقاط الاشتباك العصبي، في أول مجموعة من التجارب، ونحن تهدف إلى تحليل لأول مرة تأثير كل المعادن النزرة على صحة أرقام الخلية والمشبك بشكل منفصل (أرقام S1A وباء في التكميلية المواد المتاحة الانترنت في http://dx.doi.org/10.1155/2015/985083 والشكل 1). تحقيقا لهذه الغاية، كنا نعامل ومزارع الخلايا العصبية قرن آمون بين DIV 10 و 14 DIV مع تركيزات مختلفة من المعادن النزرة القاعدة، الكادميوم، النحاس، الحديد والزئبق، والمغنيسيوم، والرصاص، سي، والزنك. كما هو متوقع، تم العثور على علاقة خطية بين مستويات المعادن وكمية من موت الخلايا، وخاصة بالنسبة الكادميوم، والنحاس، والزنك (الشكلان 1 (أ) و 1 (ب)). ومع ذلك، ليست كل المعادن عرض هذا الارتباط. لم نتمكن من الكشف عن موت الخلايا كبيرا على طيف واسع من تركيزات للشركة، الحديد، والرصاص. بالإضافة إلى ذلك، لالزئبق والسيلينيوم، وقد لوحظ زيادة هائلة في موت الخلايا وراء تركيز معين. تعرض الخلايا لزيادة المغنيسيوم بقاء الخلية في نطاق تركيز منخفض ومع تركيزات أعلى مما يؤدي إلى موت الخلايا (الشكلان 1 (أ) و 1 (ب)). وقد استخدم العلاج مع مانيتول لاستبعاد تأثير الضغط الاسموزي على صحة الخلية (الشكل S1C). وبناء على العلاقة بين صحة الخلية وتركيز المعادن النزرة معين التطبيقية، حسبت تركيزات LD50 لكل معدن (الشكل S1D). وكانت الخلايا الدبقية التي كانت موجودة إلى أدنى حد في الثقافات العصبية أكثر مقاومة للتغيرات في تركيزات المعادن النزرة ولم تظهر أي علامات على موت الخلايا في نطاق تركيز السامة للخلايا العصبية ينظر (الشكل S1E).
الجدول 2: البيانات الشخصية Biometal ينظر في كثير من المرضى ASD [3] المستمدة من قياسات عينات الشعر والدم.
الشكل 1: لمحات سمية العناصر النزرة في زراعة الخلايا العصبية الحصين الابتدائية. ((أ) و (ب)) ويحسب مبلغ موت الخلايا باستخدام تركيزات مختلفة لكل المعادن النزرة من خلال تقييم عدد من نوى أفكارك العصبية (التي حددتها MAP2 وتلطيخ دابي) في حقل الضوئية (من 5 حقول النظر والثقافات ) تطبيع مقابل العدد الإجمالي للخلايا العصبية في المجال البصري. تظهر النتائج أي تغييرات في صحة الخلايا تغطي نطاقا واسعا من تركيزات للشركة، الحديد، والرصاص، وجود علاقة خطية بين مستوى المعادن وموت الخلايا لالكادميوم، والنحاس، والزنك. قد توجد هناك علاقة خطية أيضا عن الزئبق والسيلينيوم على الرغم من زيادة هائلة في موت الخلايا وراء تركيز معين هو أكثر احتمالا. إضافة المغنيسيوم زادت بقاء الخلية في نطاق تركيز منخفض ومع تركيزات أعلى مما يؤدي إلى موت الخلية (أ). (ب) عن طريق -tests، حسبت القيم لتقييم، ما إذا كانت التغييرات بين تركيزات مختلفة مقارنة مع الخلايا السيطرة غير المعالجة هي كبيرة. (ج) كبديل للقراءة بها، والتحقيق في عدد من التشعبات الابتدائي والثانوي، والتعليم العالي. كانت ملطخة الخلايا مع MAP2 الأجسام المضادة. كما علامات موت الخلايا، تظهر الخلايا العصبية تجزئة (معسر إيقاف) التشعبات، بدءا من الفروع البعيدة أكثر من سوما. ولم يحتسب التشعبات التي تظهر عليها علامات التجزئة. تركيزات عالية من المعادن التي عرضت أن تؤدي إلى موت الخلايا ((أ) و (ب)) تؤدي إلى انخفاض في شجيري المتفرعة بدءا من التشعبات التعليم العالي والتي تؤثر الثانوية والابتدائية في الحالات الأكثر سمية أيضا. وعلى الرغم من بعض المعادن، واعتبر أي موت الخلايا كبيرا في تركيز معين، وبالفعل تفتيت التشعبات مرئيا (على سبيل المثال، 5 ميكرومتر زئبق). مغ والزنك تظهر زيادة كبيرة في شجيري المتفرعة يقتصر على التشعبات العالي في مجموعة تركيز أقل. (د) لتقييم ما إذا كانت بعض العناصر النزرة عرض تأثير synaptogenic، وصفت نقاط الاشتباك العصبي باستخدام الباسون مضان وعدد الباسون نقاط وإيجابية تم قياس في 10 ميكرون طول التغصنات على التشعبات الأولية (3 التشعبات في الخلايا، 10 الخلايا في المجموع في المعادن و التركيز). بينما عدد المشبك وانخفضت ربط مع التأثيرات السامة لمعظم ايونات المعادن، مثل الكادميوم، والنحاس، والسيلينيوم، وزيادة في عدد المشبك يمكن أن ينظر إليه على الحديد وتركيزات أقل من المغنيسيوم والزنك (ينظر اليه على انه الاتجاه). ((أ) - (د)) تم علاج جميع الخلايا مع المعادن بين DIV 10 و 14 DIV قبل التحليل.


وعلاوة على ذلك، تم التحقيق في عدد من التشعبات الابتدائي والثانوي، والتعليم العالي من الخلايا العصبية بعد العلاج. وبالنظر إلى أن الخلايا العصبية تظهر تفتيت التشعبات، بدءا من الفروع البعيدة أكثر من سوما كما أول علامة على صحة الخلايا المتضررة، انخفاضا في المتفرعة شجيري قد تكشف الخلايا التي لم تظهر نوى أفكارك حتى الآن تعاني بالفعل من التعرض للالمعادن النزرة. وعلى غرار النتائج المبينة أعلاه، أدت تركيزات عالية من المعادن التي عرضت أن تؤدي إلى موت الخلايا في الحد من شجيري المتفرعة بدءا من التشعبات التعليم العالي والتي تؤثر الثانوية والابتدائية في الحالات الأكثر سمية (الشكل 1 (ج)) أيضا. في الواقع، على الرغم من بعض المعادن، واعتبر أي موت الخلايا كبيرا في بعض تجمعات، إذا كنت تفتيت التشعبات مرئيا. ومن المثير للاهتمام، مكملات المغنيسيوم والزنك في تركيز منخفض يؤدي إلى زيادة كبيرة في شجيري المتفرعة يقتصر على التشعبات العالي (الشكل 1 (ج)).

فقدان نقاط الاشتباك العصبي هو عامل المصاحب من التنكس العصبي. لذلك، من المتوقع أن ترتبط الآثار السامة من المعادن النزرة وموت الخلايا مما يؤدي إلى انخفاض في عدد المشبك. والواقع أن القياس الكمي للكثافة المشبك في الخلايا العصبية المعالجة ومقارنة مع الخلايا السيطرة غير المعالجة يبين وجود علاقة من التأثيرات السامة وفقدان المشبك لايونات المعادن، مثل الكادميوم، والنحاس، والسيلينيوم (الشكل 1 (د)، الشكل S1F). ومع ذلك، يمكن أن ينظر إلى زيادة في عدد المشبك عن الحديد وتركيزات أقل من المغنيسيوم والزنك (الشكل 1 (د)، الشكل S1F).

منذ ذلك الحين، لبعض ايونات المعادن، يمكن أن نحدد لها تأثير على نقاط الاشتباك العصبي مستقلة ذات سمية الخلوية المحتملة (الشكل 2)، ودور هذه المعادن في تشكيل المشبك و / أو الاستقرار يحتمل. على سبيل المثال، يظهر المغنيسيوم إلا علاقة ضعيفة بسبب آثار سامة على الخلايا العصبية على نطاق وتركيز واسع. بالإضافة إلى ذلك، مكملات كل من الزنك والسيلينيوم، في تركيزات منخفضة زادت كثافة المشبك، والتي يمكن بعد ذلك وجدت زيادة مقارنة بالشاهد على الرغم من موت الخلايا مستمر.
الشكل 2: تأثير المعادن النزرة على تشكيل المشبك أو الاستقرار. في حين أن الانخفاض الملاحظ في عدد المشبك يمكن ربط مع موت الخلايا العام من الخلايا العصبية في ثقافة الكادميوم، والنحاس، والزئبق (اللوحة اليسرى)، تم العثور على أي علاقة للشركة، الحديد، والرصاص الذي لم يغير كثيرا الصحية الخلية. يظهر ملغ فقط وجود علاقة ضعيفة بسبب آثار سامة على الخلايا العصبية على نطاق وتركيز واسع. كل من الزنك والسيلينيوم قد يعرض حتى زيادة أعداد المشبك على الرغم من موت الخلايا مستمر.

واستنادا إلى النتائج المذكورة أعلاه، فإنه قد يكون من الممكن أن عدم وجود تأثير synaptogenic بعض المعادن مثل الزنك والآثار السامة للآخرين التصرف في تركيبة في ASD عندما تحدث أوجه القصور والزائد من بعض المعادن النزرة في نفس الوقت. لذلك، أنشأنا لمحة biometal تشبه التعديلات المعادن النزرة المفترضة في المرضى ASD وتقييم الآثار على صحة الخلايا وخاصة على نقاط الاشتباك العصبي.

وقد نمت الخلايا العصبية قرن آمون من DIV 10 إلى DIV 14 في وسائل الإعلام ثقافة الخلية التي تحتوي على مجموعات مختلفة من المعادن النزرة: خلايا التحكم (السيطرة) كانت تزرع في المعادن النزرة المنضب Neurobasal المتوسطة التي تم تشكيلها لجميع المعادن النزرة المنضب (الماغنسيوم، الكالسيوم، الحديد، و الزنك) وفقا لتركيزات المعادن المشار إليها الشركة المصنعة. في أي من قراءات، يمكن أن نلاحظ الفروق بين الأصلي وأعيد Neurobasal المتوسطة (الشكل S2). بالإضافة إلى ذلك، كانت تزرع الخلايا في Neurobasal المتوسطة مع إضافة المعادن السامة المفترضة (0.5 ميكرومتر الكادميوم والنحاس والزئبق، و2 ميكرومتر الرصاص) وجدت أن زيادة في المرضى الذين ASD (ASD1). وقد نمت الخلايا السيطرة لهذا الشرط في Neurobasal المتوسطة. في حالة ثالثة، كانت تزرع الخلايا في المعادن النزرة المنضب Neurobasal المتوسطة التي أعيد فقط لالمغنيسيوم والكالسيوم، مع إضافة المعادن السامة المفترضة (0.5 ميكرومتر الكادميوم والنحاس والزئبق، و2 ميكرومتر الرصاص) (ASD2). ASD2 متوسطة النمو، لذلك، مع الحديد والزنك نقص والزائد من الكادميوم والنحاس والزئبق، والرصاص يشبه الشخصي biometal مميزة وجدت في ASD [3].

الخلايا المعرضة لASD2 المتوسطة عرض بالفعل انخفاضا كبيرا في صحة الخلايا مرئية من قبل عدد متزايد من نوى أفكارك وزيادة تجزئة شجيري (الشكلان 3 (أ) و 3 (ب)). تم تخفيض عدد من نقاط الاشتباك العصبي في طول 10 ميكرون التغصنات المقررة من قبل الكمي للالباسون وHomer1b / ج نقاط وإيجابية بشكل كبير في الخلايا نموا في المتوسط ​​تشبه الشخصي biometal وجدت في المرضى ASD (ASD2) (الشكل 3 (ج)). جنبا إلى جنب مع تخفيض في عدد من نقاط الاشتباك العصبي، ومستويات التعبير الجيني لمستقبلات متشابك مثل NMDAR (GluN1، GluN2a، وGluN2b) وكذلك الزنك تعتمد شانك البروتينات سقالة (Shank1، Shank2، وShank3) تظهر تغيرات كبيرة (الشكل 3 (د)). في حين ارتفع جود معادن سامة المفترضة في المرضى ASD (ASD1) غير كافية لزيادة كبيرة في مستويات GluN2b التعبير، GluN1 وGluN2a وShank1، Shank2، ومستويات Shank3 مرنا تتغير كثيرا إلا في حالة وجود الزنك إضافية ونقص الحديد (ASD2 ). قراءات الفلورية للبروتينات شانك تظهر انخفاضا في مستوى البروتين في ظل ظروف ASD1، في حين أن نقاط الاشتباك العصبي المتبقية تحت ASD2 حالة عرض مستويات شانك العادية (الشكل 3 (ه)). ومع ذلك، التحليل باستخدام بروتين الكيمياء الحيوية يبين أنه، عموما، يتم تخفيض تركيزات البروتين شانك في جزء P2 من خلايا تنمو في ظل حالة ASD2 (الشكل 3 (و)). بالإضافة إلى ذلك، على غرار انخفاض مستويات مرنا من مفارز NMDAR، اكتشفنا أقل بكثير من البروتين GluN2a والاتجاه نحو انخفاض مستويات البروتين GluN2b في الخلايا المزروعة في ASD2 المتوسطة. وعلاوة على ذلك، ZnT-1 مستويات التعبير، مصدر الزنك وصفت مؤخرا بأنها المخصب في postsynapses [16]، يتفاعل بحساسية جدا للتغيرات في تركيزات المعادن النزرة مثل تلك الناجمة عن تطبيق ASD2 المتوسطة (الشكل 3 (و)).
الرقم 3: لمحة مقتضبة biometal ASD يؤثر على أعداد صحة الخلية والمشبك في المختبر. (أ) كانت تزرع الخلايا العصبية الحصين من DIV 10 إلى 14 DIV في وسائل الإعلام ثقافة الخلية التي تحتوي على مجموعات مختلفة من المعادن النزرة: خلايا التحكم (السيطرة) كانت تزرع في Neurobasal المتوسطة. ما نمت الخلايا ASD1 في Neurobasal المتوسطة مع إضافة المعادن السامة المفترضة (0.5 ميكرومتر الكادميوم والنحاس والزئبق، و2 ميكرومتر الرصاص). ما نمت الخلايا ASD2 في المعادن النزرة المنضب Neurobasal المتوسطة التي أعيد فقط لالمغنيسيوم والكالسيوم، مع إضافة المعادن السامة المفترضة (0.5 ميكرومتر الكادميوم والنحاس والزئبق، و2 ميكرومتر الرصاص). تم حساب كمية من موت الخلايا تقييم عدد من نوى أفكارك العصبية (التي حددتها MAP2 وتلطيخ دابي) في الحقل البصري (من 5 مجالات رأي) تطبيع مقابل العدد الإجمالي للخلايا العصبية في المجال البصري. ويمكن ملاحظة انخفاض كبير في صحة الخلية في الخلايا التي تعاني من نقص في الحديد والزنك وتعرض لمعادن سامة (ASD2). (ب) وكان التحقيق في عدد من التشعبات الابتدائي والثانوي، والتعليم العالي من 10 خلايا لكل حالة. كانت ملطخة الخلايا مع MAP2 الأجسام المضادة. كما علامات موت الخلايا، تظهر الخلايا العصبية تجزئة (معسر إيقاف) التشعبات، بدءا من الفروع البعيدة أكثر من سوما. ولم يحتسب التشعبات التي تظهر عليها علامات التجزئة. المقابلة للزيادة في موت الخلايا، الخلايا العصبية المتزايدة في ظل ظروف ASD2 أظهرت زيادة كبيرة علامات تجزئة شجيري. (ج) وصفت نقاط الاشتباك العصبي باستخدام الباسون وHomer1b / ج مضان وعدد من نقاط ومناعيا تم قياس في 10 ميكرون طول التغصنات على التشعبات الأولية (3 التشعبات في الخلايا، 10 الخلايا في المجموع لكل مجموعة). تظهر الصور المدمجة تلطيخ إضافية من نوى باستخدام دابي (السماوي) وMAP2 (الأزرق). ويمكن رؤية انخفاض كبير في الخلايا نموا في المتوسط ​​تشبه الشخصي biometal وجدت في المرضى ASD (ASD2). (د) تم قياس مستويات التعبير مفارز NMDA مستقبلات (GluN1، GluN2a، وGluN2b) والجينات SHANK (Shank1، Shank2، وShank3) من خلال QRT-PCR. وتظهر تركيزات مرنا افتراضية في المتوسط ​​من ثلاثة مكررات وتطبيع ضد HMBS. يمكن أن ينظر إلى انخفاض كبير في GluN1 وGluN2a مرنا مستويات التعبير في الخلايا المزروعة في ظل ظروف ASD2. في ظل ظروف ASD1، ومستويات GluN2b زيادة كبيرة. ويمكن أيضا لوحظ انخفاض كبير في مستويات التعبير الجيني في أفراد الأسرة شانك في ظل ظروف ASD2، وهو أمر مهم لShank1، Shank2، وShank3. (ه) سيتولوجية مناعية من الخلايا العصبية قرن آمون DIV 14 نمت تحت السيطرة، وظروف ASD1، وASD2. وقد تم قياس كثافة مضان من شانك نقاط وإيجابية باستخدام أجسام مضادة محددة لShank1، Shank2، وShank3. الصور المثالية (اللوحة العليا) وتقدير من متوسط ​​كثافة إشارة نقاط و10 خلايا لكل حالة (اللوحة السفلى). تظهر الصور المدمجة تلطيخ دابي إضافية للنواة. الخلايا العصبية نمت في ظل ظروف ASD1 تظهر انخفاضا كبيرا للبروتينات شانك متشابك، في حين أن الخلايا العصبية في ظل ظروف ASD2 لم تظهر انخفاضا. (و) تحليل مستويات البروتين التعبير في متشابك (P2) أجزاء من مفارز NMDAR والبروتينات للأسرة شانك، وZnT-1 من ثلاث تجارب مستقلة تطبيع ضد β-III-تويولين أو الأكتين. الخلايا العصبية التي تزرع في ASD2 المتوسطة تشير إلى انخفاض كبير في GluN2a مفارز مستقبلات واتجاها نحو الانخفاض من GluN2b. في المقابل، يظهر متشابك ZnT-1 على upregulation قوي. يتم تخفيض التعبير عن أفراد الأسرة شانك في ظل ظروف ASD2 (خفض اللوحة اليسرى). تخفيض مهم لShank1 وShank2 وينظر إليه على أنه اتجاه واضح لShank3. وتظهر عصابات المثالية في اللوحة اليمنى السفلى.

وأخيرا، في المجموعة الأخيرة من التجارب، أردنا لتحديد ما إذا كان إضافة واحد المعادن النزرة معين قد يؤدي إلى الإنقاذ في النمط الظاهري الملاحظ بعد حمل لASD مثل الملف الشخصي biometal في زراعة الخلايا أو ما إذا كان يتعين على جميع التعديلات التي ينبغي معالجتها كل على حدة. وبالنظر إلى أن اقترح دورا عدائيا من الزنك والرصاص أو النحاس قبل [3، 4]، وأننا يمكن أن تحقق لها تأثير يحتمل أن تكون مفيدة من الزنك على نقاط الاشتباك العصبي، أردنا المقبل لتوضيح ما إذا كانت مكملات الزنك في تركيبة مع المعادن الضارة (ASD2) هو قادرا على تعديل سمية المعادن النزرة على الخلايا العصبية في المختبر. تحقيقا لهذه الغاية، أجرينا قراءات مماثلة كما هو موضح أعلاه (الشكل 3). ومع ذلك، لم تستكمل ASD2 المتوسطة (Neurobasal المتوسطة التي أعيد فقط لالمغنيسيوم والكالسيوم، مع إضافة المعادن السامة المفترضة (0.5 ميكرومتر الكادميوم والنحاس والزئبق، و2 ميكرومتر الرصاص)) مع 50 ميكرومتر الزنك. وكان بالإضافة إلى ذلك من الزنك قادرة على إنقاذ موت الخلايا الملحوظ في الكشف عن الثقافات نمت في ظل ظروف ASD2 (الشكل 4 (أ))، على الرغم من أنها أدت إلى انخفاض كبير في تفتيت شجيري (الشكل 4 (ب)). مع هذا، تم انقاذ الانخفاض في عدد من نقاط الاشتباك العصبي في طول 10 ميكرون التغصنات المقررة من قبل الكمي للالباسون وHomer1b / ج نقاط والايجابية التي ظهرت في ظل ظروف ASD2 بعد إضافة الزنك (ASD2 + الزنك) (الشكل 4 (ج)). كان مكملات الزنك لتتمكن من زيادة كبيرة في خفض مستويات مرنا من NMDA مفارز مستقبلات وأفراد الأسرة شانك ينظر في الخلايا تنمو في ظل الظروف ASD2 (الشكل 4 (د)) أيضا. وكانت مستويات التعبير عرقوب مرنا لا تختلف كثيرا عن تلك الخلايا تنمو في ظل ظروف السيطرة. ومع ذلك، في حالة NMDA مفارز مستقبلات، لا يزال مستويات مرنا بشكل كبير انخفضت مقارنة بالمجموعة الضابطة. التغيرات الملحوظة في مستوى البروتين من NMDA مفارز مستقبلات، والزنك Shank2 وShank3، وZnT-1 ملزم بدوره تم انقاذ تماما بعد إضافة الزنك (ASD2 + الزنك) (الشكل 4 (و)). كشفت قراءات المناعي أي تغيير في مستويات البروتين متشابك بعد مكملات من خلايا تنمو في ظل الظروف ASD2 مع الزنك (الشكل 4 (ه)، الشكل S2D).
الرقم 4: العلاقات التعاونية والعدائية بين المعادن النزرة والزنك. وقد نمت الخلايا العصبية قرن آمون من DIV 10 إلى DIV 14 في وسائل الإعلام ثقافة الخلية التي تحتوي على مجموعات مختلفة من المعادن النزرة: خلايا التحكم (السيطرة) كانت تزرع في المعادن النزرة المنضب Neurobasal المتوسطة التي تم تشكيلها لجميع المعادن النزرة المنضب (الماغنسيوم، الكالسيوم، الحديد، و الزنك) وفقا لتركيزات المعادن المشار إليها الشركة المصنعة. ما نمت الخلايا ASD2 في المعادن النزرة المنضب Neurobasal المتوسطة التي أعيد فقط لالمغنيسيوم والكالسيوم، مع إضافة المعادن السامة المفترضة (0.5 ميكرومتر الكادميوم والنحاس والزئبق، و2 ميكرومتر الرصاص). ما نمت الخلايا ASD2 + الزنك في ASD2 المتوسطة إلا أن 50 ميكرومتر تمت إضافة الزنك إلى المتوسطة. تم حساب كمية من موت الخلايا تقييم عدد من نوى أفكارك العصبية (التي حددتها MAP2 وتلطيخ دابي) في الحقل البصري (من 5 مجالات رأي) تطبيع مقابل العدد الإجمالي للخلايا العصبية في المجال البصري. ويمكن ملاحظة انخفاض كبير في صحة الخلية في الخلايا التي تعاني من نقص في الحديد والزنك وتعرض لمعادن سامة (ASD2). لم تكن قادرة على إنقاذ موت الخلايا احظ (ASD2 + الزنك) زد إلى ذلك. (ب) وكان التحقيق في عدد من التشعبات الابتدائي والثانوي، والتعليم العالي من 10 خلايا لكل حالة. كانت ملطخة الخلايا مع MAP2 الأجسام المضادة. كما علامات موت الخلايا، تظهر الخلايا العصبية تجزئة (معسر إيقاف) التشعبات، بدءا من الفروع البعيدة أكثر من سوما. ولم يحتسب التشعبات التي تظهر عليها علامات التجزئة. يمكن انقاذ الانخفاض الكبير ينظر في ظل ظروف ASD2 بشكل كبير من إضافة الزنك. (ج) وصفت نقاط الاشتباك العصبي باستخدام الباسون وHomer1b / ج مضان وعدد من نقاط ومناعيا تم قياس في 10 ميكرون طول التغصنات على التشعبات الأولية (3 التشعبات في الخلايا، 10 الخلايا في المجموع لكل مجموعة). ويمكن رؤية انخفاض كبير في الخلايا نموا في المتوسط ​​تشبه الشخصي biometal وجدت في المرضى ASD (ASD2). إضافة الزنك تنقذ آثار رأيت على كثافة المشبك. (د) تم قياس مستويات التعبير مفارز NMDA مستقبلات (GluN1، GluN2a، وGluN2b) والجينات SHANK (Shank1، Shank2، وShank3) من خلال QRT-PCR. وتظهر تركيزات مرنا افتراضية في المتوسط ​​من ثلاثة مكررات وتطبيع ضد HMBS. كان مكملات الزنك لتتمكن من زيادة كبيرة في خفض مستويات مرنا في خلايا تنمو في ظل الظروف ASD2. ومع ذلك، في كل الحالات، لا يزال مستويات مرنا بشكل كبير انخفضت مقارنة مع الضوابط لمفارز NMDAR GluN1 وGluN2a. وتم انقاذ مستويات التعبير عن أفراد الأسرة شانك تماما (Shank1 وShank3). (ه) والزنك مكملات على DIV 10-14 لم يغير كثيرا من شدة مضان نقاط ومتشابك. (و) تحليل مستويات البروتين التعبير في متشابك (P2) أجزاء من مفارز NMDAR والبروتينات للأسرة شانك، وZnT-1 من ثلاث تجارب مستقلة تطبيع ضد β-III-تويولين أو الأكتين. الخلايا العصبية التي تزرع في ASD2 المتوسطة تشير إلى انخفاض كبير في GluN2a مفارز مستقبلات واتجاها نحو الانخفاض من GluN2b، التي أنقذت مكملات الزنك ل. وبالمثل، متشابك مستويات ZnT-1 انخفاض تقريبا للسيطرة على مستويات في ASD2 المتوسطة مع الزنك مقارنة ASD2 الزنك المتوسطة ناقصة. يتم تقليل التعبير عن البروتينات شانك في ظل ظروف ASD2 وتركيز متشابك من الزنك، تعتمد Shank2 وأفراد الأسرة Shank3 استعادة عن طريق الزنك مثل أن مستويات Shank2 هي انخفضت تحت ASD2 + الزنك حالة (اللوحة السفلى اليسرى) لم يعد إلى حد كبير. وتظهر عصابات المثالية في اللوحة اليمنى السفلى. (ز) استخدام ICP-MS، وتركيزات المعادن خارج الخلية من مزارع الخلايا قرن آمون (في المعادن، واختبار مان ويتني) وقد تم قياس مع وبدون وجود الزنك. شوهد انخفاض في امتصاص النحاس والزئبق، والسيلينيوم باعتبارها الاتجاه على coapplication من الزنك، في حين كانت زيادة في امتصاص الرصاص واضحة.

وعلاوة على ذلك، كنا ICP-MS لقياس تركيزات المعادن خارج الخلية من مزارع الخلايا قرن آمون مع وبدون وجود الزنك. وكان الانخفاض في امتصاص النحاس والزئبق، وسي مرئية على coapplication من الزنك، في حين كانت زيادة في امتصاص الرصاص مرئية (الشكل 4 (ز)). عندما تم الجمع بين ZnCl2 (50 ميكرومتر) مع أي CdCl2 (5 ميكرومتر)، CuCl2 (120 ميكرومتر)، HgCl2 (5 ميكرومتر)، PbCl2 (5 ميكرومتر)، أو SeCl4 (6 ميكرومتر) معاملة، بانخفاض طفيف من موت الخلايا العصبية على وقد لوحظ التعرض لZnCl2 وHgCl2 مقارنة مع التعرض لHgCl2 وحدها. وعلاوة على ذلك، تم تحديد تحسنا كبيرا في بقاء الخلية العصبية إذا استكملت ZnCl2 وCdCl2 معا. هناك، يمكن أن الزنك استعادة الحالة الصحية الخلية العصبية قريبة للسيطرة على مستويات (أرقام S2E، F).

التعديلات لاحظ لا يمكن تفسير التغيرات في عبر التشابك الزنك اشارة بالنظر إلى أن presynapses في زراعة الخلايا قرن آمون دينا منخفضة جدا إلى مستويات غائبة من حويصلي الزنك (الشكل S2G). بالإضافة إلى ذلك، تسببت التعديلات تحت ASD2-على الرغم من الظروف إلى حد عال انقاذهم من قبل الزنك مكملات-لا تستند على نقص الزنك وحدها. مقارنة بين ASD2 والزنك النقي ناقصة (ZND) الظروف تكشف أن نقص الزنك دون إجراء أي تعديلات إضافية في biometals لا يؤدي إلى انخفاض كبير في صحة الخلية (أرقام S3A، B) وعدد المشبك (الشكل S3C) مثل ينظر في ظل ظروف ASD2 . وعلاوة على ذلك، فإن الانخفاض في مستويات التعبير مرنا من NMDA مفارز مستقبلات أقل وضوحا وتغيب لأفراد الأسرة SHANK تحت نقص الزنك النقي (الشكل S3D). لكن، وكما ذكرت من قبل [14]، ونقص الزنك يؤثر تأثيرا كبيرا على مستويات متشابك من الزنك ملزمة أفراد الأسرة شانك Shank2 وShank3 باستخدام قراءات مناعي (الشكل S3E). الكيمياء الحيوية البروتين مع الكسور P2 (الشكل S3F) يكشف عن أن، على مستوى البروتين، ونقص الزنك وحدها بالفعل يؤثر NMDAR فرعية التعبير، ولكن إلى حد أقل في التعبير عن شانكس.
4. مناقشة

عدد متزايد من تقارير التتبع متوازن المعادن التوازن في الأطفال الذين يعانون من اضطرابات النمو العصبي زيادة الحاجة إلى فهم أفضل لكيفية تأثير المعادن السامة المفترضة الخلايا العصبية. ولذلك، فإننا التحقيق في الآثار من مختلف المعادن النزرة الأساسية وغير الأساسية على الخلايا العصبية في المختبر، ومزيد من الدراسة علاقتها مع الزنك، واحدة من معظم المعادن النزرة وفيرة في الدماغ.

في المجموعة الأولى من التجارب، ونحن التحقيق في تأثير الزائد مع العناصر النزرة واحد. على الرغم من المعادن النزرة مثل المغنيسيوم، النحاس، الحديد، سي، والزنك ضرورية مع دورا حيويا في وظائف المخ الطبيعية، وزيادة مستويات في الدماغ قد يؤدي إلى أعراض عصبية حادة. ومع ذلك، وجدنا مقاومة قوية من الخلايا العصبية ضد سمية FeCl2 يسببها مع عدم وجود تغيرات شكلية حتى بتركيزات عالية جدا (تصل إلى 400 ميكرومتر) والتي تعتمد على جرعة تأثير synaptogenic طفيف. هذا الغياب من موت الخلايا العصبية يتماشى مع النتائج من الأسقف وآخرون. [17] وتقول التقارير أن التعرض إلى 100 ميكرومتر من سترات الأمونيوم الحديديك لمدة 24 ساعة إلى الخلايا العصبية مثقف زيادة محتوى الحديد داخل الخلايا بواسطة عامل 30 لكنها لم تؤثر خلية الجدوى [17].

وبالمثل، فإن عددا قليلا فقط التغيرات المورفولوجية مرضي من الخلايا العصبية الأولية يمكن أن ينظر إليه بعد التعرض لMgCl2 في نطاق تركيز اختبارها. تم نشر نتائج مماثلة ريغان وآخرون. [18] الذين عالجوا العصبونات القشرية الأولية مع ما يصل إلى 3 ملم MgCl2 دون الكشف عن أي دليل الصرفي للإصابة الخلية [18]. في دراستنا، زادت تركيزات المتوسطة (100 ميكرومتر) من MgCl2 عدد من التشعبات التعليم العالي وزيادة طفيفة في عدد من نقاط الاشتباك العصبي. في المقابل، تعرض الخلايا العصبية لCuCl2 يؤدي إلى موت الخلايا تعتمد على الجرعة وانخفاض كبير في أعداد المشبك المترابطة إلى انخفاض عدد خلايا قابلة للحياة، والتي يمكن ملاحظتها أيضا في الخلايا العصبية الأصغر سنا في DIV 6 [19].

حد ذاته هو معدن اساسي أثر مع مجموعة ضيقة من تركيزات بين نقص وسمية. أيضا، في هذه الدراسة، وقد لوحظ مجموع موت الخلايا العصبية في 10 ميكرومتر SeCl4، في حين عرضت 8 ميكرومتر SeCl4 لزيادة أعداد المشبك. ولا يعرف سوى القليل عن التأثير السام لSeCl4 على الخلايا العصبية مثقف يرجع ذلك إلى حقيقة أن معظم الدراسات ركزت على تأثير وقائي من سي ضد الغلوتامات التي يسببها التحفيز الزائدة [20] أو ضد سمية الزئبق غير العضوي [21]. Savaskan وآخرون. [20] وقد ذكرت أن التعرض ل10 ميكرومتر سيلينات الصوديوم انخفض HT22 خلية بقاء حوالي 20٪. لم موت الخلايا لا تصل إلى 100٪ حتى 1 ملم [20]. وهذه الخلافات على الأرجح بسبب استخدام مختلف أنظمة زراعة الخلايا وليس من المستغرب أن خط الخلية الحصين خلد هو أكثر مقاومة ضد سي سمية الناجم من الخلايا العصبية الأولية.

ويشارك الزنك في مجموعة كبيرة من العمليات الخلوية ولكن تم الإبلاغ عن زيادة تركيز أيونات الزنك غير منضم إلى تكون ضارة خصوصا على الجهاز العصبي المركزي وقتل الخلايا في المختبر [22]. في هذه الدراسة، وتركيزات أعلى من 100 ميكرومتر ZnCl2 يسببها موت الخلايا العصبية. ومع ذلك، أدى الزنك إلى زيادة في أعداد المشبك.

وعلى النقيض من المعادن النزرة الضرورية، ومن المتوقع أن تكون أكثر ضررا بكثير التعرض للمعادن السامة المفترضة. في الواقع، كان حتى التركيزات المنخفضة من CdCl2 تأثيرات شديدة على الصحة الخلية العصبية (LD50 5 ميكرومتر). لاحظنا موت الخلايا العصبية التي تعتمد على الجرعة وخطي يرتبط الحد من نقاط الاشتباك العصبي. وقد أظهرت سمية الكادميوم تؤدي إلى ضعف تكوين الخلايا العصبية، وانخفاض تمايز الخلايا العصبية، وتخفيض axogenesis في المختبر [23] ولقد تم الإبلاغ عن تركيزات أقل من ذلك لقمع شجيري والتنمية متشابك [24، 25]. على الرغم من قاتل موت الخلايا العصبية، في تركيزات الكادميوم منخفضة، والخلايا الدبقية ويبدو أن أكثر مقاومة وهو ما يتفق مع التقارير السابقة [26].

على الرغم من أن القاعدة هو عصبي مقبولة تماما [27]، وناقش كعامل لتطوير التنكس العصبي، على سبيل المثال، كما رأينا في مرض الزهايمر (AD) [28]، ونحن لم تراع الآثار الضارة على الخلايا العصبية والمشابك حتى في عالية جدا تركيزات AlCl3 (تصل إلى 500 ميكرومتر) مماثلة لدراسة أجرتها كاواهارا وآخرون. [29]. ومع ذلك، أنواع الألومنيوم محبة للدهون مثل acetylacetonate الألومنيوم أو maltolate الألومنيوم قد تكون أكثر سمية من AlCl3 [29]. بالإضافة إلى ذلك، هطول الأمطار ممكن من AlCl3 في درجة الحموضة الفسيولوجية [27] قد منع القاعدة من الوصول إلى تركيزات داخل الخلايا عالية بما فيه الكفاية للحث على سمية. فمن الممكن أن آل لا يؤثر على عدد من نقاط الاشتباك العصبي بل يغير اللدونة متشابك [30، 31] أو قد تعمل بالإضافة إلى العوامل المهيئة الأخرى. يثير الاهتمام والفضول، واقترح أن المكون الجيني للأمراض AD قد ينطوي على الجين الحساسية، بعد، الكشف عن هويته، أن يزيد آل امتصاص [32].

الزئبق يسبب العجز العصبي والإعاقة حركي [33-36]. وبالتالي فإنه ليس من غير المتوقع أن مستويات الزئبق مرتفعة أدت إلى موت الخلايا العصبية الشديدة بالفعل في تركيزات منخفضة (LD50 5 ميكرومتر) ترافق مع انخفاض تعتمد على الجرعة من كثافة متشابك. تم الإبلاغ عن الزئبق سمية لزيادة مع مرور الوقت الحضانة [37]. وبالتالي، يمكن حتى في تركيزات أقل من HgCl2 (25-100 نانومتر) يؤدي إلى انخفاض كبير في بقاء الخلية العصبية في حالة التوسع التعرض [38].

كان معروفا للبرميل لتكون الملوثات البيئية المرتبطة العديد من الأمراض العصبية وتم الإبلاغ عن أن تؤثر على دماغ الطفل تطوير سلبا [39، 40]. ومع ذلك، في هذه الدراسة، بدا الرصاص للعمل مفيد قليلا على صحة الخلايا العصبية وزيادة طفيفة في عدد متشابك تركيزات أعلى. وبالمثل، Audesirk وآخرون. [41] وقد ذكرت أن الرصاص أظهر أقل التأثيرات على الخلايا العصبية قرن آمون في تركيزات المتوسطة (1-10 ميكرومتر) [41]. قد تردد أن سمية الرصاص لا ينتج عن تأثير مباشر على الخلايا العصبية ولكن عن طريق التدخل في العمليات بالفعل خارج الجهاز العصبي المركزي وربما يعود ذلك الى عدم وجود مستقبلات معينة أو المنافسة مع البروتينات المستهدفة. A تدخل السامة، كما ذكرت، على سبيل المثال، عن النحاس والزنك [42]، قد يحدث بالفعل داخل الجهاز الهضمي وليس في الدماغ.

وتجدر الإشارة إلى أن العديد من العوامل مثل استخدام FBS أو B27 في متوسط ​​النمو قد تؤثر على سمية بعض المعادن. على سبيل المثال، ألبومين المصل البقري (BSA) الحالي في مصل الجنين البقري (FBS) وB27 تكملة تمت عالية الزنك قدرة [43] وتركيز الفعلية التي تصل إلى الخلايا العصبية من الصعب التنبؤ ملزمة. في الواقع، تبين أن تركيز أكثر من 100 نانومتر "الحرة" الزنك هي سامة للخلايا [44]. وبناء على هذا والقيمة المحسوبة للزنك في هذه التجارب، فمن المرجح أن كمية عالية من المعادن النزرة سيتم تخزينها مؤقتا وملزمة للبروتينات مباشرة بعد التطبيق.

إذا كنت التلاعب من المعادن النزرة واحد يظهر تأثير على بقاء الخلية ولكن نقاط الاشتباك العصبي أيضا. ومع ذلك، في المرضى الذين يعانون مثل أولئك الذين يعانون من ASD، وهو مزيج من التعديلات المعادن النزرة (الزائدة والقصور) ويحدث ذلك قد خلق بيئة جديدة كليا لالخلايا العصبية وتؤثر على عدد المشبك وظيفة. وهكذا، في المجموعة الثانية من التجارب، أنشأنا لمحة biometal التي تمثل واحدة ذكرت في الأفراد الذين يعانون من التوحد وتقييم تأثير على صحة الخلايا وكثافة المشبك وتكوينها.

مؤخرا، تم تحديد مسار نقاط الاشتباك العصبي في glutamatergic مثير كتبها شاشات الوراثية على نطاق واسع ووصف ASD الجينات المرشحة [45] يتركز حول البروتينات للأسرة شانك. وقد وصفت الطفرات في أفراد الأسرة الثلاثة Shank1، Shank2 (ProSAP1)، وShank3 (ProSAP2) لتترافق مع ASD [46، 47] ونماذج حيوانية مع الحذف من هذه الجينات العارضة لASD مثل الظواهر [48، 49]. ومع ذلك، Shank2 وShank3 أيضا البروتينات التي تنظم كبير من قبل الزنك ملزم [50] وقيمتها تخفيض في النماذج الحيوانية للزنك نقص [14] أو النحاس الزائد [51]. لذلك، هذه البروتينات قد تكون واعدة المرشحين تقديم وصلة بين الخلل المعادن النزرة والعيوب متشابك في ASD. وبناء على هذا النموذج، هنا، قمنا بتقييم متشابك مستويات البروتين شانك. في الواقع، لاحظنا فقدان نقاط الاشتباك العصبي جنبا إلى جنب مع خفض مستويات بروتين P2 المرتبطة في أفراد الأسرة شانك.

وبالنظر إلى أن الزنك هو واحد من المعادن النزرة الأكثر وفرة في المخ وتعمل على postsynapse التأثير على البروتينات متشابك واللدونة [52-55]، ونحن التحقيق ما إذا كان الزنك قد تكون قادرة على انقاذ الملف الشخصي ASD biometal يسببها النمط الظاهري. كان مكملات الزنك المزمن قادرة على تطبيع تغييرات في الزنك ملزم Shank2 وShank3 ولكن لم يقدم مزيدا من زيادة مستويات شانك كما ذكرت أن تنجم عن مكملات الزنك الحاد [14]. وهكذا، وآلية التغذية المرتدة قد يكون متورطا الذي ينظم مستويات شانك على مر الزمن قصرها على مستوى ينظر في الضوابط.

بالإضافة إلى ذلك، ونحن مهتمون في مستويات مفارز NMDAR منذ تعديلات مثل وصفت ذلك بانخفاض قدره NMDARs في الخلايا ناقصة Shank3، Shank2 خروج المغلوب الفئران، والزنك قبل الولادة الفئران ناقصة التي تعرض أيضا الحد من Shank2 وShank3 [14، 56، 57]. في الواقع، على غرار التعبير عن البروتينات شانك، كان تعبيرا عن مفارز NMDAR حساسة لتعقب عوارض معدنية مثل تلك التي ظهرت في المرضى الذين يعانون من التوحد، ولا سيما زيادة مستويات المعادن السامة المفترضة بالاشتراك مع الزنك ونقص الحديد (ASD2)، على مرنا و مستوى البروتين متشابك. هذا ويقول مرة أخرى أن التعديلات في حالة المعادن النزرة كما رأينا في ASD المرضى إذا كان موجودا بطريقة مماثلة في الدماغ من المرضى قد تكون كافية لإحداث تغييرات مماثلة لتلك التي ظهرت في النماذج الوراثية للASD مثل شانك الفئران خروج المغلوب. على وجه الخصوص، قد تتأثر التحول من NMDAR فرعية 2B (GluN2b) التي تحتوي على نقاط الاشتباك العصبي لGluN2a كما رأينا في التطور الطبيعي بسبب انخفاض GluN2a ولكن ليس GluN2b التعبير على مرنا ومستوى البروتين الذي يحدث فقط في ملف تعريف المعادن النزرة مماثلة لتلك التي شوهدت في المرضى الذين يعانون ASD.

بعد الزنك، ومستويات مرنا من NMDA مفارز مستقبلات ظلت إلى حد كبير انخفضت مقارنة بالمجموعة الضابطة. ومع ذلك، بالمقارنة مع الظروف ASD2، تم انقاذ بشكل كبير من مستويات التعبير. في المقابل، يتم استعادة التعبير الجيني من أفراد الأسرة شانك تماما بعد الزنك. حاليا لا يفهم جيدا الآليات لكيفية الزنك قد تؤثر NMDAR وشانك النسخ. ومع ذلك، Myc على المرتبطة بالبروتين إصبع الزنك (MAZ) يرتبط عنصر مربع GC في المناطق التنظيمية من GluN1، GluN2A، GluN2B، وGluN2C [58]. وهكذا، وتوافر الزنك قد تؤثر، من بين العديد من عوامل النسخ الأخرى مع مجالات إصبع الزنك، MAZ، مما يؤثر على معدلات التعبير NMDAR الوحيدات. عامل آخر النسخ التي تعتبر حساسة لتعقب مستويات المعادن، وخاصة لزد، هو MTF1 (المعادن التنظيمي عامل النسخ 1). MTF1 بربط عناصر استجابة المعدنية (المغاربة المقيمين في الخارج) في منطقة المروج من الجينات في وجود الزنك لزيادة معدل النسخ الخاصة بهم [59، 60]. يثير الاهتمام والفضول، والمروج من Shank3 يحتوي على التوعية من مخاطر الألغام. ومع ذلك، ما إذا كان تنظيم الجينات من السيقان التي كتبها الزنك هو يعتمد على MTF1 لم يتم التحقيق فيها حتى الآن.

النتائج التي تم الحصول عليها من التعبير الجيني التحليلات لم تتطابق دائما مع التعبير البروتين يقاس تحليل لطخة غربية وتحليل كثافة المناعي. ومع ذلك، لمرنا التحليلات، واتخذ الحمض النووي الريبي مجموع من المحللة خلية كاملة. في المقابل، أجريت تحاليل لطخة غربية باستخدام جسيم مشبكي الكسور P2 المخصب. وبالتالي فمن الممكن أن انخفاض مستوى مرنا يمكن أن ينعكس انخفاضا في البروتينات extrasynaptic. بالإضافة إلى ذلك، فإن الانخفاض في مستويات مرنا ربما لم تكن موجودة لفترة كافية لتؤثر على تركيز البروتينات مستقرة مع بطء معدلات تسليم. وبالمثل، في قراءات مضان، متشابك فقط تم قياس نقاط ومناعيا. هنا، قد لا يكون تم الكشف عن فقدان كامل تقريبا من البروتينات مما يؤدي إلى شدة إشارة منخفضة جدا تحت مستوى الخلفية.

وعلاوة على ذلك، قمنا بتحليل التعبير متشابك من ZnT-1 التي تم الإبلاغ عنها مؤخرا لتخصيبه في مديرية الأمن العام ومقترن NMDAR [16]. وجدنا أن مستويات البروتين من ZnT-1 تتفاعل بحساسية للعوارض معدنية التتبع المعمول بها، مرة أخرى خاصة أن ASD2. يمكن للمرء أن يتكهن بأن تصدير الزنك كما إشارة التمثيل متشابك، والتي قد تكون انخفضت في الزنك المنضب المتوسطة، والتعويض عن زيادة عدد ZnT-1 البروتينات في المشبك. ومع ذلك، بالنظر إلى أن ZnT-1 التعبير العالمي وعادة ما upregulated استجابة لزيادة تركيزات الزنك [61]، آلية جديدة للمتشابك ZnT-1 التنظيم هو مضمر. يثير الاهتمام والفضول، يتم تقليل upregulation من الزنك-T1 بعد تجديد ASD2 المتوسطة مع الزنك.

على الرغم من أن التعديلات احظ لا يمكن تفسيرها عن نقص الزنك فقط، وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن مكملات من ASD2 المتوسطة مع الزنك وحدها بالفعل كافية لانقاذ معظم الآثار الناجمة عن التعرض لالمفترضة المعادن النزرة السامة جنبا إلى جنب مع نقص الزنك والحديد. إضافة الزنك يمكن استعادة جزئيا الصحة الخلية (انخفاض المتفرعة من التشعبات العالي) وفقدان متشابك. بالإضافة إلى ذلك، إلى التأثير على نقاط الاشتباك العصبي، وسمية الرصاص والكادميوم، النحاس، والزئبق يمكن أن تخفض على علاج الزنك نظرا لعلاقة عدائية بين الزنك وهذه المعادن النزرة. وفقا للالأدب [62، 63]، يمكن أن نلاحظ سلوك عدائي قوي وكبير من الزنك والكادميوم على صحة الخلايا العصبية وكثافة المشبك. وعلاوة على ذلك، فقد رأينا انخفاضا طفيفا من النحاس والزئبق امتصاص عليه coapplication من ZnCl2 التي يمكن زيادة أكبر إذا سيكون التركيز الزنك لا يكون متساوي المولية إلى النحاس والزئبق ولكن يتجاوز تركيزها.

أخذت معا، نتائجنا تظهر أن، بغض النظر عن سؤال مهم ولكن ذلك لم تحل حتى الآن، ما إذا كانت هذه الاختلالات في العناصر النزرة ينظر في المرضى ASD هي السبب أو النتيجة، في الواقع وضعا biometal تغيير قد يكون لها تأثير على تكوين المشبك وظيفة. معالجة التقلبات من المعادن النزرة قد يكون نهجا جديدا في تعديل النمط الظاهري المرض في المرضى وينبغي التحقيق بدقة في الجسم الحي في الدراسات المستقبلية.
تضارب مصالح

تعلن الكتاب أنه لا يوجد تضارب في المصالح فيما يتعلق بنشر هذه الورقة.
شكر وتقدير

ويدعم أندرياس M. Grabrucker التي كتبها Baustein 3.2 (L.SBN.0083) وجمعية الزهايمر (NIRG-12-235441). ويدعم توبياس M. Boeckers من قبل الاتحاد الأوروبي وAIMS (مبادرة الأدوية المبتكرة المشتركة تعهد بموجب اتفاقية المنحة رقم 115300).
المراجع

R. Delorme، E. EY، R. تورو، M. Leboyer، C. جيلبرج، وT. Bourgeron "التقدم نحو علاجات لعيوب متشابك في التوحد،" طب الطبيعة، المجلد. 19، لا. 6، ص. 685-694، 2013. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
AM Grabrucker، "العوامل البيئية في التوحد،" حدود في الطب النفسي، المجلد. 3، والمادة 118، 2013. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
S. Pfaender وAM Grabrucker، "توصيف ملامح biometal في الاضطرابات العصبية،" Metallomics، المجلد. 6، لا. 5، ص. 960-977، 2014. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
H. ياسودا وT. تسوتسوى "تقييم الاختلالات المعدنية الطفلي في اضطرابات طيف التوحد (أي إس دي إس)،" المجلة الدولية لأبحاث البيئة والصحة العامة، المجلد. 10، لا. 11، ص 6027-6043، 2013. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
MD اكشمي بريا وA. غيثا، "مستوى من العناصر النزرة (النحاس والزنك والمغنيسيوم والسيلينيوم) والعناصر السامة (الرصاص والزئبق) في الشعر والأظافر من الأطفال الذين يعانون من التوحد،" التنوع تتبع العنصر بحوث، المجلد. 142، لا. 2، ص. 148-158، 2011. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
JB آدمز، T. Audhya، S. ماكدونو-وسائل وآخرون، "الوضع سمية الأطفال المصابين بالتوحد مقابل الأطفال neurotypical وبالتعاون مع التوحد شدة،" التنوع تتبع العنصر بحوث، المجلد. 151، لا. 2، ص. 171-180، 2013. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
PN الكسندروف، Y. تشاو، AI بوج، وآخرون، "الآثار المستمرة للحديد والألمنيوم على المرتبطة بالتوتر التعبير الجيني في الخلايا العصبية البشرية الأساسية،" مجلة مرض الزهايمر، المجلد. 8، لا. 2، ص. 117-215، 2005. عرض في جوجل الباحث العلمي
E. Bahbouth، B. Siwek، MC دي باو-جيليت، E. Sabbioni، وR. Bassleer، "آثار المعادن النزرة على خلايا سرطان الجلد الماوس B16 في الثقافة،" التنوع تتبع العنصر بحوث، المجلد. 36، لا. 2، ص. 191-201، 1993. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
RB هيرنانديز، M. فارينا، BP اسبوزيتو، NC-سوزا بينتو، F. باربوسا، وC. Suñol، "آليات العصبية التي يسببها المنغنيز في الثقافات العصبية الأولية: دور أنواع جديدة المنغنيز ونوع من الخلايا،" العلوم السمية، المجلد . 124، لا. 2، ص. 414-423، 2011. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
TK Rowles، C. WOMAC، GR براتون، وE. تيفاني-كاستيجليونى "التفاعل الرصاص والزنك في دبق نجمي الخلايا مثقف،" الاستقلابية أمراض الدماغ، المجلد. 4، لا. 3، ص. 187-201، 1989. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
JW فان Landingham، CA فيتش، وCW فينسون "، الزنك يمنع النبات النووي للورم القامع البروتين البروتين p53 ويحمي الخلايا العصبية البشرية المستزرعة من التي يسببها النحاس العصبية،" الطب NeuroMolecular، المجلد. 1، لا. 3، ص. 171-182، 2002. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
AR الأبيض، KJ برنهام، X. هوانغ وآخرون، "الحديد يمنع العصبية الناجمة عن النحاس التتبع والاختزال البيولوجية"، مجلة البيولوجية الكيمياء غير العضوية، المجلد. 9، لا. 3، ص. 269-280، 2004. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
K. يبشر وسميث، "العناصر النزرة الأساسية وغير الأساسية. وهناك طريقة لتحديد ما إذا كان عنصر ضروري أو غير الاساسيين في الأنسجة البشرية "أرشيف الصحة البيئية، المجلد. 17، لا. 6، ص. 881-890، 1968. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
S. Grabrucker، L. Jannetti، M. إيكرت وآخرون، "نقص الزنك dysregulates ومتشابك ProSAP / شانك سقالة ويمكن أن يساهم في اضطرابات طيف التوحد،" الدماغ، المجلد. 137، لا. 1، ص. 137-152، 2014. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
AM Grabrucker، B. فايدا، J. Bockmann، وTM Boeckers "Synaptogenesis من الخلايا العصبية قرن آمون في زراعة الخلايا الأولية،" خلية والأنسجة بحوث، المجلد. 338، لا. 3، ص. 333-341، 2009. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
C. Sindreu، À. بايز، X. التافاج، وJ. بيريز Clausell، "الزنك نقل-1 يركز على كثافة بعد المشبكي من نقاط الاشتباك العصبي الحصين،" الجزيئية الدماغ، المجلد. 7، لا. 1، والمادة 16، 2014. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
GM الأسقف، TN دانغ، R. Dringen، وروبنسون ريال، "تراكم الحديد غير ترانسفيرين-ملزمة الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، والخلايا الدبقية الصغيرة،" البحوث العصبية، المجلد. 19، لا. 3، ص. 443-451، 2011. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
RF ريغان، E. جاسبر، Y. قوه، وSS بانتر "تأثير المغنيسيوم على إصابة الخلايا العصبية المؤكسدة في المختبر،" مجلة الكيمياء العصبية، المجلد. 70، لا. 1، ص 77-85، 1998. عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
AR الأبيض، G. Multhaup، F. ماهر وآخرون، "اميلويد المرض البروتين السلائف الزهايمر ينظم سمية الناجم عن النحاس والاكسدة في الثقافات العصبية الأولية،" مجلة علم الأعصاب، المجلد. 19، لا. 21، ص 9170-9179، 1999. عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
NE Savaskan، AU بروير، M. Kühbacher وآخرون، "نقص السيلينيوم يزيد القابلية للالغلوتامات التي يسببها التحفيز الزائدة،" إن FASEB جورنال، المجلد. 17، لا. 1، ص. 112-114، 2003. عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
K. أوشيما وM. Kasuya، "التفاعلات بين كلوريد الزئبق والصوديوم سيلينات على المثقف المخ الفئران،" علم السموم الآداب، المجلد. 6، لا. 3، ص. 181-186، 1980. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
RA Bozym، F. Chimienti، LJ Giblin وآخرون، "أيونات الزنك مجاني خارج نطاق التركيز الضيق سامة إلى مجموعة متنوعة من الخلايا في المختبر،" البيولوجيا التجريبية والطب، المجلد. 235، لا. 6، ص. 741-750، 2010. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
B. وانغ وY. دو "، الكادميوم والتأثيرات السمية العصبية لها،" الطب مؤكسد والخلوية طول العمر، المجلد. 2013، معرف المقالة 898034، 12 صفحة، 2013. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
R. Ohtani-كانيكو، H. Tazawa، M. يوكوسوكا، M. يوشيدا، M. ساتو، وC. واتانابي، "آثار القمعية من الكادميوم على الخلايا العصبية والبروتينات المتضررة في تربيتها تطوير خلايا القشرية،" علم السموم، المجلد. 253، لا. 1-3، ص. 110-116، 2008. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
E. لوبيز، S. فيغيروا، MJ-Oset Gasque، والنائب غونزاليس، "موت الخلايا المبرمج ونخر: حدثين متميزة الناجمة عن الكادميوم في الخلايا العصبية القشرية في الثقافة،" المجلة البريطانية لعلم الصيدلة، المجلد. 138، لا. 5، ص. 901-911، 2003. عرض على الناشر · عرض في جوجل الباحث العلمي · عرض في المكبر
C. Gerspacher، U. Scheuber، G. Schiera، P. Proia، D. Gygax، وI. دي Liegro، "تأثير الكادميوم على خلايا المخ في الثقافة،" المجلة الدولية للطب الجزيئي، المجلد. 24، لا. 3، ص