عرض مشاركة واحدة
  #29  
قديم 11-27-2015, 07:27 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي رتباط الجزيئي المباشر بين الجينات مرشح التوحد rora وmir137 مرشح الفصام

 

http://www.nature.com/articles/srep0...P-631-20140211





ارتباط الجزيئي المباشر بين الجينات مرشح التوحد RORA وMIR137 مرشح الفصام


تم الاستلام: 10 ديسمبر 2013 قبلت: 20 يناير 2014 نشرت على الانترنت: 6 فبراير 2014

ملخص

على حد سواء في الآونة الأخيرة تم تحديد الريتينويك ذات الصلة حمض اليتيم جين مستقبلات ألفا (RORA) والرنا الميكروي MIR137 كما جينات مرشحة جديدة للاضطرابات العصبية والنفسية. RORA يشفر اليتيم مستقبلات النووي التي تعتمد على يجند الذي يعمل كمنظم النسخي ومير 137 هو الدماغ إثراء غير الترميز RNA الصغيرة التي تتفاعل مع النصوص الجيني للسيطرة على مستويات البروتين. وبالنظر إلى الأدلة المتزايدة لRORA في اضطرابات طيف التوحد (ASD) وMIR137 في الفصام والتوحد، ونحن التحقيق إذا كانت هناك علاقة بيولوجية وظيفية بين هذين الجينين. هنا، علينا أن نبرهن على مير 137 يستهدف 3'UTR من RORA بطريقة موقع محددة. كما نقوم بتوفير المزيد من الدعم لMIR137 كمرشح التوحد من خلال إظهار أن عددا كبيرا من الجينات التوحد تورط سابقا كما استهدفت مزعومة من قبل مير 137. هذا العمل يدعم دور MIR137 كمرشح ASD ويوضح ارتباط البيولوجي المباشر بين هذه الجينات المرشحة التوحد لا علاقة لها سابقا.

مقدمة

بترميز الريتينويك ذات الصلة حمض اليتيم مستقبلات ألفا (RORA) الجينات لمستقبلات اليتيم النووي التي تعتمد على يجند الذي يعمل كمنظم النسخي، وقد تم التعرف على الجينات مرشح رواية لاضطرابات طيف التوحد (ASD) 1. أدلة على تورط RORA في التوحد يأتي في المرتبة الأولى من الاكتشاف الذي تم تخفيض مستويات RORA في عينات أخذت من المرضى الذين يعانون من التوحد. في كل من خطوط الخلايا lymphoblast المستمدة من الأفراد المتضررين 2 وفي قشرة الفص الجبهي والمخيخ من أدمغة المصابين بالتوحد 1 تم تخفيض RORA مستويات البروتين مقارنة مع الضوابط الملائمة. وعلاوة على ذلك، يشارك أهداف النسخي من RORA في مسارات ضعف في ASD وبعض الجينات تنظيم مباشرة مثل NLGN1 وNTRK2 قد تورطت بشكل مستقل في ASD في جمعية الدراسات 5.
MicroRNAs (miRNAs) هي فئة من الرنا غير المكودة الصغيرة التي تتفاعل عبر مجاني الاقتران الأساسي لمنطقة 3 'غير مترجمة (3'UTR) النصوص الجيني للسيطرة على مستويات البروتينات في الخلايا. ناضجة miRNAs هي 21-25 النيوكليوتيدات في الطول، والتعرف على عزر الأساسية من 7-8 أزواج قاعدة في نصوص متعددة الجينات المستهدفة، مما أدى إلى تدهور إما نص أو قمع الترجمة 6. وحيد ميرنا يمكن تنظيم التعبير الآلاف من الأهداف. أدلة متزايدة تشير إلى تورط miRNAs في علم الوراثة الجزيئية لمجموعة من الاضطرابات العصبية والنفسية العصبية. وأظهر عدد من miRNAs اختلاف مستويات التعبير في عينات من الأفراد المصابين بالتوحد مقارنة مع الضوابط يقابل مما يشير إلى أن التقلبات من miRNAs يمكن أن تكون ذات صلة إلى الأسباب الجزيئية أو عواقب مرض التوحد.
الأهمية المتزايدة للRORA في ASD أدى بنا إلى التحقيق الذي miRNAs تنظيم تعبيرها. هنا، علينا أن نظهر وجود صلة مباشرة بين الجزيئية RORA ومير 137، مما يدل على أن هذا الدماغ المخصب الرنا الميكروي يستهدف 3'UTR من RORA بطريقة موقع محددة. وتبين لنا أيضا أن عددا كبيرا من الجينات التوحد تورط سابقا تنظم مزعومة من قبل مير 137. هذا العمل يدعم دور MIR137 كمرشح ASD ويوضح ارتباط البيولوجي المباشر بين هذه الجينات المرشحة التوحد لا علاقة لها سابقا.

النتائج

في 3'UTR من محضر RORA حددنا توقعت عدة miRNAs المخصب الدماغ لاستهداف نسخة RORA بما في ذلك مير 19ab، مير 34ac ومير 137 باستخدام TargetScan 6.2 خوارزمية 10. وكان لافتا أن هناك وتوقعت عدة مواقع (5) منفصلة ملزمة لمير 137 في RORA 3'UTR، مما يدل غاية من هذا كونه الهدف الحقيقي. وأعرب عن مير 137 غاية في الدماغ، من المهم للنضوج الخلايا العصبية والتنمية المشبك وأظهرت الربط المتكرر مع اضطرابات إدراكية أخرى مثل الفصام والإعاقة الذهنية 11، 12. وعلاوة على ذلك، MIR137 نفسها قد تورطت في الآونة الأخيرة ASD عن طريق التحليل التلوي أن يعتبر تعدد الأشكال النوكليوتيدات واحد (SNP) البيانات عبر خمسة اضطرابات. التوحد اضطراب طيف، اضطراب نقص الانتباه وفرط النشاط، واضطراب ثنائي القطب واضطراب اكتئابي، وانفصام الشخصية واستخدام أفضل نموذج لائقا وجدت الجمعية من SNP مير 137 مع كل من الفصام وASD 13. وعلى الرغم من التخصيب مير 137 التعبير في الدماغ، في المخيخ حيث أعلى RORA التعبير يمكن العثور عليه، مير 137 التعبير منخفض جدا 12. مجتمعة، تشير هذه البيانات ارتباط المفترض بين هذه الجينات المرشحة التوحد اثنين وفي هذه الدراسة نستخدم المقايسات الفنية لإثبات التنظيم المباشر من RORA التي كتبها مير 137.
حددنا خمسة توقع مواقع لمير 137 (M137-BS 1-5) والتي أظهرت عن الحفاظ على ارتفاع (ملزمة الشكل 1A-ب). لمعرفة ما إذا كانت هذه نشطة وظيفيا نحن المستنسخة ثلاث مناطق تحتوي على مواقع مفترضة خمسة مير 137 ملزمة ليكون بمثابة 3'UTR من اليراع مراسل luciferase المراسل الجين (الشكل 1C). لتأكيد آخر من الذاتية وtransfected مير 137، وتقييم حساسية النظام نحن أيضا ولدت مراسل التحكم الإيجابي (M137 التشيك) ​​التي لديها مواقع الربط إجماع متعددة مير 137 المصب من الجين مراسل luciferase المراسل. أدى شارك في ترنسفكأيشن مير-137 مع هذه السيطرة الإيجابية في القمع قوي للنشاط الجين مراسل (الشكل 2A). عندما قدمنا ​​كل إقليم من أقاليم RORA 3'UTR في النظام المراسل في الخلايا العصبية مثل الخلايا رأينا انخفض هذا النشاط مراسل الجينات، سواء في وجود الذاتية أو transfected شارك التعبير مير 137. أظهرت المنطقة 1 فقط القمع خفيف مقارنة مع الشاهد (التي تفتقر إلى المنطقة 3'UTR) وكان هذا التأثير لم يكن كبيرا (الشكل 2B). المناطق 2 و 3 أدى إلى انخفاض كبير في النشاط مراسل مقارنة مع الضوابط (الشكل 2C-د) وأظهرت أقوى الآثار عندما overexpressed مير 137 إلى جانب فحص مراسل (الشكل 2C-د). ومن المثير للاهتمام، أظهرت المنطقة 2 انخفاضات مماثلة في النشاط مع أو بدون مير 137 شاركت في التعبير، مما يشير إلى أن هذه المنطقة هي المستهدفة بكفاءة من خلال المستويات المحلية مير-137. وتشير هذه البيانات إلى أن مير 137 يتفاعل مع مواقع الربط في 3'UTR من RORA لتنظيم التعبير.
الشكل 1: المنطقة غير مترجمة وRORA 3 "(3'UTR) يحتوي على مواقع الربط مير 137 متعددة.
(أ) تم تحديد خمسة مواقع لإجماع مير 137 (BS1-5) ملزمة داخل 3'UTR من RORA باستخدام خوارزمية TargetScan 6.2. (ب) يتم إعطاء تسلسل ناضجة مير 137، الانحياز إلى تسلسل مجاني للخمسة وتوقع المواقع في RORA 3'UTR ملزمة. يشار مجاني قاعدة الاقتران بواسطة خطوط عمودية. لكل موقع ملزم يتم تسطير تسلسل الاعتراف الأساسية. (ج) لاختبار إذا ما كانت نشطة وظيفيا نحن المستنسخة ثلاث مناطق تحتوي على مواقع الربط ليكون بمثابة 3'UTR من اليراع مراسل luciferase المراسل الجين (في ناقلات pGL4.23، PROMEGA). المناطق 1 و 2 الواردة M137-BS 1 و 2 على التوالي، والمنطقة 3 الواردة M137-BS 3-5 (إحداثيات ترد شظايا المستنسخة في جزء منه). وتضمنت بنيات الحذف نفس شظية لكن تسلسل الاعتراف الأساسية (مسطرة في جزء ب) قد تم حذفه.

الصورة بالحجم الكامل

الشكل 2: يتم تنظيم المناطق من RORA 3'UTR التي كتبها مير 137 في خلايا تشبه الخلايا العصبية البشرية.
وأجريت فحوصات luciferase المراسل الصحفي في مثل الخلايا العصبية خط الخلية البشرية (SHSY5Y) لقياس قدرة مير 137 لتنظيم مناطق RORA 3'UTR. خلايا SHSY5Y تعبر عن أجريت الذاتية مير 137 والمقايسات مع أو بدون المشارك ترنسفكأيشن المعدلة وراثيا مير 137 (أ) مراسل السيطرة إيجابي بناء (M137 التشيك) ​​النشاط تم تخفيض بمهارة كتبها الذاتية مستويات مير 137، ولكن كان النشاط بقوة و انخفاض كبير عندما كان يشارك أعرب مير-137 مع المراسل. كانت السيطرة المخفوق (SCR التشيك) ​​تتأثر مير 137 التعبير. تم احتساب أهمية استخدام الطلاب اختبار t حيث *** P <0.001. (ب) لم يقل النشاط مراسل الجين بشكل كبير عندما كانت المنطقة 1 (M137-BS 1) الحالي. لم يلاحظ أي فرق في النشاط عندما كان بقوة شارك اعرب مير-137. (ج) عندما قدم المنطقة 2 (M137-BS 2)، تم تخفيض النشاط بقوة أكبر مع أو بدون مير 137 coexpression، ولكن انخفاض كبير في النشاط لوحظ فقط عندما overexpressed مير 137. كان (د) المنطقة 3 (M137-BS 3-5) وهي المنطقة الأكثر قمع بقوة. قمعت هذا البناء بشكل ملحوظ الذاتية مستويات مير 137 وoverexpression من مير 137 أسفر القمع أقوى بكثير من النشاط مقارنة مع جميع الظروف. تم حساب فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات في مناطق ب-د باستخدام اختبار ANOVA تليها بعد خاصة توكي الحساب. يشار أهمية التي كتبها * P <0.05، ** p <0.01 و*** P <0.001. وقد سجلت نتائج جميع حيث بلغ متوسط ​​+/- الانحراف المعياري من 2 مكررات البيولوجية.

الصورة بالحجم الكامل

للتحقق من صحة نتائجنا بشكل مستقل، ونحن اختبار نفس هذه التركيبات في خط الخلية البشرية أخرى؛ خلايا HEK293. هذه الخلايا هي نموذج يشيع استخدامها لاختبار النشاط من البروتينات وmiRNAs ولها فائدة إضافية للتعبير عن أي الذاتية مير 137 (لا تظهر البيانات). وبالتالي لا نستطيع أن نؤكد أن تنظيم شظايا مراسل ويرجع ذلك إلى وجود مير 137 (عن طريق التعاون ترنسفكأيشن مع التعبير البلازميد مير 137). بدأنا باختبار تنظيم دينا مراسل التحكم الإيجابي مع وبدون مير 137 التعبير التحوير. بدون مير 137 المشارك ترنسفكأيشن مراسل السيطرة الإيجابية لم تظهر أي اختلافات النشاط مقارنة لمراسل "سارعت" (SCR التشيك - الذي صمم أن لا تستجيب لمير 137)، مما يعكس عدم وجود الذاتية مير 137 في خلايا HEK293. عندما كان مير 137 شارك في transfected الإيجابية في النشاط مراسل السيطرة انخفض بشكل ملحوظ (من قبل ~ 90٪)، مما يدل على أن transfected مير 137 كان قادرا على تنظيم بشدة هذا النص (الشكل 3A). قمعت جميع المناطق RORA 3'UTR ثلاثة في هذا النموذج الخلية عندما كان يشارك اعرب مير-137. المناطق 2 و 3 أظهر فقط الآثار عندما مير 137 وقد شارك في transfected (الشكل 3C-د). على النقيض من ذلك، المنطقة 1 وقمع مماثل ميرس الذاتية وراثيا مير 137 (الشكل 3B)، ملمحا الى ان القمع وحظ عند هذه المنطقة غير موجودة قد لا يكون بسبب مير 137 ولكن سببه ميرس الذاتية الأخرى الموجودة في هذه الخلايا .
الرقم 3: مطلوب مير 137 التعبير عن تنظيم محدد من RORA 3'UTR.
وأجريت فحوصات luciferase المراسل في خط خلية الإنسان المستقلة، والمستمدة من الكلى الأنسجة (HEK293) هذا هو النموذج المستخدم على نطاق واسع لنشاط جينات الإنسان وmicroRNAs، ولكن هذا لا يمكن كشفها الذاتية مير 137 التعبير. (أ) لم يتأثر نشاط إيجابي بناء مراسل التحكم بمستويات مير الذاتية، ولكن كان النشاط بقوة وخفضت بشكل ملحوظ عندما كان مير 137 شارك في التعبير عنها. تم احتساب أهمية استخدام الطلاب اختبار t حيث *** P <0.001. (ب) كان النشاط مراسل الجينات قليلا، ولكن ليس بدرجة كبيرة عندما كانت المنطقة 1 (M137-BS 1) الحالي. إنتاج مشترك بين التعبير مير-137 تخفيض الحد الأدنى مزيد من النشاط الصحفي. (ج) مراسل بناء المنطقة 2 (M137-BS 2) انخفض بشكل كبير فقط عندما overexpressed مير 137. كان (د) المنطقة 3 (M137-BS 3-5) تتأثر مستويات مير الذاتية، ولكن قوي ولوحظ القمع كبير عندما كان مير 137 شارك في التعبير عنها. تم احتساب فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات في مناطق ب-د باستخدام اختبار ANOVA تليها بعد خاصة توكي الحساب. يشار أهمية التي كتبها * P <0.05، ** p <0.01 و*** P <0.001. وقد سجلت نتائج جميع حيث بلغ متوسط ​​+/- الانحراف المعياري من 2 مكررات البيولوجية.

الصورة بالحجم الكامل

لتحديد ما إذا كانت الآثار التنظيمية نتيجة لتفاعل معين بين مير 137 ومواقع الربط المتوقع في RORA 3'UTR، أنشأنا بنيات الحذف التي احتفظت المناطق 3'UTR، ولكنها تفتقر إلى موقع ملزم مير 137 (ق) . لم انقاذ المنطقة 1 النشاط حذف الموقع مير 137 ملزم (M137-BS 1؛ الشكل 4A)، مؤكدا أن التأثير المحتمل بسبب ميرس الآخرين والتفاعل مع المنطقة 1 - مثل مير 19ab وهو ما ثبت ل تنظيم RORA عبر التفاعل مع مواقع الربط في المنطقة 1 14 أو مير 34ac التي تم العثور على مواقع مفترضة أيضا في هذه المنطقة. عندما كانت المنطقة 2 الحالية، تم تخفيض النشاط مراسل بشكل ملحوظ. هذا التأثير ألغيت تماما بالحذف من 137 مير موقع ملزم (الشكل 4B)، مما يدل على تفاعل معين من مير 137 مع M137-BS 2. منطقة 3 تضمنت ثلاثة مواقع الربط مير 137 منفصلة (M137-BS 5/3 ) وكان المنطقة 3'UTR قمع بشدة. لتحديد أي من هذه المواقع كانت نشطة بيولوجيا أنشأنا سلسلة من التركيبات التي تحتوي على كل تركيبة من الحذف موقع ملزمة. نمط التعبير مراسل الجين عبر هذه بنيات مختلفة تشير إلى أن جميع المواقع ملزمة ثلاثة نشطة وظيفيا وتساهم بنفس القدر على قدرة مير 137 لتنظيم RORA (الشكل 4C). معا وتظهر هذه النتائج أن مير 137 يتفاعل بشكل خاص مع 4 مواقع الربط (M137-BS 2-5) ضمن RORA 3'UTR من أجل تعدل تعبيرها. وجود العديد من المواقع المستهدفة وظيفية في 3'UTR يدل على وجود دور مهم لمير 137 في تنظيم RORA.
الرقم 4: مير 137 ينظم 3'UTR من RORA بطريقة موقع معين.
وتمت مقارنة النشاط النسبي للبنيات مراسل تحمل المناطق RORA 3'UTR إلى بنيات الحذف أو متجه دون تسلسل 3'UTR كمجموعة تحكم. (أ) لوحظ انخفاض خفية من luciferase النشاط عند منطقة 1 موجودة (M137-BS 1) ولكن هذا لم يكن انقاذهم من قبل حذف موقع ملزم مير 137 (M137-BS 1 Δ)، مما يوحي بأن مير 137 هو غير مسئول عن هذا التأثير. (ب) تم تخفيض النشاط مراسل بشكل ملحوظ (من قبل ~ 20٪) عندما كانت المنطقة 2 الحالية (M137-BS 2)، وألغيت هذا الأثر تماما عندما تم حذف موقع ملزم مير 137 (M137-BS 2 Δ) (ج ) المنطقة 3 (M137-BS 3-5) يحتوي على ثلاثة توقع مواقع الربط، وكان بناء الأكثر تضررا بشكل كبير. (~ تخفيض 80٪ من النشاط تحكم luciferase المراسل). لتحديد أي من المواقع وظيفية، وأنشأنا سلسلة من بنيات الحذف تحتوي كل مجموعة من الحذف موقع ملزمة. حذف الفردي للمواقع الربط زيادة النشاط التي كتبها ~ 10٪ في كل حالة (M137-BS 3-5 Δ3، M137-BS 3-5 Δ4، M137-BS 3-5 Δ5)، وحذف أي مزيج من 2 من 3 مواقع زيادة النشاط بمبلغ إضافي ~ 20٪ (M137-BS 3-5 Δ3 / 4، M137-BS 3-5 Δ3 / 5، M137-BS 3-5 Δ4 / 5). حذف جميع مستويات التعبير ثلاثة مواقع ملزمة عاد إلى ~ 90٪ من النشاط تحكم luciferase المراسل (M137-BS 3-5 Δ3 / 4/5). تم احتساب فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات باستخدام اختبار ANOVA تليها بعد خاصة توكي الحساب. يشار أهمية التي كتبها * P <0.05، ** p <0.01 و*** P <0.001. لاحظ أنه في الجزء ج أهمية الفرق بين بناء المنطقة 3 (M137-BS 3-5) وتأثير حذف مواقع الربط الفردية على النحو التالي: M137-BS 3-5 Δ3 (P <0.05)، M137- BS 5/3 Δ4 (P <0.01)، M137-BS 3-5 Δ5 (P <0.001). لقد لخصت هذا في الشكل كما يجري كل ثلاث p <0.05 لوضوح. النتائج هي ممثل من اثنين على الأقل من تجارب مستقلة وذكرت بأنه متوسط ​​+/- الانحراف المعياري من 3 مكررات البيولوجية.

الصورة بالحجم الكامل

لمزيد من التحقيق في دور MIR137 كمرشح التوحد نحن مصممون إذا الجينات المستهدفة من قبل مير 137 كانوا هم أنفسهم متورطين في التوحد. من التوحد قاعدة المعرفة (AutismKB) 15 استخرجنا الجينات المتورطة في التوحد المتلازمات وغير المتلازمة (N = 3067). باستخدام TargetScan 6.2 خوارزمية 10 حددنا الأهداف المتوقعة للمير 137 (N = 1144). وعند مقارنة هذه القوائم الجينات اثنين لاحظنا تداخل واسع النطاق (N = 263) التي تم حسابها أن تكون كبيرة للغاية (ع <7.130e-23) (الجدول التكميلي S1). وأظهرت قائمة الجينات المتداخلة تمثيل الإفراط في مهمة لفئات GO بما في ذلك انتقال متشابك (adjP = 4.58e-07) والجهد الموجبة بوابات النشاط قناة (adjP = 7.36e-06)، وإثراء للبروتينات مترجمة إلى المشبك (adjP = 8.53e-07) ومقصورة محور عصبي (adjP = 4.25e-06) (انظر التكميلية الجدول S2 للحصول على نتائج GO الكاملة). وشملت هذه القائمة الجينات المتداخلة أيضا بعض المرشحين التوحد الأكثر التحقق جيدا مثل NRXN1، SHANK2، SCN2A وCACNA1C. وهكذا بالإضافة إلى تنظيم RORA، مير 137 قد تكون مسؤولة عن السيطرة على مستويات عددا من الأهداف التي تعمل في شبكات التوحد الجينات.

نقاش

أي إس دي إس هي مجموعة من العاهات الخلقية التي تتميز التفاعل ضعف الاجتماعي والتواصل، والسلوكيات النمطية المتكررة والمصالح مقيدة. أي إس دي إس يبرهن على وجود عنصر وراثي قوي لكن الأسس الجينية معقدة وارتبطت العديد من الجينات مع ASD قابلية حتى الآن 15، 16. يعكس التعقيد الجيني وراء ASD، وقد أظهرت العصبية التشريحية والوظيفية الدراسات انخفاض في العديد من الوظائف البيولوجية المختلفة مثل تمايز الخلايا العصبية والتصاق، والربط العصبي synaptogenesis، و، انتقال متشابك واللدونة.
قد تورطت عدد من مناطق الدماغ في أمراض الأعصاب من أي إس دي إس، ولكن المخيخ يمثل واحدة من أكثر المناطق المتضررة بدعم قوي في التوحد. وقد لوحظ في كثير من الأحيان تشوهات التشريحية في المخيخ عن طريق الرنين المغناطيسي (MRI) والدراسات النسيجية في مرضى التوحد 17، 18، 19. يتأثر تفعيل المخيخ قياس عبر وظيفية التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (fMRI) كما في الأفراد المصابين بالتوحد خلال المهام الحركية 20، 21. يتم تخفيض الخلايا العصبية (أجهزة الكمبيوتر) في المخيخ في عدد في أدمغة المصابين بالتوحد (على النحو الذي استعرضه Palmen وآخرون 22)، ولقد لوحظت تغيرات شكلية في الخلايا العصبية للدماغ نوى عميقة 23. مرضى التوحد عرض عادة خلل الأداء وغيرها من الظواهر التحكم في المحركات، ولكن تم أيضا تورط المخيخ في معالجة غير الحركية المتعلقة endophenotypes التوحد مثل اللغة والتعليم العالي بغية معالجة الاجتماعي أو العاطفي 17. وعلاوة على ذلك، فإن العديد من الجينات التي ترتبط بقوة إلى أي إس دي إس (مثل SHANK3، EN2 وMET) تلعب دورا هاما في تنمية دماغ والصيانة.
التحليل الجزيئي للالتعبير الجيني وعلامات جينية مرتبطة ASD حالة المصاب قد تورط RORA كما رواية جين مرشح التوحد. RORA غير منظم النسخي وكما تم ربط الجينات المستهدفة لالقابلية للASD ولها أدوار في مسارات المرتبطة ASD 3. وأعرب ومن المثير للاهتمام RORA عالية جدا في المخيخ وفقدان كامل للRORA في نماذج الماوس يؤدي إلى ضمور المخيخ واسعة النطاق والنمط الظاهري رنحي 24، 25. كشفت الفئران المعدلة وراثيا المشروط الذي خسر RORA التعبير في الخلايا العصبية في مراحل ما بعد الولادة (> P10) دورا هاما في استمرار بقاء أجهزة الكمبيوتر وصيانة الدولة التمايز ناضجة 26. وضعف القدرات الحركية بقوة في هذه الفئران، ويرجع ذلك إلى خسارة هائلة من الخلايا العصبية وانخفاض التورق والعمود الفقري كثافة الأشجار الجذعية في أجهزة الكمبيوتر على قيد الحياة 26. وقد لوحظ انخفاض التعبير RORA في القشرة وcerebelllum في أدمغة المصابين بالتوحد. ونظرا للدور مير 137 في استهداف وdownregulating RORA، فمن الممكن أن التعبير خارج الرحم أو غير مناسب مير-137 وبعدها RORA mysregulation، على سبيل المثال في المخيخ، يمكن أن يسهم في ASD.
مير-137، الدماغ المخصب ميرنا، وقد تبين أن من المهم في الخلايا العصبية نضوج والهجرة والاتصال من خلال تنظيم الجينات مثل KLF4 - عامل النسخ تشارك في نمو محور عصبي 12. وربطت دراسات عديدة بما في ذلك GWAS التحليل التلوي MIR137 مع الاضطرابات المعرفية مثل الفصام وآخرها ASD 27. كما تم تحديد الحذف متداخلة من موضع MIR137 في المرضى الذين يعانون من إعاقة ذهنية 12. وحددت دراسة GWAS على نطاق واسع علاقة قوية بين وثيقة SNP إلى MIR137 والفصام 27 ومتابعة لاحقة حتى اقترح أن SNP التي تم تحديدها كان مرتبطا مع انخفاض مير 137 مستويات التعبير في عينات من المرضى بعد الوفاة 28. ومن المثير للاهتمام، عرضت الجينات الأخرى التي تظهر بالاشتراك مع الفصام في هذه الدراسة GWAS ان يكون هدفا للمير 137 29، 30، مما يشير إلى أن مسارات متقاربة يمكن أن تسهم في هذا الاضطراب العصبية معقدة.
على الرغم من واضح سريريا، والفصام والتوحد يبدو أن أشاطركم بعض العوامل العصبية الخلوية و / أو وراثية. على سبيل المثال، والتغيرات في كثافة العمود الفقري شجيري قد تورطت في كل من الاضطرابات، مع فقدان العمود الفقري شجيري لاحظت في الفصام، ولكن زيادة أعداد العمود الفقري في عينات التوحد 31، 32. وقد تبين أن مستويات عالية من مير 137 ليكون حاضرا في المشبك، والتي تلعب دورا في السيطرة مباشرة شجيري النضج العمود الفقري وكثافة 33. ومن المثير للاهتمام، وجدناها هنا لتخصيب كبير من الجينات المترجمة synaptically التي كانت على حد سواء التوحد الجينات المرشحة وتوقع مير 137 أهداف، بما في ذلك SHANK3 - جين مهم لتشكيل المشبك وظيفة. وبالمثل، فإن مير 137 NRXN1 الجين المستهدف هو أحد عوامل الخطر لكلا التوحد وانفصام الشخصية وارتبط لSNP في هذا الجين مع التغيرات في جبهة حجم المادة البيضاء - وهو endophenotype المشترك لكلا اضطرابات 34.
هنا، علينا أن نظهر وجود صلة مباشرة بين الجزيئية اثنين من الجينات المرتبطة سابقا مع التوحد، RORA وMIR137. ويرتبط انخفاض RORA إلى الظواهر التوحد ومير 137 أعمال لقمع RORA، وبالتالي فمن الممكن أن الازدواجية أو الطفرات التي تنتج overexpression من مير 137 في المرضى، لا سيما في المخيخ، يمكن أن يؤدي إلى آثار مماثلة. الجمعيات ذكر سابقا بالإضافة إلى البيانات الوظيفية لدينا والإفراط في تمثيل التوحد الجينات المرشحة التي تستهدفها هذه مير توفر الدعم لMIR137 كمرشح ASD. الاختبار المباشر لمير 137 المتغيرات ومستويات التعبير في مرضى التوحد قد تسلط الضوء على مساهمة هذا الرنا الميكروي إلى النمط الظاهري معقدة من ASD وتكشف مسارات الوراثية المشتركة التي تكمن وراء الاضطرابات العصبية المعقدة مثل التوحد وانفصام الشخصية.

طرق

استنساخ

تم إنشاء تعبير بناء مير 137 عن طريق تضخيم المنطقة ترميز النسخة الأولية من الحمض النووي الجيني البشري باستخدام بادئات التالية: تطلعية 5'-TTACTACCGGTGAGCAGCAAGAGTTCTGGTG-3 "و العكسية 5'-AGTTACGAATTCGAAAGTGCTACCTTGGCAACCAC-3". تم استنساخ جزء تضخيم في ناقلات pLKO.1 باستخدام AgeI وEcoRI، وكان يستخدم التسلسل المباشر لتأكيد وجود تسلسل المرجوة. وأكد تعبير عن السلائف وتنضج مير 137 عبر QPCR (لا تظهر البيانات).
تم إنشاء إيجابي بناء مراسل التحكم (M137 التشيك) ​​التي تحتوي على مواقع 4 متتابعة مير 137 ملزمة المصب مباشرة لمراسل luciferase المراسل اليراع في ناقلات pGL4.23 التعبير (PROMEGA) للتحقق من حساسية مقايسة. تم إنشاؤه في بناء وفقا لبروتوكولات نشرت سابقا 35. لفترة وجيزة، تم تصميم الدوبلكس بنسبة ضئيلة لاحتواء اثنين من ذات حساسية عالية مير 137 مواقع الربط مفصولة فاصل 6 النوكليوتيدات. عندما صلب، والدوبلكس تشكل يتدلى متوافقة مع تقييد نوكلياز داخلية KflI لتمكين الإدراج الاتجاه إلى ناقلات الوجهة. منذ pGL4.23 الأصلي لا تحتوي على أي تقييد مواقع KflI نحن المهندسة هذه النواقل إضافة موقع واحد KflI التقييد في 3'UTR من الجينات luciferase المراسل اليراع. استخدمت oligos المجانية التالية: تحسس: 5'-GACCCCTACGCGTATTAAAGCAATAAATATTCCTACGCGTATTAAAGCAA TAAGG-3 "، العقاقير: 5'-GTCCCTTATTGCTTTAATACGCGTAGGAATATTTATTGCTTTAATACGCG TAGGG-3". تم ligated oligos صلب في الموقع KflI وبسبب حجم جزء صغير وتسلسل غير المتناوب، نسخ متعددة من لجنة التحقيق (تمثل 2 مواقع الربط لكل منهما) يمكن إدراجها في ناقلات. نحن فحص عدد من البلازميدات الناتجة عن طريق التسلسل المباشر واختيار التركيبة التي تحتوي على أربعة مير 137 مواقع متتابعة ملزمة لاستخدامها سيطرتنا بناء إيجابي (M137 التشيك). باستخدام نفس التقنية، ومراقبة سلبية "سارعت" تم إنشاء ملزم مراسل موقع بناء (SCR التشيك) ​​باستخدام oligos التالية: تحسس: 5'-GACCCTCCTCTGTCACTACATCTTAGAATATTCTCCTCTGTCACTACATC TTAGAGG-3 "، العقاقير: 5'-GTCCCTCTAAGATGTAGTGACAGAGGAGAATATTCTAAGATGTAGTGACA GAGGAGG-3". يحتوي هذا البناء تكوين قاعدة مشابهة جدا ومراقبة إيجابية لكن تم تعديلا على قواعد لضمان عدم مواقع الربط مير 137 لا تزال قائمة.
تم استنساخ المناطق RORA 3'UTR في ناقلات pGL4.23 التعبير (PROMEGA) المصب من اليراع مراسل luciferase المراسل الجينات باستخدام بادئات من الجدول 1 وتقييد مواقع XbaI / FseI. تم إنشاء بنيات الحذف باستخدام عدة QuickChange الموقع الموجه الطفرات (Stratagene) حسب تعليمات الشركة الصانعة مع الاشعال المفصلة في الجدول 2. وقد استخدم التسلسل المباشر لتأكيد وجود الحذف المطلوب.
الجدول 1: الاستنساخ من المناطق RORA 3'UTR
الجدول 2: الموقع موجه الطفرات الاشعال المستخدمة لإنشاء بنيات الحذف
ثقافة الخلية وترنسفكأيشن

ما نمت الخلايا HEK293 في Dulbecco لتعديل النسور المتوسطة (DMEM) (إينفيتروجن) والخلايا SH-SY5Y في DMEM: وسائل الإعلام F12 (إينفيتروجن). واستكملت وسائل الإعلام مع 10٪ من الجنين العجل المصل (سيغما)، 2 مم L-الجلوتامين (سيغما) و 2 ملي البنسلين / الستبرتوميسين (سيغما). وقد نمت الخلايا عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2. أجريت Transfections الخلايا SHSY5Y وHEK293 باستخدام GeneJuice® (Novagen)، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
فحص luciferase المراسل

كانت المصنفة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 2.5 × 10 4 خلايا لكل سم 2 (60-70٪ confluency)، 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن. ويبني مراسل شارك transfected-في الخلايا البشرية (SHSY5Y أو HEK293) جنبا إلى جنب مع Renilla مراسل الجين (ااا-TK) للتطبيع الداخلي. 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن اليراع تم قياس الأنشطة luciferase المراسل و luciferase Renilla حسب تعليمات الشركة الصانعة (المزدوج luciferase المراسل مقايسة مراسل النظام، PROMEGA). وأجريت التجارب luciferase المراسل في وجود أو عدم وجود المشارك ترنسفكأيشن مع overexpression بناء مير 137.
تحليل الجينات الأنطولوجيا

تم إجراء الجينات علم الوجود (GO) التحليل باستخدام برنامج Webgestalt (http://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/). تم تحديد أكثر من تمثيل فئات الأنطولوجيا الجينات عن طريق اختبار فوق الهندسي باستخدام Benjamini وهوشبرج متعددة تصحيح الاختبار 36.

المراجع

  • 1.
    نغوين، A.، راوخ، TA، فايفر، GP & هو جين تاو، VW العالمية التنميط مثيلة من خطوط الخلايا lymphoblastoid يكشف المساهمات جينية لاضطرابات طيف التوحد والجينات رواية مرشح التوحد، RORA، التي يتم تخفيض في الدماغ التوحد البروتين المنتج. FASEB J 24، 3036-3051، 10.1096 / fj.10-154484 (2010).
  • 2.
    هو جين تاو، VW. وآخرون يفرق التنميط الجيني التعبير التوحد حالة على الضوابط والمتغيرات المظهرية لاضطرابات طيف التوحد: دليل على ضعف إيقاع الساعة البيولوجية في التوحد الشديد. التوحد الدقة 2، 78-97، 10.1002 / aur.73 (2009).
  • 3.
    Sarachana، T. & هو جين تاو، VW تحديد الجينوم على نطاق الأهداف النسخي من RORA يكشف التنظيم المباشر للجينات متعددة مرتبطة مع اضطراب طيف التوحد. مول التوحد 4، 14، 10،1186 / 2040-2392-4-14 (2013).
  • 4.
    Ylisaukko-أوجا، T. وآخرون تحليل أربع جينات neuroligin كمرشحين للتوحد. اليورو J همهمة جينيه 13، 1285-1292، 10.1038 / sj.ejhg.5201474 (2005).
  • 5.
    كوريا، CT آخرون زيادة مستويات BDNF وتكوين الجمعيات الجين NTRK2 تشير إلى اختلال BDNF / TrkB يشير في التوحد. جينات الدماغ Behav 9، 841-848، 10.1111 / j.1601-183X.2010.00627.x (2010).
  • 6.
    بيلاي، RS، باتاشاريا، SN وFilipowicz، W. قمع تخليق البروتين من قبل miRNAs: كم عدد الآليات؟ اتجاهات خلية بيول 17، 118-126، 10.1016 / j.tcb.2006.12.007 (2007).
  • 7.
    Sarachana، T.، تشو، R.، تشن، G.، منجي، HK & هو جين تاو، VW التحقيق في شبكات الجينات التنظيمية بعد النسخي مرتبطة باضطرابات طيف التوحد من قبل الرنا الميكروي التنميط التعبير من خطوط الخلايا lymphoblastoid. الجينوم ميد 2، 23، 10.1186 / gm144 (2010).
  • 8.
    أبو Elneel، K. وآخرون. ديسريغولاتيون غير المتجانسة من microRNAs عبر طيف التوحد. Neurogenetics 9، 153-161، 10.1007 / s10048-008-0133-5 (2008).
  • 9.
    Talebizadeh، Z.، بتلر، MG & تيودورو، MF جدوى وأهمية فحص خطوط الخلايا lymphoblastoid لدراسة دور من microRNAs في التوحد. التوحد الدقة 1، 240-250، 10.1002 / aur.33 (2008).
  • 10.
    لويس، BP، بورج، CB & بارتل، DP الاقتران البذور المحفوظة، وغالبا ما يحيط بها adenosines، يشير إلى أن الآلاف من الجينات البشرية هي أهداف الرنا الميكروي. سيل 120، 15-20، 10.1016 / j.cell.2004.12.035 (2005).
  • 11.
    أخضر، MJ آخرون على نطاق الجينوم بدعم MIR137 البديل وأعراض سلبية حادة التنبؤ الانتماء إلى سلالة المعرفي ضعف الفصام. مول الطب النفسي 18، 774-780، 10.1038 / mp.2012.84 (2013).
  • 12.
    فري، MH آخرون. كروموسوم ترتبط 1p21.3 microdeletions تضم DPYD وMIR137 ذوي الإعاقة الفكرية. J ميد جينيه 48، 810-818، 10.1136 / jmedgenet-2011-100294 (2011).
  • 13.
    عبر اضطراب المجموعة من الأمراض النفسية الجينوم الكونسورتيوم. تحديد مواضع الخطر مع الآثار المشتركة على خمسة الاضطرابات النفسية الكبرى: تحليل الجينوم على نطاق. لانسيت 381، 1371-1379، 10.1016 / s0140-6736 (12) 62129-1 (2013 ).
  • 14.
    Baumjohann، D. آخرون الكتلة الرنا الميكروي مير 17 ~ 92 يعزز مرفأ تونس المالي تمايز الخلايا ويقمع-فرعية غير ملائمة التعبير الجيني. الطبيعة المناعة 14، 840-848، 10.1038 / ni.2642 (2013).
  • 15.
    شو، LM وآخرون. AutismKB: على المعرفة القائمة على الأدلة من علم الوراثة التوحد. الأحماض النووية بحوث 40، D1016-1022، 10.1093 / النار / gkr1145 (2012).
  • 16.
    وون، H.، ماه، W. & كيم، E. التوحد أسباب اضطراب طيف، آليات وعلاجات: التركيز على نقاط الاشتباك العصبي العصبية. الجبهة مول Neurosci 6، 19، 10،3389 / fnmol.2013.00019 (2013).
  • 17.
    فاطمي، SH. وآخرون رقة توافق: دور المرضية من المخيخ في التوحد. المخيخ 11، 777-807، 10.1007 / s12311-012-0355-9 (2012).
  • 18.
    ويتني، ER، كمبر، TL، بومان، ML، Rosene، DL & بلات، GJ يتم تخفيض الخلايا العصبية في مخيخي جزء من السكان من أدمغة المصابين بالتوحد: تجربة stereological باستخدام calbindin-D28k. المخيخ 7، 406-416، 10.1007 / s12311- 008-0043-ص (2008).
  • 19.
    بيلي، A. وآخرون دراسة إكلينيكية للمرض التوحد. الدماغ 121 (حزب العمال 5)، 889-905 (1998).
  • 20.
    Mostofsky، SH آخرون الربط انخفاض والنشاط الدماغي في مرض التوحد خلال مهمة محرك الأداء. الدماغ 132، 2413-2425، 10.1093 / الدماغ / awp088 (2009).
  • 21.
    ألين، G. & Courchesne، E. الآثار التفاضلية من خلل المخيخ التنموي على الوظائف الإدراكية والحركية في المخيخ: دراسة الرنين المغناطيسي الوظيفي لمرض التوحد. آم J الطب النفسي 160، 262-273 (2003).
  • 22.
    Palmen، SJ، فان Engeland، H.، هوف، PR & شميتز، C. النتائج عصبية مرضية في التوحد. الدماغ 127، 2572-2583، 10.1093 / الدماغ / awh287 (2004).
  • 23.
    كمبر، TL & بومان، M. أمراض الأعصاب التوحد الطفولي. J Neuropathol ااستعمال Exp Neurol 57، 645-652 (1998).
  • 24.
    Doulazmi، M. وآخرون. دراسة مقارنة للخلايا العصبية في اثنين من الجينات RORalpha فئرانا معدلة وراثيا: يترنح وRORalpha (- / -). الدماغ بحوث الدماغ ديف الدقة 127، 165-174 (2001).
  • 25.
    Sidman، RL، لين، PW & ديكي، MM المترنح، طفرة جديدة في الماوس التي تؤثر على المخيخ. العلوم 137، 610-612 (1962).
  • 26.
    تشن، XR آخرون تتطلب الخلايا العصبية الناضجة والريتينويك ذات الصلة حمض اليتيم مستقبلات ألفا (RORalpha) للحفاظ على تسلق الألياف أحادية تعصيب والكبار الخصائص الأخرى. J Neurosci 33، 9546-9562، 10.1523 / JNEUROSCI.2977-12.2013 ( 2013).
  • 27.
    الفصام النفسي الجينوم على نطاق الرابطة دراسة (GWAS) الكونسورتيوم. وتحدد الدراسة رابطة الجينوم على نطاق خمسة الفصام مواضع جديدة. نات جينيه 43، 969-976، 10.1038 / ng.940 (2011).
  • 28.
    Guella، I. آخرون تحليل مير 137 التعبير وrs1625579 في ظهراني جانبي قشرة الفص الجبهي. J Psychiatr الدقة 47، 1215-1221، 10.1016 / j.jpsychires.2013.05.021 (2013).
  • 29.
    كوون، E.، وانغ، W. & تساي، LH التحقق من الجينات المرتبطة الفصام CSMD1، C10orf26، CACNA1C وTCF4 كما مير 137 أهداف. مول الطب النفسي 18، 11-12، 10.1038 / mp.2011.170 (2011).
  • 30.
    كيم، AH آخرون التحقق التجريبي من الفصام مرشح ZNF804A الجينات كهدف لهائل سعيد أنعم-مير 137. Schizophr الدقة 141، 60-64، 10.1016 / j.schres.2012.06.038 (2012).
  • 31.
    Hutsler، JJ & تشانغ، H. زيادة الكثافة العمود الفقري شجيري على الخلايا العصبية الإسقاط القشرية في اضطرابات طيف التوحد. الدماغ الدقة 1309، 83-94، 10.1016 / j.brainres.2009.09.120 (2010).
  • 32.
    Glantz، LA & لويس، DA انخفاض كثافة العمود الفقري شجيري على الفص الجبهي الخلايا العصبية الهرمية القشرية في الفصام. قوس الجنرال الطب النفسي 57، 65-73 (2000).
  • 33.
    SMRT، RD وآخرون. الرنا الميكروي مير 137 ينظم نضوج الخلايا العصبية من خلال استهداف بتحول يغاز العقل قنبلة-1. الخلايا الجذعية 28، 1060-1070، 10.1002 / stem.431 (2010).
  • 34.
    Voineskos، AN. وآخرون Neurexin-1 والفص الجبهي المادة البيضاء: النمط الظاهري وسيطة تداخل لاضطرابات الفصام والتوحد. بلوس واحد 6، e20982، 10.1371 / journal.pone.0020982 (2011).
  • 35.
    Kluiver، J. آخرون جيل السريع من الإسفنج الرنا الميكروي لتثبيط الرنا الميكروي. بلوس واحد 7، e29275، 10.1371 / journal.pone.0029275 (2012).
  • 36.
    تشانغ، B.، كيروف، S. & Snoddy، J. WebGestalt: نظام متكامل لاستكشاف مجموعات الجينات في سياقات البيولوجية المختلفة. الأحماض النووية بحوث 33، W741-748 (2005).

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل ماري كوري منحة التكامل الوظيفي (CIG) منحت لSCV

معلومات الكاتب

الانتماءات

  • اللغة وعلم الوراثة الإدارة، معهد ماكس بلانك لعلم اللغة النفسي، Wundtlaan 1، 6525 XD، نيميغن، وهولندا

    • باولو Devanna
    • وسونيا C. فيرنيس
  • معهد Donders عن وظيفة الدماغ والسلوك، جامعة رادبود، 6525 EN، نيميغن، وهولندا

    • سونيا C. فيرنيس
مساهمات

PD تصور تصميم الدراسة، التي نفذت العمل التجريبي والتحليلي وصياغة المخطوط. SCV تصور تصميم الدراسة، يقوم العمل التحليلي وصياغة المخطوط.
تضارب المصالح

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.
المؤلف المقابلة

المراسلات إلى سونيا C. فيرنيس.

معلومات تكميلية

وثائق وورد

ملفات اكسل

  • 1. معلومات تكميلية

    التكميلية S1 الجدول. قائمة الأهداف مير 137 حددت أيضا الجينات المرشحة التوحد.
  • 2. معلومات تكميلية

    التكميلي S2 الجدول. كامل جين علم الوجود (GO) تحليل الجينات من الجدول S1.

تعليقات

عن طريق تقديم التعليق فإنك توافق على الالتزام من قبل لدينا شروط وتعليمات مجتمع. إذا كنت تجد شيئا المسيئة أو التي لا يتوافق مع شروطنا أو المبادئ التوجيهية إرضاء العلم أنها صورة غير ملائمة.

هذا العمل مرخص تحت رخصة التشارك الإبداعي العزو غير التجارية المشاركة بالمثل 3.0. لعرض نسخة من هذا الترخيص، زيارة http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس