في 3'UTR من محضر RORA حددنا توقعت عدة miRNAs المخصب الدماغ لاستهداف نسخة RORA بما في ذلك مير 19ab، مير 34ac ومير 137 باستخدام TargetScan 6.2 خوارزمية
10. وكان لافتا أن هناك وتوقعت عدة مواقع (5) منفصلة ملزمة لمير 137 في
RORA 3'UTR، مما يدل غاية من هذا كونه الهدف الحقيقي. وأعرب عن مير 137 غاية في الدماغ، من المهم للنضوج الخلايا العصبية والتنمية المشبك وأظهرت الربط المتكرر مع اضطرابات إدراكية أخرى مثل الفصام والإعاقة الذهنية
11، 12. وعلاوة على ذلك، MIR137 نفسها قد تورطت في الآونة الأخيرة ASD عن طريق التحليل التلوي أن يعتبر تعدد الأشكال النوكليوتيدات واحد (SNP) البيانات عبر خمسة اضطرابات. التوحد اضطراب طيف، اضطراب نقص الانتباه وفرط النشاط، واضطراب ثنائي القطب واضطراب اكتئابي، وانفصام الشخصية واستخدام أفضل نموذج لائقا وجدت الجمعية من SNP مير 137 مع كل من الفصام وASD
13. وعلى الرغم من التخصيب مير 137 التعبير في الدماغ، في المخيخ حيث أعلى RORA التعبير يمكن العثور عليه، مير 137 التعبير منخفض جدا
12. مجتمعة، تشير هذه البيانات ارتباط المفترض بين هذه الجينات المرشحة التوحد اثنين وفي هذه الدراسة نستخدم المقايسات الفنية لإثبات التنظيم المباشر من RORA التي كتبها مير 137.
حددنا خمسة توقع مواقع لمير 137 (M137-BS 1-5) والتي أظهرت عن الحفاظ على ارتفاع (ملزمة
الشكل 1A-ب). لمعرفة ما إذا كانت هذه نشطة وظيفيا نحن المستنسخة ثلاث مناطق تحتوي على مواقع مفترضة خمسة مير 137 ملزمة ليكون بمثابة 3'UTR من اليراع مراسل luciferase المراسل الجين
(الشكل 1C). لتأكيد آخر من الذاتية وtransfected مير 137، وتقييم حساسية النظام نحن أيضا ولدت مراسل التحكم الإيجابي (M137 التشيك) التي لديها مواقع الربط إجماع متعددة مير 137 المصب من الجين مراسل luciferase المراسل. أدى شارك في ترنسفكأيشن مير-137 مع هذه السيطرة الإيجابية في القمع قوي للنشاط الجين مراسل
(الشكل 2A). عندما قدمنا كل إقليم من أقاليم RORA 3'UTR في النظام المراسل في الخلايا العصبية مثل الخلايا رأينا انخفض هذا النشاط مراسل الجينات، سواء في وجود الذاتية أو transfected شارك التعبير مير 137. أظهرت المنطقة 1 فقط القمع خفيف مقارنة مع الشاهد (التي تفتقر إلى المنطقة 3'UTR) وكان هذا التأثير لم يكن كبيرا
(الشكل 2B). المناطق 2 و 3 أدى إلى انخفاض كبير في النشاط مراسل مقارنة مع الضوابط
(الشكل 2C-د) وأظهرت أقوى الآثار عندما overexpressed مير 137 إلى جانب فحص مراسل
(الشكل 2C-د). ومن المثير للاهتمام، أظهرت المنطقة 2 انخفاضات مماثلة في النشاط مع أو بدون مير 137 شاركت في التعبير، مما يشير إلى أن هذه المنطقة هي المستهدفة بكفاءة من خلال المستويات المحلية مير-137. وتشير هذه البيانات إلى أن مير 137 يتفاعل مع مواقع الربط في 3'UTR من RORA لتنظيم التعبير.
الشكل 1: المنطقة غير مترجمة وRORA 3 "(3'UTR) يحتوي على مواقع الربط مير 137 متعددة. (أ) تم تحديد خمسة مواقع لإجماع مير 137 (BS1-5) ملزمة داخل 3'UTR من RORA باستخدام خوارزمية TargetScan 6.2. (ب) يتم إعطاء تسلسل ناضجة مير 137، الانحياز إلى تسلسل مجاني للخمسة وتوقع المواقع في RORA 3'UTR ملزمة. يشار مجاني قاعدة الاقتران بواسطة خطوط عمودية. لكل موقع ملزم يتم تسطير تسلسل الاعتراف الأساسية. (ج) لاختبار إذا ما كانت نشطة وظيفيا نحن المستنسخة ثلاث مناطق تحتوي على مواقع الربط ليكون بمثابة 3'UTR من اليراع مراسل luciferase المراسل الجين (في ناقلات pGL4.23، PROMEGA). المناطق 1 و 2 الواردة M137-BS 1 و 2 على التوالي، والمنطقة 3 الواردة M137-BS 3-5 (إحداثيات ترد شظايا المستنسخة في جزء منه). وتضمنت بنيات الحذف نفس شظية لكن تسلسل الاعتراف الأساسية (مسطرة في جزء ب) قد تم حذفه.
الصورة بالحجم الكامل
الشكل 2: يتم تنظيم المناطق من RORA 3'UTR التي كتبها مير 137 في خلايا تشبه الخلايا العصبية البشرية. وأجريت فحوصات luciferase المراسل الصحفي في مثل الخلايا العصبية خط الخلية البشرية (SHSY5Y) لقياس قدرة مير 137 لتنظيم مناطق RORA 3'UTR. خلايا SHSY5Y تعبر عن أجريت الذاتية مير 137 والمقايسات مع أو بدون المشارك ترنسفكأيشن المعدلة وراثيا مير 137 (أ) مراسل السيطرة إيجابي بناء (M137 التشيك) النشاط تم تخفيض بمهارة كتبها الذاتية مستويات مير 137، ولكن كان النشاط بقوة و انخفاض كبير عندما كان يشارك أعرب مير-137 مع المراسل. كانت السيطرة المخفوق (SCR التشيك) تتأثر مير 137 التعبير. تم احتساب أهمية استخدام الطلاب اختبار t حيث *** P <0.001. (ب) لم يقل النشاط مراسل الجين بشكل كبير عندما كانت المنطقة 1 (M137-BS 1) الحالي. لم يلاحظ أي فرق في النشاط عندما كان بقوة شارك اعرب مير-137. (ج) عندما قدم المنطقة 2 (M137-BS 2)، تم تخفيض النشاط بقوة أكبر مع أو بدون مير 137 coexpression، ولكن انخفاض كبير في النشاط لوحظ فقط عندما overexpressed مير 137. كان (د) المنطقة 3 (M137-BS 3-5) وهي المنطقة الأكثر قمع بقوة. قمعت هذا البناء بشكل ملحوظ الذاتية مستويات مير 137 وoverexpression من مير 137 أسفر القمع أقوى بكثير من النشاط مقارنة مع جميع الظروف. تم حساب فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات في مناطق ب-د باستخدام اختبار ANOVA تليها بعد خاصة توكي الحساب. يشار أهمية التي كتبها * P <0.05، ** p <0.01 و*** P <0.001. وقد سجلت نتائج جميع حيث بلغ متوسط +/- الانحراف المعياري من 2 مكررات البيولوجية.
الصورة بالحجم الكامل
للتحقق من صحة نتائجنا بشكل مستقل، ونحن اختبار نفس هذه التركيبات في خط الخلية البشرية أخرى؛ خلايا HEK293. هذه الخلايا هي نموذج يشيع استخدامها لاختبار النشاط من البروتينات وmiRNAs ولها فائدة إضافية للتعبير عن أي الذاتية مير 137 (لا تظهر البيانات). وبالتالي لا نستطيع أن نؤكد أن تنظيم شظايا مراسل ويرجع ذلك إلى وجود مير 137 (عن طريق التعاون ترنسفكأيشن مع التعبير البلازميد مير 137). بدأنا باختبار تنظيم دينا مراسل التحكم الإيجابي مع وبدون مير 137 التعبير التحوير. بدون مير 137 المشارك ترنسفكأيشن مراسل السيطرة الإيجابية لم تظهر أي اختلافات النشاط مقارنة لمراسل "سارعت" (SCR التشيك - الذي صمم أن لا تستجيب لمير 137)، مما يعكس عدم وجود الذاتية مير 137 في خلايا HEK293. عندما كان مير 137 شارك في transfected الإيجابية في النشاط مراسل السيطرة انخفض بشكل ملحوظ (من قبل ~ 90٪)، مما يدل على أن transfected مير 137 كان قادرا على تنظيم بشدة هذا النص
(الشكل 3A). قمعت جميع المناطق RORA 3'UTR ثلاثة في هذا النموذج الخلية عندما كان يشارك اعرب مير-137. المناطق 2 و 3 أظهر فقط الآثار عندما مير 137 وقد شارك في transfected
(الشكل 3C-د). على النقيض من ذلك، المنطقة 1 وقمع مماثل ميرس الذاتية وراثيا مير 137
(الشكل 3B)، ملمحا الى ان القمع وحظ عند هذه المنطقة غير موجودة قد لا يكون بسبب مير 137 ولكن سببه ميرس الذاتية الأخرى الموجودة في هذه الخلايا .
الرقم 3: مطلوب مير 137 التعبير عن تنظيم محدد من RORA 3'UTR. وأجريت فحوصات luciferase المراسل في خط خلية الإنسان المستقلة، والمستمدة من الكلى الأنسجة (HEK293) هذا هو النموذج المستخدم على نطاق واسع لنشاط جينات الإنسان وmicroRNAs، ولكن هذا لا يمكن كشفها الذاتية مير 137 التعبير. (أ) لم يتأثر نشاط إيجابي بناء مراسل التحكم بمستويات مير الذاتية، ولكن كان النشاط بقوة وخفضت بشكل ملحوظ عندما كان مير 137 شارك في التعبير عنها. تم احتساب أهمية استخدام الطلاب اختبار t حيث *** P <0.001. (ب) كان النشاط مراسل الجينات قليلا، ولكن ليس بدرجة كبيرة عندما كانت المنطقة 1 (M137-BS 1) الحالي. إنتاج مشترك بين التعبير مير-137 تخفيض الحد الأدنى مزيد من النشاط الصحفي. (ج) مراسل بناء المنطقة 2 (M137-BS 2) انخفض بشكل كبير فقط عندما overexpressed مير 137. كان (د) المنطقة 3 (M137-BS 3-5) تتأثر مستويات مير الذاتية، ولكن قوي ولوحظ القمع كبير عندما كان مير 137 شارك في التعبير عنها. تم احتساب فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات في مناطق ب-د باستخدام اختبار ANOVA تليها بعد خاصة توكي الحساب. يشار أهمية التي كتبها * P <0.05، ** p <0.01 و*** P <0.001. وقد سجلت نتائج جميع حيث بلغ متوسط +/- الانحراف المعياري من 2 مكررات البيولوجية.
الصورة بالحجم الكامل
لتحديد ما إذا كانت الآثار التنظيمية نتيجة لتفاعل معين بين مير 137 ومواقع الربط المتوقع في RORA 3'UTR، أنشأنا بنيات الحذف التي احتفظت المناطق 3'UTR، ولكنها تفتقر إلى موقع ملزم مير 137 (ق) . لم انقاذ المنطقة 1 النشاط حذف الموقع مير 137 ملزم (M137-BS 1؛
الشكل 4A)، مؤكدا أن التأثير المحتمل بسبب ميرس الآخرين والتفاعل مع المنطقة 1 - مثل مير 19ab وهو ما ثبت ل تنظيم RORA عبر التفاعل مع مواقع الربط في المنطقة 1
14 أو مير 34ac التي تم العثور على مواقع مفترضة أيضا في هذه المنطقة. عندما كانت المنطقة 2 الحالية، تم تخفيض النشاط مراسل بشكل ملحوظ. هذا التأثير ألغيت تماما بالحذف من 137 مير موقع ملزم
(الشكل 4B)، مما يدل على تفاعل معين من مير 137 مع M137-BS 2. منطقة 3 تضمنت ثلاثة مواقع الربط مير 137 منفصلة (M137-BS 5/3 ) وكان المنطقة 3'UTR قمع بشدة. لتحديد أي من هذه المواقع كانت نشطة بيولوجيا أنشأنا سلسلة من التركيبات التي تحتوي على كل تركيبة من الحذف موقع ملزمة. نمط التعبير مراسل الجين عبر هذه بنيات مختلفة تشير إلى أن جميع المواقع ملزمة ثلاثة نشطة وظيفيا وتساهم بنفس القدر على قدرة مير 137 لتنظيم RORA
(الشكل 4C). معا وتظهر هذه النتائج أن مير 137 يتفاعل بشكل خاص مع 4 مواقع الربط (M137-BS 2-5) ضمن RORA 3'UTR من أجل تعدل تعبيرها. وجود العديد من المواقع المستهدفة وظيفية في 3'UTR يدل على وجود دور مهم لمير 137 في تنظيم RORA.
الرقم 4: مير 137 ينظم 3'UTR من RORA بطريقة موقع معين. وتمت مقارنة النشاط النسبي للبنيات مراسل تحمل المناطق RORA 3'UTR إلى بنيات الحذف أو متجه دون تسلسل 3'UTR كمجموعة تحكم. (أ) لوحظ انخفاض خفية من luciferase النشاط عند منطقة 1 موجودة (M137-BS 1) ولكن هذا لم يكن انقاذهم من قبل حذف موقع ملزم مير 137 (M137-BS 1 Δ)، مما يوحي بأن مير 137 هو غير مسئول عن هذا التأثير. (ب) تم تخفيض النشاط مراسل بشكل ملحوظ (من قبل ~ 20٪) عندما كانت المنطقة 2 الحالية (M137-BS 2)، وألغيت هذا الأثر تماما عندما تم حذف موقع ملزم مير 137 (M137-BS 2 Δ) (ج ) المنطقة 3 (M137-BS 3-5) يحتوي على ثلاثة توقع مواقع الربط، وكان بناء الأكثر تضررا بشكل كبير. (~ تخفيض 80٪ من النشاط تحكم luciferase المراسل). لتحديد أي من المواقع وظيفية، وأنشأنا سلسلة من بنيات الحذف تحتوي كل مجموعة من الحذف موقع ملزمة. حذف الفردي للمواقع الربط زيادة النشاط التي كتبها ~ 10٪ في كل حالة (M137-BS 3-5 Δ3، M137-BS 3-5 Δ4، M137-BS 3-5 Δ5)، وحذف أي مزيج من 2 من 3 مواقع زيادة النشاط بمبلغ إضافي ~ 20٪ (M137-BS 3-5 Δ3 / 4، M137-BS 3-5 Δ3 / 5، M137-BS 3-5 Δ4 / 5). حذف جميع مستويات التعبير ثلاثة مواقع ملزمة عاد إلى ~ 90٪ من النشاط تحكم luciferase المراسل (M137-BS 3-5 Δ3 / 4/5). تم احتساب فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات باستخدام اختبار ANOVA تليها بعد خاصة توكي الحساب. يشار أهمية التي كتبها * P <0.05، ** p <0.01 و*** P <0.001. لاحظ أنه في الجزء ج أهمية الفرق بين بناء المنطقة 3 (M137-BS 3-5) وتأثير حذف مواقع الربط الفردية على النحو التالي: M137-BS 3-5 Δ3 (P <0.05)، M137- BS 5/3 Δ4 (P <0.01)، M137-BS 3-5 Δ5 (P <0.001). لقد لخصت هذا في الشكل كما يجري كل ثلاث p <0.05 لوضوح. النتائج هي ممثل من اثنين على الأقل من تجارب مستقلة وذكرت بأنه متوسط +/- الانحراف المعياري من 3 مكررات البيولوجية.
الصورة بالحجم الكامل
لمزيد من التحقيق في دور MIR137 كمرشح التوحد نحن مصممون إذا الجينات المستهدفة من قبل مير 137 كانوا هم أنفسهم متورطين في التوحد. من التوحد قاعدة المعرفة (AutismKB)
15 استخرجنا الجينات المتورطة في التوحد المتلازمات وغير المتلازمة (N = 3067). باستخدام TargetScan 6.2 خوارزمية
10 حددنا الأهداف المتوقعة للمير 137 (N = 1144). وعند مقارنة هذه القوائم الجينات اثنين لاحظنا تداخل واسع النطاق (N = 263) التي تم حسابها أن تكون كبيرة للغاية (ع <7.130e-23)
(الجدول التكميلي S1). وأظهرت قائمة الجينات المتداخلة تمثيل الإفراط في مهمة لفئات GO بما في ذلك انتقال متشابك (adjP = 4.58e-07) والجهد الموجبة بوابات النشاط قناة (adjP = 7.36e-06)، وإثراء للبروتينات مترجمة إلى المشبك (adjP = 8.53e-07) ومقصورة محور عصبي (adjP = 4.25e-06) (انظر
التكميلية الجدول S2 للحصول على نتائج GO الكاملة). وشملت هذه القائمة الجينات المتداخلة أيضا بعض المرشحين التوحد الأكثر التحقق جيدا مثل
NRXN1، SHANK2، SCN2A وCACNA1C. وهكذا بالإضافة إلى تنظيم RORA، مير 137 قد تكون مسؤولة عن السيطرة على مستويات عددا من الأهداف التي تعمل في شبكات التوحد الجينات.