التوحد هو اضطراب النمو العصبي شيوعا من مسببات وراثية معقدة. متلازمة ريت، وهو اضطراب السائد المرتبط X التي تسببها طفرات
الأمهات، لديها المظهرية والتداخل الوراثي يعانون من مرض التوحد.
بترميز البروتين الميثيل الدليل السياسي الشامل ملزم 2 الذي يعمل كما وقامع النسخي للبنيات الجينات مثيلة لكن من المستغرب ليس مطلوبا للحفاظ على مطبوع التعبير الجيني. هنا، ونحن اختبار الفرضية القائلة بأن نقص
الجينات المجاورة دون أن يؤثر بالضرورة التعبير مطبوع. واستخدمت الأساليب الكمية متعددة بما في ذلك الكميات الآلي والمناعي
الموضعي عن طريق المسح الضوئي ليزر الخلوي على ميكروأرس الأنسجة، طخة مناعية وTAQMAN PCR
سلالات الفئران تعاني من نقص المختلفة وريت الإنسان، Angelman والتوحد العقول مقارنة مع الضوابط. على الرغم من أن لا فرق لوحظ في التعبير أليلية من عدة نسخ مطبوعة في
بمعنى التعبير بشكل ملحوظ، بما يتفق مع انخفاض في البروتين. A الجين غير مطبوع-من 15q11-Q13،
ترميز الوحيدات β3 من GABA A مستقبلات، كما أظهرت انخفاض كبير في التعبير متعددة ريت، Angelman وعينات الدماغ مرض التوحد،
الفئران تعاني من نقص كتبها طخة مناعية الكمي. هذه النتائج تشير إلى مسار متداخل من التقلبات الجينات داخل 15q11-Q13 في ريت، Angelman والتوحد وتوريط MeCP2 في تنظيم
التعبيرات في أدمغة الثدييات ما بعد الولادة.
التوحد هو اضطراب النمو العصبي الوراثي معقدة تتميز إعاقات حادة في التفاعل الاجتماعي والتواصل والأنماط السلوكية التي هي مقيدة والنمطية
(1). متلازمة ريت (RTT؛ OMIM 312750) هو المهيمن اضطراب النمو العصبي المرتبط X التي تسببها طفرات في
MECP2، الذي يشفر بروتين ميثيل الدليل السياسي الشامل ملزم 2 (MeCP2)
(2). متلازمة أنجلمان (AS؛ OMIM 105830) هو اضطراب مطبوع الناجم عن نقص الأمهات من كروموسوم 15q11-Q13، عيوب مثيلة أو طفرة الأمهات من
UBE3A ترميز بتحول يغاز UBE3A / E6-AP
(3). RTT وAS تشترك في السمات السريرية متداخلة مع التوحد بما في ذلك تأخر في النمو، وضعف اللغة، والمضبوطات والسلوكيات النمطية
(4). وعلاوة على ذلك، أظهرت التقييمات السريرية للسلوك الاجتماعي وتيرة عالية من التوحد في المرضى الذين يعانون من RTT
(5) وAS
(6). A
Mecp2 نموذج الفأر متحولة من RTT يظهر أيضا تشوهات في التفاعلات الاجتماعية
(7). بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على الطفرات
MECP2 في عدد قليل من المرضى الذين شخصت إصابتهم AS
(8) والتوحد
(9، 10) و15q11-Q13 الازدواجية موجودة في ~1٪ من حالات التوحد
(11)، مما يدل على التداخل في التسبب في هذه تختلف أعراض وراثية.
GABRB3، ترميز GABA A مستقبلات β الوحيدات، ويقع داخل-Q13 15q11
(12) ويظهر بالتعاون مع التوحد
(13، 14)، ولكن يتم التعبير عن biallelically
(15). لقد أثبتنا سابقا عيوب التعبير MeCP2 في التوحد وAS عينات الدماغ عن طريق نهج كمي المناعي
(16). في المقابل، مستوى التعبير من البروتينات المشفرة بواسطة الجينات داخل 15q11-Q13 في RTT، AS والتوحد لم تميزت أيضا.
MeCP2 بربط المواقع الدليل السياسي الشامل مميثل
(17)، يقمع النسخ من بنيات مميثل
(18)، والزميلة مع لونين المعدلة عوامل deacetylase هيستون
(19، 20) وناقلة ميثيل الحمض النووي
(21، 22). Mecp2 -null
(23، 24) أو متحولة
(25) الفئران ألخص النمط الظاهري من RTT وتبين أن MeCP2 ضروري لنمو الدماغ بعد الولادة الثدييات. وعلى الرغم من توقع MeCP2 أن يكون قامع النسخي العالمي، ندرة في الجينات المستهدفة MeCP2 تم تحديدها في
Mecp2 الدماغ -null الماوس
(26)، RTT الدماغ
(27) أو خطوط الخلايا
(28) من خلال التنميط التعبير الجيني. وقد تم التعرف على عامل موجه للعصب المستمدة ترميز الجينات في الدماغ كهدف من MeCP2 القمع النسخي حيث تم زيادة مستوى منخفض القاعدية من النسخ السابقة لتحفيز الخلايا العصبية في الخلايا العصبية
Mecp2 -null
(29، 30). كما أظهر
H19 الجينات مطبوع زيادة التعبير في
Mecp2 خلايا -null
(21)، ولكن لم يحدد في السابق ما إذا كانت الزيادة ترجع إلى إزالة القمع من أليل الأب ميثليته. نظرا لوجود عدد محدود من الجينات المستهدفة MeCP2، ودور MeCP2 في التسبب في RTT وغيرها من اضطرابات التوحد لا يزال بعيد المنال.
على الرغم من
MECP2 طفرة لا يؤثر التعبير مطبوع العديد من الجينات داخل 15q11-Q13
(31)، ونحن افترضنا أن MeCP2 يمكن أن تنظم مستوى التعبير عن الجينات في هذه المنطقة دون أن يؤثر بالضرورة تعبير أليل معين. هنا، علينا أن نبرهن على نتائج نقص
Mecp2 إلى خفض كبير في UBE3A /
Ube3a وGABRB3 /
Gabrb3 التعبيرات في الماوس المخ دون تغييرات واضحة في التعبير أليل معين. وعلاوة على ذلك، لوحظ انخفاض كبير في UBE3A وGABRB3 التعبيرات في AS، RTT والتوحد البشري عينات الدماغية مقارنة مع الضوابط. هذه النتائج تظهر عيوب جينية متداخلة في هذه الاضطرابات النمائية العصبية متشابهة ظاهريا ولكن متميزة وراثيا وتوريط MeCP2 في تنظيم التعبير الجيني داخل 15q11-Q13.
انخفاض التعبير UBE3A في Mecp2 الفئران ناقصة
كأثر غير الخلية-مستقلة المهيمن
Mecp2 طفرة في البرية من نوع (وزن) -expressing خلايا
Mecp2 الفسيفساء - / + إناث وقد وصفت
(32)، أجرينا خلية واحدة التحليلات الكمية للمتحولة (طن متري) -expressing (MeCP2 سلبي) والخلايا (MeCP2 إيجابي)، معربا عن بالوزن لUBE3A المناعي على ميكروأري الأنسجة عن طريق المسح الضوئي ليزر الخلوي (LSC). أثبت هذا النهج انخفاض 1.5-2 أضعاف استنساخه في UBE3A مناعية في 10
Mecp2 - / + واثنين من
Mecp2 - عينات الدماغية / ص من اثنين من سلالات مختلفة
Mecp2 -null
(23، 24). مقارنة مع الضوابط WT (الشكل
1 A و ب). كل من الخلايا، معربا عن طن متري من
Mecp2 - / +
وMecp2 - / ص (رسوم بيانية الزرقاء) ووزن، معربا عن الخلايا من
Mecp2 - أظهرت / + المخ (رسوم بيانية الحمراء) أقل بكثير التعبير UBE3A مقارنة مع الخلايا معربا عن WT-من
Mecp2 + / + المخ (رسوم بيانية البرتقالية). للتدليل على أن العيوب لاحظت في
Mecp2 - / +
وMecp2 - / كانت عينات المخ ص الواقع بسبب الاختلافات في التعبير UBE3A، وليس الكشف المناعي، وأجريت تحاليل طخة مناعية (الشكل
1 C). وقد لوحظ انخفاض UBE3A / E6-AP التعبير طخة مناعية لكلا
Mecp2 - / +
وMecp2 - / ص عينات الدماغ من كلا
Mecp2 سلالات -null مقارنة مع الضوابط ولكن مع أهمية أقل من النتائج الخاصة بمركز حلول Lexmark. أخذ عينات دقيقة من الخلايا وحيدة داخل القشرة الدماغية في التحليل LSC مقارنة مع تحليل الدماغ كله طخة مناعية قد يفسر حساسية أكبر للنهج LSC. هذه النتائج تثبت أن بروتين تعبير UBE3A في القشرة الدماغية ينخفض كل من الآثار خلية مستقلة وغير الخلية-المتمتعة بالحكم الذاتي في
Mecp2 الطفرة.
الشكل 1. UBE3A التعبير في
Mecp2 الماوس -null الدماغ.
(A) A ميكروأري الأنسجة المتعدد التي تحتوي على وزن وخروج المغلوب الماوس عينات القشرة المخية
(16) كانت ملطخة للالمناعي باستخدام محطة C رد الفعل المضادة للMeCP2 والأجسام المضادة لمكافحة UBE3A. الخلايا MeCP2 سلبي
(Mecp2، رسوم بيانية الزرقاء، معربا عن طن متري، نسبة معروضة) تم بوابات منفصلة عن خلايا MeCP2 إيجابية (التعبير عن
WT-Mecp2، رسوم بيانية الحمراء)، ومجموع السكان (رسوم بيانية السوداء) وبالمقارنة مع السيطرة العمر المتطابقة WT عينات الإناث أو الذكور (رسوم بيانية البرتقالية).
(B) ويظهر الرسم البياني دمج نتائج LSC (يعني ± SEM) من أربعة تكرار الشرائح باستخدام اثنين من مختلف أضداد UBE3A. جرى التحقيق مقتطفات
(C) البروتين من كامل دماغ الفأر الكبار على طخة مناعية مع مكافحة UBE3A أو مكافحة GAPDH. وتظهر صورة ممثل انخفاض التعبير في دماغ UBE3A في كل من الذكور فرداني الزيجوت (- / ذ) والإناث متخالف (- / +) الدماغ مقارنة مع من النوع البري (بالوزن، + / y و + / +) الضوابط littermate لكلا
Mecp2 TM1 .1Bird
وMecp2 tm1.1Jae السلالات. يوضح الرسم البياني النتائج GAPDH تطبيع مجتمعة (يعني ± SEM، الكميات كما هو موضح سابقا
(32)، ونسب المثال أدناه كل حارة) من ثمانية مختلفة - / + وستة عينات مختلفة + / + الدماغ من
Mecp2 tm1.1Bird
وMecp2 TM1 سلالات .1Jae. *
P <0.05، ****
P <0.0001 التي كتبها t -test.
كما يرتبط التعبير الأمهات من
Ube3a في الخلايا العصبية بعد الولادة مع التعبير الأب من محضر العقاقير
Ube3a من منطقة السيطرة يطبع (ICR) من المروج
Snrpn /
Snurf (33)، درسنا دور MeCP2 عن حالة يطبع من هذا مكان. أظهر مناعي لونين (رقاقة) أن MeCP2 كان لا بد أن مروجي
Snrpn ومراقبة إيجابية
U2af1-RS1 (34) في المخ الماوس (الشكل
2 A). في المقابل، وجد أيا من
Ube3a ولا
Gabrb3 المروج لتترافق مع MeCP2 على مستوى كشفها، بما يتفق مع عدم وجود الحامض. تظاهر F1 ذرية التعبير الأمهات تفضيلية المتوقع من
Ube3a الشعور نص والتعبير الأب من العقاقير
Ube3a وSnrpn والتعبير biallelic من
Gabrb3، بغض النظر عن
Mecp2 النمط الجيني (الشكل - تحليلات أليل معين من (/ + × PWK
Mecp2) 2 B). وأظهرت هذه النتائج أن انخفاض تعبير عن UBE3A /
Ube3a في
Mecp2 الدماغ نقص لم يكن مباشرة بسبب تغييرات في التعبير أليل معين وتؤكد نتائج مماثلة من الدماغ البشري
(31). تم اختبار اثنين من الجينات مطبوع إضافية من مواضع أخرى
(Rasgrf1 وH19) أيضا لإجراء تغييرات تعبير أليل معين في
Mecp2 الفئران -null مع نتائج مماثلة (الشكل
2 B). تثبت هذه النتائج كذلك أن
Mecp2 غير مطلوب لصيانة مطبوع التعبير الجيني.
يحلل
الشكل 2. يطبع والنسخي في مخ الفأر.
(A) لونين من عينات الماوس مخ الكبار [C57B6، PWK أو (B6 × PWK) F1] تم عزله عن رقاقة. كان يستخدم لمكافحة MeCP2 (C-النهائي) لimmunoprecipitate شظايا الحمض النووي من "المدخلات" السيطرة.
Ube3a وGabrb3 المروجين لم يتم الكشف في مكافحة MeCP2 عجل لونين، وعلى النقيض من تسلسل المروج
Snrpn التي أظهرت بالتعاون مع MeCP2.
U2af1- كان
RS1 تحكم إيجابية للمروج أثبتنا سابقا لربط MeCP2 في الدماغ
(34). (B) Mecp2 tm1.1Bird / + تم عبرت (B6) إناث مع WT PWK الذكور للحصول على F1 الفئران متخالف لتعدد الأشكال النووية المنفردة في مناطق ترميز العديد من الجينات مطبوع. تم إجراء RT-PCR تليها الهضم انزيم التقييد (+) على الحمض النووي الريبي من عينات الدماغ الكبار من جميع الأنماط الجينية
Mecp2 وكذلك عينات B6 وPWK الأبوية (P، الأب، M، الأم). كما ذكرت سابقا لوزن (B6 × PWK) F1 الدماغ
(67)، Ube3a الشعور عرضت تفضيلية التعبير الأمهات،
Ube3a العقاقير
وSnrpn كان الأب حصرا وكان
Gabrb3 biallelic، مع عدم وجود تأثير كبير من
Mecp2 الوراثي على هذه بصمات. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت
Rasgrf1 تفضيلية التعبير الأب
(68)، في حين أظهرت
H19 التعبير الأمهات الحصري
(70) في جميع العينات. النتائج هي ممثل من الكبار وعينات F1 الدماغ حديثي الولادة. وقد استخدم
(C) TAQMAN PCR لتحديد الكمية مستويات التعبير عن
Ube3a، Snrpn وGabrb3 في
Mecp2 عمره 10 أسابيع - / ص
وMecp2 + / Y RNA الدماغ. الاشعال امتدت حدود إنترون / اكسون ومحددة للنسخة الشعور
Ube3a. النتائج المعروضة هي لمتوسط ± SEM من أربعة مكررات التجريبية من اثنين من الفئران في التركيب الوراثي. على الرغم من
Ube3a وGabrb3 أظهرت انخفاض مستمر التعبير في الدماغ -deficient
Mecp2 مقارنة مع الضوابط، لم يتغير
Snrpn بشكل ملحوظ. تم الكشف عن
(D) العقل والعقاقير محاضر
Ube3a من قبل مضان
في الموقع التهجين باستخدام riboprobes واحدة الذين تقطعت بهم السبل وquantitated التي كتبها LSC كما هو موضح سابقا
(16). النتائج (يعني ± SEM من 3 بالوزن و 10
Mecp2 - / + عينات) وتم تطبيع للسيطرة على التحقيق β-الأكتين. *
P <0.05 ***
P <0.001
كتبها t -test.
لتحديد ما إذا خفضت أيضا مستويات
Ube3a نسخة، تم تنفيذ TAQMAN PCR RNA على عينات تم الحصول عليها من
Mecp2 - / ص
وMecp2 + / الفئران ذ. أظهرت النتائج انخفاضا في
Ube3a (الشعور)
وGabrb3 النصوص، ولكن ليس في
Snrpn، في
Mecp2 الدماغ تعاني من نقص (الشكل
2 C). ثم تم إجراء مضان
التهجين الموضعي مع riboprobes الذين تقطعت بهم السبل
واحدة في يوم ميكروأري الأنسجة من أجل تحليل منفصل بمعنى والعقاقير محاضر
Ube3a والتأكد من الحد من
Ube3a الشعور نسخة من طريقة أخرى. الشكل
2 يوضح D النتائج تدل تعبير أقل بكثير من الشعور
Ube3a ولكن ليس
Ube3a النصوص العقاقير. وتشير هذه النتائج مجتمعة أن الانخفاض في UBE3A تعبير البروتين في الدماغ
Mecp2 نقص يرجع إلى انخفاض التعبير عن نسخة الشعور
Ube3a دون تغيير كبير في
Snrpn أو نص العقاقير
Ube3a أو التعبير الأم ومنحازة
للUbe3a. لتحديد ما إذا لوحظت تخفيضات كبيرة في UBE3A التعبير أيضا في عينات الدماغ البشري، وصف بعد الوفاة ميكروأري أنسجة المخ التي تحتوي على عينات سبق الدماغية الإنسان
(16) وتحليلها من قبل المناعي وLSC. رسوم بيانية في الشكل
3 A تثبت تخفيضات كبيرة في UBE3A التعبير عن RTT، AS وعينات التوحد (أسود) مقارنة مع العمر كعينة ضابطة (الرمادي). وترد الأعمار من كل عينة، ولكن لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية في مستوى UBE3A التعبير مع زيادة العمر للضوابط (لا تظهر البيانات)، خلافا للزيادة مذهلة مع التقدم في السن لوحظت في MeCP2
(16، 35). يعني UBE3A مضان وتطبيع للسيطرة هيستون H1 التعبير ورسوم بيانية (الشكل
3 B)، مما يدل على تخفيضات كبيرة في UBE3A RTT وعينات من مرض التوحد. وكان من المتوقع وبما يتفق مع مستوى منخفض من الأب التعبير
UBE3A في القشرة المخية (التعبير انخفاض UBE3A في AS 15q11-Q13 عينة حذف
36). تم تأكيد النتائج الخاصة بمركز حلول Lexmark من قبل طخة مناعية (الشكل
3 C يدل على وصمة عار تمثيلية). علاوة على ذلك، أظهرت انخفاض التعبير UBE3A في AUT1174 أيضا طخة مناعية في تقرير صدر مؤخرا
(37).
الشكل 3. الكميات من UBE3A التعبير في ريت، Angelman والتوحد الدماغ العينات.
(A) ميكروأري الأنسجة البشرية هو موضح سابقا
(16) التي تحتوي على طبقات القشرة الأمامية III-V من منطقة Brodman (BA9) تم تحليلها لUBE3A التعبير LSC. تظهر رسوم بيانية التعبير السفلي من عينات المرضى (أسود) من ريت (RTT)، Angelman (AS) والتوحد (AUT) مقارنة مع العمر كعينة ضابطة (الرمادي). وكانت
(B) القيم المناعي UBE3A طبيعية لتلك السيطرة هيستون H1 و نتائج أربع شرائح تكرار باستخدام اثنين مختلفة أضداد UBE3A (الانجذاب Bioreagents وBD العلوم البيولوجية) وبلغ متوسط (يعني ± SEM) لكل عينة الدماغ هو مبين في (A )
(ن، وعدد من عينات مختلفة). انخفض
(C) تحليل طخة مناعية التعبير UBE3A (مكافحة UBE3A، تقارب، مع الاعتراف كل إيسفورمس معروفة) أكد التعبير في AS، RTT وAUT مقارنة مع الضوابط (تظهر نسب UBE3A / GAPDH). *
P <0.05، **
P <0.01
كتبها t -test.
وقد
GABRB3 متورطين بقوة في التوحد في عدة دراسات تكوين الجمعيات
(14، 38، 39)، ولكن التغيرات في مستوى التعبير ولم يثبت سابقا. بسبب نقص
Mecp2 تتأثر ليس فقط التعبير
Ube3a ولكن أيضا الجين أعرب biallelically،
Gabrb3 (الشكل
2 C)، ونحن التحقيق مزيد من المنتجات البروتين، حمض الغاما غاما (GABA) مستقبلات β3 الوحيدات، عن عيوب في
Mecp2 / MeCP2 الدماغ تعاني من نقص. طخة مناعية التحليلات أثبتت مخفضة GABRB3 التعبير في
Mecp2 - / +
وMecp2 - / الدماغ ذ الماوس مقارنة مع الضوابط (الشكل
4 أ)، مما يشير إلى هدف إضافي من مكان 15q11-Q13 يمكن أيضا dysregulated في RTT، AS والتوحد.
الشكل 4. تحليل GABRB3 التعبير في الماوس والدماغ البشري.
(A) تحليل طخة مناعية من GABRB3 التعبير (المضادة للGABRB3، الانجذاب Bioreagents، مع الاعتراف كل إيسفورمس معروفة) يظهر انخفاض التعبير في
Mecp2 - / +
وMecp2 - / ص الماوس الكبار الدماغ مقارنة مع الضوابط. جنبا إلى جنب النتائج GAPDH تطبيع من ثمانية
Mecp2 مختلفة - / + وستة عينات مختلفة الدماغ
Mecp2 + / + الكبار من
Mecp2 tm1.1Bird
وMecp2 tm1.1Jae سلالات كانت أقل بكثير من النوع البري الضوابط
(P <0.01). يحلل
(B) طخة مناعية الممثل من GABRB3 وGAPDH في AS، RTT والتوحد والتحكم (NS) عينات الدماغية مع نسب GABRB3 / GAPDH مبين. وأظهرت النتائج تكرار طخة مناعية لجميع العينات والاختبارات أهمية في الجدول
1. يتم توفير معلومات إضافية حول عينات المخ بعد الوفاة المستخدمة في هذه الدراسات على الانترنت (المواد التكميلية، الجدول S1).
كما بروتين الغشاء، كان GABRB3 أقل قابلية للتحليل LSC من البروتينات النووية أو حشوية ليتم تحديد الخلايا الفردية التي الكنتوري النووي. تحليلات طخة مناعية وبالتالي، يقوم على تجميد أمامي قشرة الدماغ، منطقة Brodman 9 (BA9)، من ما مجموعه ثلاثة RTT (مع الطفرات
MECP2)، وهما AS (مع حذف 15q11-Q13)، وتسعة التوحد (أي الطفرات
MECP2 اكتشافها أو الازدواجية 15q11-Q13) و 11 المطابقة العمرية المختلفة الضوابط العادية. وترد اثنين immunoblots تمثيلي في الشكل
4 B. الجدول
1 تظهر البيانات المجمعة لنسب GABRB3 / GAPDH طبيعية لجميع العينات الفردية. عندما تحليلها كما الفئات مجتمعة، RTT، وأظهرت عينات AS والتوحد أقل بكثير التعبير GABRB3 مقارنة مع الضوابط. وأظهرت عينات التوحد أعلى انخفاض كبير في GABRB3 كمجموعة
(P <0.0001) على الرغم من التباين العالي بين العينات، مع إظهار بعض التعبير منخفضة للغاية (أي 797، 1174، 967 و5173، مع 5-10٪ من السيطرة التعبير) والبعض الآخر يظهر تغيير يذكر (أي 3924 و 5342، الشكل
4 B والجدول
1). وتظهر أعمارهم بين العينات في الجدول
1، ولكن تكشف أي تغيير كبير في GABRB3 التعبير مع التقدم في السن من العينات السيطرة اختبارها. متوسط التعبير GABRB3 لكل فئة المرضى، لذلك، مثلت أيضا كمجموعة لالمقارنات الإحصائية. على الرغم من أوجه القصور التعبير GABRB3 ليست عالمية في جميع العينات التوحد الدماغ، والعيوب هي أكثر أهمية مما كانت عليه في RTT وAS وتحدث في تردد عال بشكل غير متوقع (5/9 أو 56٪). تم اختبار خصوصية العيوب GABRB3 إلى AS، RTT والتوحد عن طريق تحليل ثلاث متلازمة داون (DS) عينات الدماغ مع التثلث الصبغي 21. الجدول
1 يبين عدم وجود عيوب كبيرة في GABRB3 التعبير في DS مقارنة مع الضوابط. هذه النتائج، وبالتالي، تثبت أن المنخفض GABRB3 التعبير هو سمة مشتركة من RTT والتوحد الدماغ.
الجدول 1. فروق ذات دلالة إحصائية في التعبير GABRB3 في RTT، AS والتوحد الدماغ عن طريق طخة مناعية الكمي
وقد كشف الأساس الجيني للمرض التوحد تحديا بسبب المسببات المعقد. على الرغم من أن التوريث التوحد في الأسر مرتفع، ويتوقع العديد من مواضع الجينات والتأثيرات البيئية
(1). حتى بالنسبة لاضطرابات التوحد مع أسباب وراثية معروفة، ليست مفهومة جيدا المرضية الجزيئية. بسبب التداخل في النمط الظاهري بين RTT، AS والتوحد
(4)، ونحن اختبار الفرضية القائلة بأن التعبير الجيني في المنطقة 15q11-Q13 يجوز تغيير في جميع المتلازمات الثلاث. نعرض لأول مرة أن AS الجينات،
UBE3A / Ube3a، وانخفاض كبير في RTT
وMecp2 الفئران -null، مما يدل على أن
MECP2 / أسباب نقص
Mecp2 انخفاض التعبير عن
Ube3a / UBE3A. وبالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر نقص UBE3A في عينات الدماغ التوحد، بما يتفق مع تقرير صدر مؤخرا
(37). وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أيضا لأوجه القصور لأول مرة في التعبير عن مستقبلات GABA β3 الجينات الوحيدات
(GABRB3) في RTT والتوحد الدماغ
وMecp2 الفئران -null.
وقد لوحظ الازدواجية الأمهات في 15q11-Q13 في ~1٪ من حالات التوحد كما الشذوذ الوراثي الخلوي الأكثر شيوعا في مرض التوحد
(11). وقد حددت الدراسات الربط الجينوم على نطاق موضع 15q11-Q13 في بعض وليس كل بالاشعة
(40 -
43). وعلاوة على ذلك، حددت بالاشعة عالية الدقة الربط داخل 15q11-Q13 في أسر التوحد الربط كبيرا
لUBE3A وGABRB3 في بعض الدراسات ولكن ليس غيرها
(14، 44 -
+48). في حين أن الربط بين مرض التوحد إلى 15q11-Q13 قد يكون المتنازع عليها إلى حد ما على المستوى الجيني، وهنا تبين لنا أن العيوب مستوى التعبير عن اثنين من الجينات داخل 15q11-Q13 شائعة إلى RTT، AS والتوحد. وكان من المتوقع بسبب الأمهات حذف 15q11-Q13 في هذه العينات الحد من UBE3A وGABRB3 في AS المخ. ومن المثير للاهتمام، وأظهرت لا
Ube3a ناقصة ولا أحد الأبوين الفئران disomy دليل على انخفاض
Gabrb3 التعبير
(49، 50)، ولكن عدم وجود AS عينات الدماغ مع أحد الأبوين أو disomy
UBE3A الطفرات منعت تأكيد لدينا من هذه النتيجة في العينات البشرية.
نتائجنا تتفق مع عرض تقرير صدر مؤخرا انخفاض UBE3A في التوحد الدماغ
(37)، ولكن تمتد المراقبة إلى إظهار نقص GABRB3 وجود عيب شائع في مرض التوحد. وGABA A جينات مستقبلة هي الجينات المرشحة جذابة للتوحد عدة عن دراسات أثبتت الربط إلى واحد أو أكثر من هذه الجينات
(13، 14، 48). وقد أظهر تصوير الإشعاع الذاتي خفض GABA A ملزمة في التوحد الدماغ
(51) وارتقى تعميم مستويات GABA تم العثور عليها في الأطفال المصابين بالتوحد
(52 -
+54). على الرغم من أن لدينا حجم العينة كان صغيرا بسبب اشتراط بعد الوفاة أنسجة المخ الإنسان، وتواتر UBE3A وGABRB3 التعبير العيوب داخل عينات التوحد الدماغ أعلى بكثير من العيوب الوراثية التي سبق وصفها. كانت العيوب في UBE3A وGABRB3 التعبيرات غير المرجح أن ذلك يعود إلى تدهور في الأنسجة بعد الوفاة لأنها لم تراع في العديد من أجهزة التحكم العادية وDS ولأن النتائج كانت كل تطبيع مع الضوابط التدبير المنزلي الجينات. وتشير هذه النتائج إلى أن انخفاض تعبير عن
UBE3A وGABRB3 هي مرتبطة ويمكن أن يكون نتيجة المصب من مسببات وراثية أو جينية مختلفة متعددة. ومن المتوقع أن تكون أقل حدة من طفرة جينية (طفرات
UBE3A في AS) أو nullisomy نتيجة المظهرية لخفض التعبير عن هذه الجينات. كلا
Ube3a - / +
وGabrb3 +/-، - / - الفئران لديها التعلم والسيارات العيوب والمضبوطات محرض، على غرار AS وبعض حالات التوحد
(55، 56). في حين يبدو لنا التوحد العينة الدماغ لتخصيبه إلى حد ما لاضطرابات الاستيلاء المرتبطة بها (المواد التكميلية، الجدول S1)، بشكل ملحوظ وقد لوحظ انخفاض-GABRB3 التعبير في عينات الدماغ من الأفراد مع وبدون المضبوطات.
كما يمكننا التعرف على الجينات المرتبطة X،
MECP2، وسبب وراثي واحد من UBE3A وGABRB3 التعبير عيوب في المخ لدى الثدييات. وقد استخدمنا سلالتين
Mecp2 نقص RTT الماوس
(23، 24) لإثبات أن UBE3A /
Ube3a وGABRB3 /
Gabrb3 وانخفضت بشكل ملحوظ في الكبار مخ الفأر مقارنة مع الضوابط WT. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا عيوب كبيرة في التعبير عن UBE3A وGABRB3 في الإنسان عينات الدماغ RTT مع الطفرات
MECP2. نتائجنا تتفق مع
GABRB3 تبين انخفاض التعبير في RTT الدماغ عن طريق التعبير الجينوم على نطاق التنميط في تقرير واحد
(27). لاحظت بعض التغييرات الطفيفة نسبيا في التعبير عن UBE3A وGABRB3 في هذه الدراسة قد يفسر لماذا لم يتم تحديد هذه الجينات في الدراسات التنميط الجينوم على نطاق أخرى من أنسجة متحولة
MECP2 /
Mecp2 (26، 28). كما لوحظ مراقبة أسفل التنظيم فضلا عن ما يصل التنظيم من الجينات المستهدفة MeCP2 في التعبير التنميط دراسات، يجادل ضد دور واحد لMeCP2 باعتباره قامع النسخي.
كما أننا أثبتنا سابقا العيوب
MECP2 التعبير في نفس العينات التوحد الدماغ
(16)، وربما عيوب التعبير
MECP2 يمكن أن تكون مسؤولة عن أقل UBE3A وGABRB3 التعبيرات في هؤلاء الأفراد الذين يعانون من التوحد دون عيوب وراثية تتميز. بدلا من ذلك، قد عيوب في التعبير عن كل الجينات الثلاثة يكون نتيجة المصب من نمو المخ غير طبيعية. كما تبين أن
Mecp2 308 / ص نموذج RTT الماوس لإظهار بعض السلوكيات التوحد، بما في ذلك stereopathies forepaw وتجنب الاجتماعي
(7، 25)، ودور MeCP2 في التسبب في بعض الحالات على الأقل من التوحد يبدو من المرجح
(4).
في هذا التقرير، ونحن أيضا البدء في كشف آلية بدلا المعقدة وغير المتوقعة التي MeCP2 ينظم التعبير عن UBE3A وGABRB3. على الرغم من MeCP2 يربط الحمض النووي الميثيلي وهو قامع النسخي وتوقع
(17، 18)، وليس مطلوبا للحفاظ على بصمات الوالدين
(31). هنا، علينا أن نبرهن على MeCP2 يربط على مجلس النواب في المروج
Snrpn، ولكن ليس هو مطلوب منها لإسكات أليل الأمهات من
Snrpn وUbe3a العقاقير أو أليل الأب من النص المعنى
Ube3a. وعلاوة على ذلك، يتأثر مستوى التعبير عن
Gabrb3 على الرغم من هذا الجين وأعرب عن biallelically. نحن أيضا إظهار صيانة التعبير الأمهات الحصري
لH19 في
Mecp2 الفئران -null على الرغم من وصفه بأنه "حسن النية" الهدف MeCP2 الجين
(21). وتشير هذه النتائج إلى أن تأثير MeCP2 ملزمة لمجلس النواب هو أكثر تعقيدا من مجرد قمع الجينات مطبوع في
رابطة الدول المستقلة وبدلا من ذلك قد تنطوي على المدى الطويل لونين التفاعلات. ربما تشكيل حلقة لونين مثل وقد تجلى مؤخرا في مطبوع المنطقة
Igf2 /
H19 (57) يتأثر سلبا بسبب نقص
Mecp2، كما MeCP2 وقد وصفت في وقت سابق أن يكون النشاط ملزم مصفوفة
(58). يتضمن ~1 المنطقة ميغابايت من
UBE3A إلى
GABRB3 أيضا عدة جينات صغيرة نويي RNA
(33، 59، 60) وATP10A (61، 62)، واثنين من مستقبلات GABA A أخرى (GABRA5 وGABRG3) telomeric تقع من
GABRB3 (63) أن كما يمكن dysregulated عن نقص MeCP2. بالإضافة إلى الجزر الدليل السياسي الشامل ثلاثة التحقيق هنا للجمعية مع MeCP2، وهناك 13 جزيرة الدليل السياسي الشامل الأخرى في هذه المنطقة التي لا يزال يتعين التحقيق كمواقع ملزمة MeCP2 المحتملة (UCSC الجينوم متصفح، مايو 2004 التجميع). بالإضافة إلى طويلة المدى المنظمة لونين المحتملة في
رابطة الدول المستقلة، وقد أثبتت 15q11-Q13 التفاعلات
العابرة مثلي في الخلايا الليمفاوية الإنسان
(64) والدماغ (تاتشر
وآخرون، المقدمة للنشر) وخلايا فأر ES
(65) التي قد تكون مهمة في تنظيم مستوى التعبير عن جينات متعددة. على الرغم من أن الأفراد الذين يعانون من التوحد مع الازدواجية 15q11-Q13 قد تنبأ للتعبير عن مستويات أعلى من UBE3A وGABRB3 مقارنة مع الضوابط، ويمكن عدم وجود السليم الاقتران مثلي متحدر من والدين يؤدي بدلا من ذلك في التعبير السفلي من هذه الجينات مماثلة لعينات الدماغ التوحد في دراستنا.
في الختام، في هذا التقرير، أحرزنا اتصال هام من خلال الكشف على تغيير الدماغ الجزيئي مشترك لثلاثة التوحد اضطرابات النمو العصبي مختلفة من مسببات وراثية مختلفة. لاحظت عيوب التعبير في UBE3A وGABRB3 في RTT والتوحد المخ من المرجح أن تكون العواقب وظيفة الخلايا العصبية غير طبيعية نتيجة لقصور في
MECP2 أو أسباب وراثية أو بيئية أخرى. مزيد من فهم كيف ينظم MeCP2 التعبير عن هذه الجينات وغيرها داخل 15q11-Q13 قد تساعد في تحديد أسباب وراثية لمرض التوحد والمساعدة في تصميم علاجات لجميع الاضطرابات الثلاثة.
التحليل المناعي للميكروأرس الأنسجة
بناء ميكروأرس الأنسجة المستخدمة في هذه الدراسة تم الموصوفة سابقا
لMecp2 الماوس -null
(32) والاضطرابات العصبية النمائية الإنسان
(16). لفترة وجيزة، لمجموعة الماوس، ثلاث نسخ أزيلت 600 ميكرون النوى من القشرة الدماغية من خمسة
Mecp2 tm1.1Bird / +، خمسة
Mecp2 tm1.1Jae / +، وثلاثة
Mecp2 + / + الضوابط (P20 P27-ث ث)؛ واحد
Mecp2 tm1.1Bird / ص،
وMecp2 واحد + / تتزاحم ص (P10 ث)؛ واحد
Mecp2 tm1.1Jae / ص واحد
Mecp2 + / ص الضوابط littermate (P10 ث). يحتوي ميكروأري الأنسجة البشرية أمامي ثلاث نسخ القشرة المخية (BA9، طبقات III-V) التي تم الحصول عليها المجمدة <30 ساعة بعد الوفاة. تم تجهيز 5 ميكرون قسم للالمناعي كما هو موضح سابقا لمكافحة MeCP2 (C-المحطة، الانجذاب Bioreagents) وH1 المضادة للهيستون (ريف التكنولوجيا الحيوية) الأجسام المضادة
(66). لأنسجة الماوس، تم تنفيذ تلطيخ جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة لمكافحة UBE3A (BD العلوم البيولوجية وهدية وحيدة النسيلة من هاولي، كلية الطب بجامعة هارفارد) والماعز المضادة للماوس مفتش سلسلة الأزرق المسمى (المسابر الجزيئية). لأنسجة الإنسان، تم استخدام الأجسام المضادة لمكافحة UBE3A (الانجذاب Bioreagents). تم إجراء التحليل LSC من MeCP2 السكان السلبية والإيجابية كما هو موضح سابقا
(32). تم الكشف عن المعنى والعقاقير محاضر
Ube3a من قبل مضان
في الموقع التهجين باستخدام riboprobes الذين تقطعت بهم السبل واحدة من 796 سنة مضت المستنسخة جزء يمتد الإكسونات 10/06 (الاشعال، 5'-tcacatatgatgaagctacgaa-3 "و5'-ttctttgcttgaatattccgg-3 ') المسمى مع البيوتين (مختبرات Lofstrand). A digoxigenin تحقيق السيطرة β-أكتين المسمى (روش) والمهجنة في وقت واحد في 55 ° C. تم تنفيذ الشروط التهجين والكشف الفلوري والكميات التي LSC كما هو موضح سابقا
(16). تم تحليل ما مجموعه 10 ميكروغرام من استخراج البروتين من كامل دماغ الفأر الكبار في حارة بواسطة طخة مناعية كما هو موضح سابقا
(32) باستخدام مكافحة UBE3A (BD العلوم البيولوجية)، ومكافحة GABRB3 (الانجذاب Bioreagents) أو معاداة GAPDH (متقدم مناعى) الأجسام المضادة بتركيزات الموصى بها. تم عزل مقتطفات من البروتين من القشرة المتجمدة الإنسان بعد الوفاة الدماغية (BA9) من عينات هو موضح سابقا
(16) وعينات إضافية (هارفارد البنك الدماغ وجامعة ميريلاند الدماغ والأنسجة بنك). مماثلة لعينات الماوس، تم تحليل 10 ميكروغرام من البروتين البشري في حارة مع نفس الكواشف باستثناء الاستعاضة عن الأجسام المضادة لمكافحة UBE3A محددة البشرية (الانجذاب Bioreagents). وقد تم الحصول على المخية (BA9) عينات بشرية إضافية من مرض التوحد، لتسقط وعينات ضبط نفس العمر من برنامج الأنسجة التوحد ليحلل طخة مناعية. تم تنفيذ الكميات باستخدام Nucleotech للجل الخبراء الإصدار 2.0.
Mecp2 tm1.1Bird / + (C57B6) إناث الفئران
(23) وتزاوج الذكور PWK بالوزن وتم التنميط الجيني لالذريات الناتجة عن
Mecp2 كما هو موضح سابقا (32). تم عزل الحمض النووي الريبي من الكبار
(Mecp2 tm1.1Bird / + × PWK) عينات F1 الدماغ من جميع المورثات الأربعة وكذلك الفئران B6 وPWK الوالدين. تم إجراء RT-PCR تليها الانزيم تقييد الهضم كما هو موضح سابقا لUbe3a، Snrpn،
Gabrb3 (67)
وRasgrf1 (68).
H19 الاشعال (5'-GAACCACTAACACTACCTGCC-3 "و5'-GGAACTGCTTCCAGACTAGG-3، 58 ° C مع 30 دورات) تضخيم شظية 585 شركة بريتيش بتروليوم التي تم هضمها مع
BGL II.
مناعي لونين
لونين من الكبار الماوس المخ عينات [C57B6، PWK أو (B6 × PWK) F1] تم عزله عن رقاقة كما هو موضح سابقا (34، 69). كان يستخدم لمكافحة MeCP2 (C-النهائي) لimmunoprecipitate شظايا الحمض النووي من السيطرة "الإدخال" كما هو موضح سابقا لالاشعال تغطي 5 "الجزر الدليل السياسي الشامل لSnrpn ومراقبة إيجابية U2af1-RS1 (34)، Ube3a (5'-CCCTTCTGCTTCTCTTCGGAGT-3" ، 5'-CAGAAGCAGCACACGAATAAA-3، 58 ° C يصلب، 37 دورات) وGabrb3 (5'-CCTCAGAGCCACCCGTAC-3 "، 5'-GTCTAGGACCCCGCGACA-3، 60 ° C يصلب، 40 دورة).
TAQMAN PCR
يرد كل PCR 400 ن M من كل التمهيدي، 80 ن M لجنة التحقيق TAQMAN ومتاحة تجاريا PCR mastermix (TAQMAN العالمي PCR Mastermix، النظم البيولوجية التطبيقية) تحتوي على 10 م M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.3)، 50 م M بوكل، 5 م M MgCl 2، 2،5 م M triphosphates deoxynucleotide، 0.625 U AmpliTaq الذهب DNA البلمرة في رد الفعل، 0.25 U AmpErase UNG في رد الفعل و 5 ميكرولتر من العينة كدنا] المخفف في الحجم النهائي من 25 ميكرولتر. Ube3a امتدت التمهيدي إلى الأمام الإكسونات 7-8 ( 5'-TCCAGATATTGGTATGTTCACATATG-3)، عكس التمهيدي (5'-GGGAAAATGGACATCCAGTATACAA-3 ') والتحقيق (' كانت) من اكسون 8 (NM_173010). 5'-CTGATTGGCATAGTCCTGGGTCTGGC-3 Snrpn التمهيدي إلى الأمام امتدت الإكسونات 3-4 (5 ' كانت -TCAGGAAGATCAAGCCAAAGAATG-3)، عكس التمهيدي (5'-AAGTTCTCCCCACGTAGCAAGAC-3 ') والتحقيق (5'-ACAGCCAGAACGTGAAGAAAAACGGGT-3') من اكسون 4 (NM_013670). Gabrb3 التمهيدي إلى الأمام امتدت الإكسونات 6-7 (5'-CCGTCTGGTCTCCAGGAATGTT -3 ')، عكس التمهيدي (5'-CCGATATTTCTCTTCAACCGAAAA-3') والتحقيق (كانت 5'-TTCGCCACAGGTGCCTATCCTCGAC-3 ') من اكسون 7. تم وضع العينات في 96 لوحات جيدة وتتضخم في التألق الآلي (ABI PRISM 7700 نظام تسلسل كشفها، النظم البيولوجية التطبيقية). كانت الظروف التضخيم 2 دقيقة في 50 ° C، مدة 10 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية، و 40 دورات من 15 ثانية في 95 ° C و60 ثانية في 60 ° C. وقد تم تحديد الكميات النهائية باستخدام طريقة CT المقارن (النظم البيولوجية التطبيقية) والتقرير كما النسخ النسبي أو ن أضعاف الفرق نسبة إلى كدنا] تدريج (Mecp2 + / ص من كل زوج) بعد تطبيع لHPRT1 مراقبة التدبير المنزلي الجينات.