الحذف الخلالي من كروموسوم 15q11-Q13. وتشمل الحذف وإعادة ترتيب المتكررة الأخرى في هذه المنطقة، ووصف أربعة "النقاط الساخنة" مشتركة لكسر نقاط التوقف 1-4 (BP1-BP4). حددت بناء على ~4 ميغابايت YAC contig هذه المنطقة تسلسل متعددة الموسومة المواقع (STSS) الحالية في كل من BP2 وBP3، توحي حدث الازدواجية الجيني. أظهرت الدراسات FISH البيني 4:57 النسخ على 15q11-Q13، نسخة واحدة على 16p11.1-p11.2 ونسخة واحدة على 15q24 في الضوابط العادية، في حين أظهر التحليل على اثنين من الدرجة الأولى المرضى الحذف فقدان ما يقرب من ثلاث إشارات في 15q11-Q13 على homolog واحد. وقد لوحظت إشارات FISH متعددة أيضا في المناطق orthologous إلى كل من الكروموسومات البشرية 15 و 16 في الرئيسيات غير البشرية، بما في ذلك قرود العالم القديم، مما يشير إلى أن الازدواجية في هذه المنطقة قد وقعت قبل ~20 مليون سنة. أظهر BAC / PAC contig لقطاع الجيني المكررة (duplicon) بحجم ~400 كيلوبايت. والمثير للدهشة، تم العثور على duplicon لاحتواء ما لا يقل عن سبعة مختلف العلامات تسلسل أعرب تمثل متعددة الجينات / الزائفة الجينات. وأظهرت مقارنة تسلسل STSS تضخيمها من الحيوانات المستنسخة YAC تعيين فريد لBP2 أو BP3 نسختين مختلفة من duplicon داخل BP3، في حين تتألف BP2 نسخة واحدة. ومقلوب اتجاه BP2 وBP3 بالنسبة لبعضها البعض، في حين أن النسختين داخل BP3 هي في وقت واحد. وجود قطاعات المكررة كبيرة على الصبغي 15q11-Q13 يوفر آلية لمثلي أحداث إعادة التركيب غير المتكافئة التي قد توسط في إعادة ترتيب متكررة لاحظت لهذا الكروموسوم.
هي سبب المتلازمات الجينية متجاورة من قبل الحذف أو الازدواجية في مناطق واسعة من الجينوم البشري التي تنطوي على الجينات لا علاقة متعددة متجاورة فعليا على الكروموسوم. واحدة من الأماكن الأكثر شيوعا لإعادة ترتيب هو 15q11-Q13، حيث تشوهات هيكلية متعددة، بما في ذلك الحذف، الكروموسومات علامة الزائدين، الازدواجية، triplications ونقل المواقع، ويلاحظ. الحذف من خلالي حساب 15q الأقرب لل~70٪ من كل من متلازمة برادر ويلي (PWS) ومتلازمة أنجلمان (AS) مريض، مع تردد حذف المقدرة ~1 / 10 000 ولادة حية (مراجعة في المرجع
1). A النتائج حذف الأب في PWS، في حين أن النتائج حذف الأمهات في AS، بسبب يطبع الجينومية في هذه المنطقة
(2، 3). بالإضافة إلى الأحداث حذف الترددات العالية، كروموسوم 15 حسابات ~50٪ من مجموع الكروموسومات علامة الزائدة التي لوحظت في الرجل
(4). تردد المقدرة للعلامات كروموسوم 15 مشتقة، ويشار إلى الجرد كما الحزب الاتحادي الديمقراطي
(15)، هو ~1 / 5000 ولادة حية
(4). وتشمل إعادة ترتيب أقل تواترا من هذه المنطقة نفسها من كروموسوم 15 الازدواجية
(5 -
9) وtriplications
(9 -
11).
تشير أدلة متزايدة على وجود أربعة "النقاط الساخنة" محددة أو مجموعات نقطة توقف تقع في 15q القريبة. باستخدام طول تقييد جزء تعدد الأشكال (RFLP) تحليل، الربوة
وآخرون. (12) حددت أول فئتين من AS الحذف (الدرجة الأولى والثانية) على أساس مجموعتين توقف الداني، المرافقة S18، مع التوحيد واضحا في مدى الحذف على القاصي الجانب. Kuwano
وآخرون. (13) تستخدم مضان
التهجين في الموقع (FISH)
التحليل في تحديد نقطة توقف الداني المشتركة ضمن YAC استنساخ واحد (y254B5)، في 10/10 PWS / AS المرضى الحذف، ونقطة توقف البعيدة المتكررة داخل YAC واحد (y93C9)، في 8/9 حالات الحذف، بما يتفق مع وجود "النقاط الساخنة" من إعادة ترتيب في هذه المواقع.
وقد تم إنشاء أول contig الجيل YAC من كروموسوم المنطقة 15q11-Q13 في عام 1993 الذي تضمن العديد من الثغرات وعدد قليل من الواسمات الوراثية متعددة الأشكال مفيدة لرسم خرائط المناطق نقطة توقف
(14). وقد وضعت الواسمات الوراثية الإضافية من نهاية القريبة من contig وتستخدم لتحليل المرضى المعروف لاحتواء الحذف من هذه المنطقة التي كتبها FISH
(15). وأظهر تحليل الصغرية من 53 PWS و33 مريضا AS حذف 44٪ ليتم حذفه لS542 (الدرجة الأولى)، في حين أن 56٪ لم يتم حذف (الدرجة الثانية)
(15). يشار إلى موقع الكسر للمرضى من الدرجة الأولى على أنها نقطة (BP) 1 وموقع الكسر لمن الدرجة الثانية المرضى ويشار إلى BP2. وهكذا، كل PWS وAS حذف الحالات تظهر التناسق الملحوظ في حجم الحذف وتحديد المناطق الساخنة لثلاثة الكروموسومات الكسر في المنطقة the15q11-Q13، يشار إليها فيما BP1، BP2 وBP3.
يبدو ترتبط نقاط التوقف تتفق أيضا مع الجرد الحزب الاتحادي الديمقراطي
(15) علامة كروموسوم، وإنتاج صنفين حجم الأولية التي ترتبط withphenotype
(+16 -
19). الجرد الحزب الاتحادي الديمقراطي (صغيرة
15) الكروموسومات لا تحتوي على PWS / AS المنطقة الحذف المشتركة، وعادة ما ترتبط مع النمط الظاهري العادي. FISH وتحليل الصغرية من 18 الصغيرة للإستثمار الحزب الاتحادي الديمقراطي
(15 أظهر) الكروموسومات أنها تنطوي على إعادة ترتيب في نفس منطقتين توقف القريبة (BP1 وBP2) وجدت في PWS / المرضى AS الحذف
(18).
وتقع نقطة ساخنة الرابعة لكسر كروموسوم، BP4، بين S1031 وS1010، وهو نقطة توقف للإستثمار الحزب الاتحادي الديمقراطي (معظم كبيرة
15) الكروموسومات
(9)، وكذلك في بعض حالات الازدواجية وtriplication (9؛ بيانات غير منشورة). المرضى الذين يعانون من ثلاثة أو أربع نسخ المستمدة من أمهات / AS المنطقة الحرجة PWS يكون النمط الظاهري الشاذة التي تشمل تأخر في النمو أو التخلف العقلي، والمضبوطات والميزات التوحد مثل
(20، 21). نقاط الإيقاف تشارك في تشكيل الجرد الحزب الاتحادي الديمقراطي (كبيرة
15 قد بدأ) الكروموسومات في الآونة الأخيرة إلا أن تتميز وتظهر لإشراك إما BP3 أو BP4
(9، 19، بيانات غير منشورة).
الازدواجية الأمهات بما في ذلك PWS / AS المنطقة ايضا لوحظ في المرضى الذين يعانون من مرض التوحد التأكد نموذجي، في حين تظهر الأفراد وراثة نفس الازدواجية في الأصل لأب أن تكون طبيعية
(21). وتوقف البعيدة في الازدواجية الخلالي قد تنطوي إما BP3 orBP4
(+7 -
+9). ومن المثير للاهتمام، BP4 كما تورطت في المرضى الذين يعانون من triplications الأم من الأقرب 15q حيث ثلاث نسخ من المنطقة BP1-BP4 موجودة في كروموسوم المستمدة أمومي، موحية آلية مشتركة لإعادة ترتيب
(10، 11).
واقترح فرضية أن عدم الاستقرار الجيني في 15q11-Q13 قد يكون راجعا إلى عناصر الحمض النووي تتكرر في هذه المنطقة لأول مرة دونلون
وآخرون. (22). في هذه الدراسة، 10 كروموسوم تحقيقات 15 محددة، ووصف في وقت لاحق S9-S18
(23)، وقد وضعت من الحزب الاتحادي الديمقراطي (مرتبة تدفق كبيرة للإستثمار
15) مكتبات التخصيب كروموسوم فج
(22). تم تعيين استنساخ S9-S14 في المنطقة BP2-BP3، في حين تم تعيين S15-S18 خارجه
(22، 23). تم العثور على ثلاث الحيوانات المستنسخة غير محددة لتكون موجودة في نسخ متعددة، والتي يحتمل أن تشارك في المناطق نقطة توقف
(22).
دليل آخر على تسلسل نسخة متعددة يأتي من البيانات لأسرة جين تم تحديدها ضمن 15q11-Q13. استنساخ من مكتبة تسليخ مجهري القريبة 15q، MN7، حددت عائلة جينية مع 4:56 النسخ على 15q11-Q13 ونسخة واحدة على الأقل 16p11.2
(24). وقد تم تحديد اثنين من الحيوانات المستنسخة كدنا]، ورسم الخرائط واحد لكروموسوم 15 واحد لكروموسوم 16، وأشار تحليل الشمالي بحضور كل من 15 ونص 7 كيلو بايت على الصبغي 15
(24). نص 15 كيلوبايت يتوافق مع
HERC2 (المعروف أيضا باسم
ERY-1) الإنسان genein
(25، 26) وRJS (27) أو
herc2 (26) الجينات في الماوس، في حين أن كدنا] كاملة تقريبا للكيلو نسخة البشرية 7 (KIAA0393) ومتسلسلة من قبل ناغاسي
وآخرون. (28).
في الآونة الأخيرة، وضعنا ~4 ميغابايت YAC contig مفصل توفير أول خريطة كاملة ومتكاملة المادية للمنطقة 15q11-Q13
(29). أحد عشر تسلسل الموسومة المواقع (STSS)، بما في ذلك خمس علامات تسلسل أعرب (التكنولوجيات السليمة بيئيا)، كانت محلية بين S542 و S543، موقع BP2
(13، 15، 29). بشكل غير متوقع، تمديد هذه الخريطة أثبتت الازدواجية في كل STSS 11 بين S542 و S543 لالخميرة البعيدة الكروموسومات الاصطناعية (مراكز أنشطة الشباب) متداخلة y93C9، موقع BP3، وكشف عن جزء المكررة واسع في مواقع نقاط الإيقاف حذف مشتركة في PWS وAS. نحن الآن الحاضر تحليلا مفصلا الجزيئية وFISH من BP2 وBP3 شرائح تكرار المرتبطة نقاط التوقف الحذف المشتركة التي لوحظت في PWS وAS.
STS استنادا YAC رسم خرائط المحتوى
قدم contig YAC المتكاملة في المنطقة 15q11-Q13 إطار لبدء رسم الخرائط والاستنساخ من المناطق fourbreak نقطة. نحو هذا الهدف، تم إنشاء مسار تبليط الحد الأدنى من مراكز أنشطة الشباب تمتد من علامة معظم الداني، NIB1540، لS144، وتقع البعيدة إلى BP4، (لا تظهر البيانات). بشكل غير متوقع، والعديد من التكنولوجيات السليمة بيئيا تفاصيلها سابقا في هذه المنطقة، بما في ذلك A006B10، A008B26، SHGC15126 وSHGC17218 تم العثور على أن يكون حاضرا في مراكز أنشطة الشباب في مواقع BP2، BP3 وبعض في BP4
(الشكل 1 والبيانات لا تظهر). وعقب هذه النتيجة، جميع الحاضرين STSS في y931C4، موقع BP2، تم اختبار ضد مراكز أنشطة الشباب في BP3 (على سبيل المثال y943D8، y962D11 وy893H9). في البداية، تم العثور على 11 STSS لتعيين مراكز أنشطة الشباب في bothBP2 وBP3
(الشكل 1).
كان معروفا BP2 لتكون مترجمة بين S542 و S543
(15)؛ ومع ذلك، كانت المسافة بين هذه العلامات غير معروفة. تحديد التكنولوجيات السليمة بيئيا متعددة (SGC32610، SHGC15126، SHGC17218، A006B10 وA008B26)، ويحتمل أن تمثل جينات متعددة / الخادعة، سواء داخل المناطق BP2 وBP3 اقترح وجود شريحة كبيرة الجيني المكررة. تضمنت STSS تكرار الآخرين S15، S16 و S17، والتي يمكن أن تمثل تحقيقات multicopy المذكورة في الدراسة في وقت مبكر من دونلون
وآخرون (. 22)، MN7، والمعروف أن تكون موجودة في نسخ متعددة على 15q11-Q13
(+24 -
26)، واثنين من YAC ينتهي، 368H3L و166G7R. في الآونة الأخيرة، فإن مصطلح "duplicon" وقد استخدم لوصف الازدواجية في قطاعات الجينوم يحتوي على جينات غير المجهزة
(30). على الرغم من أن توصيف التكنولوجيات السليمة بيئيا متعددة في هذه المنطقة محدودة، وسنشير إلى هذا الجزء الجيني المكررة على 15q11-Q13 باعتباره duplicon.
الترتيب الأولي من علامات داخل contigs YAC في كل duplicon نسخة اقترح التوجه المقلوب BP2 نسبة إلى BP3
(الشكل 1). على سبيل المثال، تعيين S17 لy254B5 وy166G7 في النهاية البعيدة من BP2، ولكنها لم تعين y764C6 في النهاية البعيدة من BP3
(الشكل 1). لتأكيد توجه BP2 نسبة إلى BP3، وكان يستخدم S17 لتحديد الكروموسوم الاصطناعي البكتيري (BAC) استنساخ GS124B5 وGS246N13
(الجدول 1). وأشار رسم الخرائط STS هذه البكالوريا التي GS124B5 أظهرت النتائج PCR إيجابية ل166G7R، S17 و S543، ووضع هذه استنساخ على الحدود البعيدة من BP2
(الشكل 1). أظهر BAC GS246N13 النتائج PCR إيجابية لS17 و S931 (اكسون 3 من
P الجينات)، ووضع هذه استنساخ على الحدود القريبة من BP3، مما يؤكد التوجه المقلوب من BP2 نسبة إلى BP3
(الشكل 1). لتحديد عدد نسخة من duplicon داخل الصبغي 15، وكان أداؤها FISH باستخدام P 1 المستمدة من كروموسوم اصطناعي (PAC) GS7484، حدد مع STS 368H3L
(الشكل 1 والجدول 1). أظهر تهجين GS7484 على الثقافات الخلايا اللمفاوية العادية مجموعة كبيرة من الإشارات داخل المنطقة 15q11-Q13 على الكروموسومات الطورية
(الشكل 2 A). وقد لوحظت أيضا إشارات ضعيفة على 15q24 و16p11.1-p11.2. في الطور البيني نوى كانت هناك 3-5 إشارات بارزة في كل مجال كروموسوم 15
(الشكل 2 A، أقحم). لتأكيد عدد نسخة من GS7484 داخل 15q11-Q13، تم إجراء التهجين على G 0 / G 1 متزامنة نوى من خطين الليفية الطبيعية. في كل العينات كانت قيمة مشروط ثلاث إشارات مع مجموعة من 1-7 إشارات في كل كروموسوم 15 النطاق، بما يتفق مع النتائج التي لوحظت في الخلايا الليمفاوية (لا تظهر البيانات).
الشكل 1
STS المحتوى خريطة BP2 وBP3 duplicons. تتجه المنطقة من السنترومير (يسار) إلى شريط الحامض النووي (يمين). الأسهم الكبيرة في الجزء العلوي من هذا الرقم تشير إلى توجه اثنين من duplicons بالنسبة لبعضها البعض. وترد STSS عموديا مع التكنولوجيات السليمة بيئيا / أكدت الجينات. تحت STSS خطوط أفقية التي تمثل استنساخ الجينوم الفردية. تبدأ استنساخ YAC مع ذ، استنساخ BAC / PAC مع GS وcosmid مع ج. تمثل دائرة شغل في رد فعل PCR إيجابية للSTS على استنساخ اللزوم. ويمثل x تفاعل PCR سلبي ويمثل ساحة شغل في STS المتقدمة من نهاية استنساخ. المستطيلات أرفق استنساخ المستخدمة في التجارب FISH.
الجدول 1
استنساخ BAC / PAC المستخدمة في الدراسة
تحليل الصغرية السابق باستخدام علامات S542 S543 والمترجمة موقع الكسر لوحظ في الدرجة الثانية PWS وAS الحذف إلى نفس الموقع مثل duplicon BP2
(15). لمزيد من تقييم الارتباط من duplicons إلى PWS / AS الحذف، وكان يستخدم GS7484 باعتباره التحقيق FISH على اثنين من الدرجة الأولى واثنين من الدرجة الثانية مرضى الحذف. تم تنفيذ المشارك التهجين باستخدام استنساخ GS118I17، تحقيقا نسخة واحدة معزولة مع S1043، علامة تقع البعيدة إلى BP3
(الشكل 1 والجدول 1). يتم تقليل إشارة من GS7484 بشكل كبير في شدة على كروموسوم حذف 15 في اثنين من المرضى حذف الدرجة الأولى
(الشكل 2 B). في نوى البيني، وينظر إلى إشارات متعددة (وضع = 4) على الصبغي طبيعي، ولكن واحدا فقط إشارة خافت موجود على الكروموسوم حذف يتفق مع فقدان معظم إشارات GS7484 على homolog حذف
(الشكل 2 B). في المقابل، لا تزال هناك عدة إشارات من GS7484 على كروموسوم حذف في الدرجة الثانية مرضى الحذف
(الشكل 2 C)، بما يتفق مع وجود نسخة إضافية واحدة على الأقل من GS7484 المتبقية في الدرجة الثانية الحذف الذي هو غائب في الدرجة الأولى بالإضافة إلى أظهر GS118I17 شارك في التعريب مع GS7484 على الكروموسومات الطورية (لا تظهر البيانات)، ولكن إشارة واضحة على البيني النوى
(الشكل 2 B و C)، بما يتفق مع وثيقة، ولكن غير متداخلة، توطين GS118I17 نسبة إلى GS7484.
الرقم 2
(A) تحليل FISH على الطورية الطبيعية والخلايا البيني مبينا تسلسل تكرار. هو المسمى GS7484 مع digoxigenin والكشف مع رودامين مكافحة digoxigenin (أحمر)، andpMC15 (D15Z3)، كروموسوم 15 α التحقيق الأقمار الصناعية، وصفت مع البيوتين والكشف مع أفيدين-FITC (الخضراء). Inmetaphase الكروموسومات، ويظهر GS7484 مجموعة كبيرة من الإشارات الحمراء في المنطقة 15q11-Q13 (الأسهم الكبيرة) مع إشارة صغيرة في 16p11.1-p11.2 (الأسهم الصغيرة). جدا لوحظ ضعف التهجين أيضا على 15q24. في نواة الطور البيني (الشكل) ويلاحظ حوالي 3-5 إشارات حمراء سرية (السهام). (B) تحليل FISH على الدرجة الأولى المريض AS الحذف. هو المسمى GS7484 باللون الأحمر وBAC GS118I17، وتقع البعيدة إلى BP3، هو المسمى باللون الأخضر. من أجل الوضوح، وتظهر إشارات خضراء من GS118I17 فقط في نواة الطور البيني. في الطورية، يظهر GS7484 homolog واحدة (يسار) مع مجموعة كبيرة من الإشارات الحمراء وانخفاض ملحوظ شدة إشارة في homolog الثاني (يمين). في نوى البيني، GS7484 يظهر إشارات حمراء متعددة لأحد كروموسوم 15 (شغل في رأس السهم) مع وجود إشارة واحدة على homolog حذف (رأس السهم مفتوح). (C) تحليل FISH على الدرجة الثانية PWS حذف المريض. وصفت تحقيقات كما في (ب). يظهر GS7484 مجموعة كبيرة من إشارات حمراء على كل من الكروموسومات 15؛ ومع ذلك، فإن homolog مع الأقمار الصناعية البارزة (يسار) ويظهر إشارة أقوى من تلك التي على اليمين. في نوى البيني، GS7484 يظهر إشارات متعددة التهجين حمراء على احد كروموسوم 15 (شغل في رأس السهم) وعدد أقل من إشارات حمراء على homolog حذف (رأس السهم مفتوح). (D) الحفظ التطوري من duplicons في الرئيسات الأخرى. التهجين من GS7484 (أحمر) إلى الكروموسومات الطورية من الشمبانزي (P.troglodytes) يظهر إشارات حمراء متعددة في المنطقة pericentromeric من PTR16 (orthologous لالبشري 15q11-Q13) (الأسهم الكبيرة) وإشارات ضعيفة على PTR16 البعيدة (orthologous إلى القاصي 15q الإنسان ). ويلاحظ وجود إشارة ضعيفة إضافية بالقرب من السنترومير من PTR17 (orthologous إلى HSA16p11.2) (السهم الصغير). (E) التهجين من GS7484 (أحمر) لالطورية الكروموسومات من أكل سرطان البحر المكاك (M.fascicularis) إلى إشارات حمراء متعددة على MFA7 (orthologous إلى HSA15). إشارة صفراء واحدة في شريط الحامض النووي من MFA7 (السهام) إلى المشاركة في تهجين PAC GS158H23 (الأخضر) على نسخة التحقيق واحد يحتوي على UBE3A، مع إشارة حمراء من GS7484. لذلك، هذه المنطقة هي telomeric orthologous إلى HSA15q11-Q13. ويلاحظ إشارتين الحمراء إضافية على جانبي السنترومير من MFA7، المناطق orthologous إلى القاصي 15q. (F) البيني قياسات المسافة FISH من BP2 باستخدام الحيوانات المستنسخة المرافقة فريدة من نوعها. Cosmid 512 (الحمراء)، وGS5022 (الأخضر) تم تهجين لالمتعطشة المصل G نوى 0 / G 1 الليفية (السهام). Cosmid 512 أيضا عبر يهجن مع 16p13.1، وتنتج إشارتين إضافية في كل نواة البيني. من قياسات المسافة البيني، وتقدر المسافة الجينومية أن تكون ~250 كيلوبايت بين هذه التحقيقات اثنين. يمثل شريط 5 ميكرون. (G) البيني قياسات المسافة FISH من BP3 باستخدام الحيوانات المستنسخة المرافقة فريدة من نوعها. تم تهجين GS150L13 (الحمراء)، وGS72P22 (الأخضر) إلى مصل تجويع G 0 / G 1 الليفية نوى (السهام). من قياسات المسافة البيني، وتقدر المسافة الجينومية أن تكون ~500 كيلوبايت بين هذه التحقيقات اثنين. يمثل شريط 5 ميكرون.
الجدول 2
جديد كروموسوم 15q11-Q13 STSS
للبدء في تقييم أصل تطوري من الازدواجية الجينومية، تم إجراء تحليل FISH باستخدام GS7484 على الاستعدادات الطورية من اثنين من أنواع القردة الكبيرة الأخرى [الشمبانزي،
عموم سكنه الكهوف (PTR)،
والغوريلا الغوريلا (GGO)] وقرد العالم القديم [ المكاك أكل سرطان البحر،
المكاك fascicularis (MFA)]. وشوهدت إشارات متعددة على المناطق الكروموسومات orthologous على الكروموسومات البشرية 15 و 16 (HSA15 وHSA16) في الشمبانزي
(الشكل 2 D)، الغوريلا (لا تظهر البيانات) والمكاك
(الشكل 2 E).
في الشمبانزي معظم الإشارات GS7484 هي بالقرب من منطقة pericentric من PTR16، orthologous إلى HSA15q11-Q13
(الشكل 2 D). بالإضافة إلى ذلك، كان ينظر ضعيف عبر التهجين عند القاصي وPTR16q في السنترومير من PTR18، orthologous إلى HSA16p11
(31، 32)، بما يتفق مع الإشارات التي لوحظت في الإنسان
(الشكل 2 D). أحد السمات المميزة بين الإنسان
وP.troglodytes هي انعكاس pericentric على PTR16
(31 -
33)، الذي يضع أكثر من إشارة من GS7484 في PTR16p11-P12. سيكون من المثير للاهتمام أن يتكهن بأن هذا الحدث انعكاس والتي سهلت هذه duplicons لاحقا إلى الاختلاف في الشمبانزي والإنسان.
في الغوريلا، على التوالي، من المعروف أن الكروموسومات orthologous إلى HSA15 وHSA16، GGO15 وGGO17 أن يكون لها ربط والرسم الكروموسومات نمط مماثل لالبشري
(31، 32). وأظهر تحليل FISH في غوريلا باستخدام GS7484 نمط مماثل من التهجين لتلك التي لوحظت في الإنسان (لا تظهر البيانات).
المناطق orthologous بين الإنسان وأكل سرطان البحر المكاك تم التعرف بشكل جيد، على الرغم من بعض الاختلافات موجودة
(34). على سبيل المثال، فقد تبين الكروموسوم orthologous إلى HSA15 في المكاك، MFA7، من خلال الكروموسوم اللوحة أن يكون التماثل مع كل HSA14 وHSA15
(34). FISH باستخدام GS7484 وGS158H23، تحقيق السيطرة التي تحتوي على UBE3A
(35)، ويظهر تهجين قوي إلى التيلومير MFA7، orthologous إلى HSA15q11-Q13، فضلا عن اثنين من المواقع المقابلة لالقاصي HSA15q
(الشكل 2 E). وقد لوحظت اشارات ضعيفة أيضا على MFA20، orthologous إلى HSA16p11، بالإضافة إلى العديد من المواقع الأخرى. وجود نسخ متعددة من GS7484 في المناطق orthologous في
M.fascicularis لHSA15q11-Q13 غير موحية أن هذه الأحداث الازدواجية الجينومية قد حدثت قبل ~20-25 مليون سنة، قبل أن الاختلاف في قرود العالم القديم (Cercopithecidae) من عظيم القرود (الأناسيات)
(36). على الرغم من تعدد STSS قد تم تعيينها إلى كل من BP2 وBP3، لا يمكن تقدير أحجام duplicons من البيانات YAC contig
(الشكل 1). لذلك، تم الحصول على التقديرات الأولية حجم كل من BP2 وBP3 بواسطة قياسات المسافة البيني بين تحقيقات المرافقة لكل منطقة نقطة توقف. وبالنسبة للمنطقة BP2، GS5022 وcosmid 512 (c512)
(18)، وكلاهما ترتكز على STSS خارج المنطقة تكرار
(الشكل 1)، وتهجين لG 0 / G تم قياس 1 نوى الخلايا الليفية المتزامنة والمسافة بين الإشارات التحقيق (
الشكل 2 F). على الرغم من أن c512 عبر يهجن ضعيفة مع 16p13.1، كروموسوم 15 إشارات تم تمييزها بسهولة
(الشكل 2 F). وبناء على هذه القياسات، وBP2 تشير التقديرات إلى أن ~250 كيلو بايت في الحجم.
الشكل (3)
STS contentmap من 'contig مركب' من BAC واستنساخ PAC عبر BP2. تحت STSS هي خطوط أفقية تمثل استنساخ الجينوم الفردية (مراكز أنشطة الشباب / البكالوريا / PAC وcosmids). تمثل دائرة شغل في رد فعل PCR إيجابية للSTS على استنساخ اللزوم. ويمثل x تفاعل PCR سلبي ويمثل مربع صغير معبأ في STS المتقدمة من نهاية استنساخ. تمثل المسطر STSS التكنولوجيات السليمة بيئيا / الجينات الموجودة في duplicon.
لتقديم تقدير حجم الحد الأقصى لBP3، GS150L13، ترتكز على الجانب القريب للS931، وGS72P22، وتقع البعيدة لBP3
(الجدول 1 والشكل 1)، كانت تستخدم لتحقيقات المرافقة. أعطى كل BAC إشارة التهجين واحدة على الكروموسومات الطورية العادية وتحليل GS150L13 على PWS المرضى / AS حذف أكد الداني موقع لBP3
(الجدول 1 والبيانات لا تظهر). تظهر البكالوريا اثنين للمشاركة في توطين على الكروموسومات الطورية (لا تظهر البيانات)، ولكن في نوى البيني بشكل واضح يفصل
(الشكل 2 G). من هذه القياسات، ويقدر الحد الأقصى لحجم BP3 أن تكون ~500 كيلوبايت. وأشارت هذه القياسات المسافة البيني أن duplicon في BP3 قد يكون ضعف كبير مثل duplicon في BP2. ومع ذلك، لا يمكن استبعاد وجود فجوة بين GS72P22 والنهاية البعيدة من BP3.
وعلى الرغم من ترسو في contigs YAC لكلا BP2 وBP3، لا يمكن تحديد ترتيب علامات داخل المناطق بالنسبة لبعضها البعض بشكل لا لبس فيه
(الشكل 1). لذلك، تم بناء BAC / PAC contig لBP2 إلى غرامة رسم خريطة للduplicons. عروض الأولية للمكتبة BAC 2-3 × أثمرت كبيرة الإفراط في التمثيل من الحيوانات المستنسخة إيجابية لجميع duplifcated STSS تحليلها، بما يتفق مع عدة نسخ من هذه المناطق التواجد داخل الجينوم البشري. تم إجراء رسم الخرائط المحتوى STS باستخدام PCR لتحديد استنساخ متداخلة ونهايات والتسلسل BAC لخلق STSS جديد لإكمال "contig comfposite
'(الشكل 3 والجدول 2). كما رأينا من وجود نسخ متعددة من GS7484 بواسطة FISH
(الشكل 2 أ)، أي من هذه الحيوانات المستنسخة الفردية يمكن أن تنشأ من BP2، BP3 أو نسخ أخرى من duplicon
(الشكل 3 والجدول 2). ووصف الجهود المبذولة لتعيين استنساخ فريد لBP2 أو BP3 على أساس الاختلاف nucle-otide أدناه. حددت ترد في قائمة كاملة من البكالوريا الجديدة، الدوريات وSTSS
الجدولين 1 و
2. ويرد الحدود القريبة لBP2 داخل PAC GS5022، حدد باستخدام S18
(الشكل 3)، ويرد الحدود البعيدة داخل BAC GS124B5، حدد باستخدام S17
(الشكل 3). وجود BAC متعددة وPAC إنهاء الراسية STSS إلى مراكز أنشطة الشباب في كلا طرفي BP2 يوفر مستوى عال من الثقة في ترتيب العام للSTSS داخل هذه المنطقة.
مع الانتهاء من BAC / PAC contig عبر BP2، يمكن أن يتم تقدير حجم مستقلة عن duplicon استنادا إلى حجم مسار تبليط الحد الأدنى من BAC استنساخ / PAC في جميع أنحاء المنطقة
(الجدول 1). عدم تداخل البكالوريا GS179K9 (160 كيلوبايت) وGS253A21 (160 كيلوبايت) تغطية المنطقة BP2 مع ثلاث فجوات
(الشكل 3)، وتوفير تقدير حجم الحد الأدنى من 320 كيلو بايت. بالإضافة إلى ذلك، يرد الفجوة بين GS179K9 وGS253A21 داخل PAC استنساخ التسلسل تماما، pDJ778A2 (بنك الجينات انضمام رقم
AC004583). حجم 85 كيلو بايت في المنطقة بين MN7 (الموجود داخل GS179K9) وGS253A21-T7، جنبا إلى جنب مع كيلوبايت 320 وتقدر أعلاه، يوفر تقدير حجم الحد الأدنى من duplicon من ~400 كيلوبايت. التقدير البيني FISH (~250 كيلوبايت)، لذلك، من المرجح أن يكون أقل من الواقع من الحجم الحقيقي للduplicon، وربما يعود ذلك إلى خصائص كروموسوم التكثيف بالقرب من منطقة pericentromeric.
الجدول 3
EST / الجينات المحددة للBP2 / BP3
الجدول 4
تباين التسلسل STS
تم تعيين خمسة التكنولوجيات السليمة بيئيا في البداية إلى duplicon
(الشكل 3). لتحديد ما إذا كان أي من هذه التكنولوجيات السليمة بيئيا يتوافق مع نفس الجين، استنساخ جزئية كدنا] (800-1400 بي بي)، وهو ما يمثل 3'الغايات من النصوص، تم تحديد استخدام قاعدة بيانات Unigene
(37) والتسلسل
(الجدول 3). ثم تم إجراء مقارنات BLAST2 على جميع أزواج ممكن من تسلسل للكشف عن أي تداخل. تم العثور على كل تسلسل لتكون فريدة من نوعها مما يشير إلى أن تكون ممثلة أن خمسة جينات مختلفة / الكاذبة من قبل هذه التكنولوجيات السليمة بيئيا.
ثم تم إجراء عمليات البحث BLASTN لتحديد ما إذا كانت هذه متواليات [كدنا جزئية مطابقة أي الجينات المعروفة. تسلسل IMAGE استنساخ 321824، تحتوي على EST A006B10 تحديد MN7 واستنساخ [كدنا KIAA0393
(28)، مما يشير إلى أنها تمثل التكنولوجيات السليمة بيئيا مختلفة لنفس الجين
(الجدول 3). ومع ذلك،
HERC2، لم يكن التعرف على 15.0 كيلوبايت MN7 التي تحتوي على نص. بحث BLASTN من تسلسل KIAA0393 6.7 كيلوبايت لم تحدد
HERC2 (26) ولها
RJS الماوس homolog اسمه
(27) أو
herc2 (26) تشير إلى أن استنساخ 321824 ومحددة لنهاية 3'من KIAA0393. بالإضافة إلى ذلك، استنساخ BAC (CIT987-SKA-17E1؛ بنك الجينات انضمام أي
AC002041)، متسلسلة من كروموسوم 16p11.2، تم العثور على احتواء جزء من KIAA0393 (قواعد 59639-87 066)، S15 (قواعد 17449-17773، 94٪ الهوية) وGS7483-T7 (قواعد 36259-36507، هوية 93٪). وجود of~65 كيلوبايت التسلسل الجيني في boththe duplicon 15q11-Q13 والمنطقة pericentromeric من 16p11 يتسق مع البيانات FISH مشيرا إلى ازدواجية GS7484 إلى 16p11.1.
بحث BLASTN من IMAGE استنساخ 511845، تحتوي على تسلسل SHGC15126، حدد جين لم ينشر اسمه MYLE (بنك الجينات انضمام رقم
AF108145، قواعد 65-1053، 99٪ الهوية) وS16 (بنك الجينات انضمام رقم
AF017568 والقواعد 1-332، 94٪ الهوية). وأشارت البحث BLASTN لمدة ثلاث الحيوانات المستنسخة تمثل SHGC17218، SGC32610 وA008B26 thatthese ثلاثة cDNAs representdifferent، النصوص لم تكن معروفة سابقا
(الجدول 3).
تم تحديد التماثل تسلسل عالية لاثنين من جينات إضافية باستخدام تسلسل نهاية الدوريات GS7483 وGS7484 (GS7484-T7 وGS7483-SP6؛
الجدول 3). أظهر GS7484-T7 هوية 90٪ لجين uncharacterized تقع ضمن λ المناعي سلسلة ضوء موضع على 22q11 [بنك الجينات انضمام رقم
D88269، قواعد 5515-5644
(38)] مع التماثل إلى EST يمثل BEM-1 / BUD5 suppressor- مثل البروتين (بنك الجينات انضمام رقم
AA478019). أظهر GS7483-SP6 هوية 92٪ إلى ATP ملزم مرنا البشري البروتين كاسيت المترجمة إلى كروموسوم 1q42 (بنك الجينات انضمام رقم
U18237) (39). سوف تكون هناك حاجة مزيد من توصيف هذه التكنولوجيات السليمة بيئيا / cDNAs لتحديد أي من هذه قد تمثل الجينات الوظيفية. بالإضافة إلى ذلك، سوف تحتاج الأشكال الكشف عن هويته للتمييز تعبير ممكن من الجينات الوظيفية من نسخة duplicon أكثر من واحد.
و'contig مركب' إنشاء عبر BP2
(الشكل 3 لم) لا تسمح التعريب لا لبس فيه من 11 BAC استنساخ / PAC الواردة تماما داخل duplicon. استنساخ فقط GS5022 وGS124B5، على الداني والقاصي حدود BP2، على التوالي، يمكن تعيين فريد
(الشكل 3). لتحديد ما إذا كانت موجودة اختلاف تسلسل كافية بين BP2 وBP3 للسماح الخرائط الدقيقة لهذا أخرى 11 استنساخ وتسلسل أربعة STSS (S15، S16، S17 وMN7) قد أنجز على مراكز أنشطة الشباب ترتكز على أي BP2 أو BP3. أظهر جميع STSS أربعة اختلاف تسلسل تتراوح من شهر إلى ستة النيوكليوتيدات في BP2 وBP3 مراكز أنشطة الشباب
(جدول 4). وجود اثنين من سلاسل مختلفة داخل BP3 مراكز أنشطة الشباب لمدة ثلاثة STSS (S15، S16 وMN7) اقترح وجود نسختين مختلفة من duplicon في BP3. في دراسات سابقة، تم تحديد اثنين من سلاسل مختلفة لMN7 في yA86C1 وy962D11
(24، 25)؛ ومع ذلك، لم يتم تحديد المسافة بينهما. بالإضافة إلى ذلك، أشارت تسلسل فريدة من S16 موجودة في مراكز أنشطة الشباب y962D11 وy764C6 أن هذه مراكز أنشطة الشباب لم تتداخل مع بعضها البعض، وتوفير مزيد من الأدلة على وجود نسختين من duplicon داخل BP3
(التين 1 و
4).
الرقم 4
STS خريطة المحتوى، بما في ذلك التسلسل STSS، لBP2، BP3A وBP3B. تحت STSS هي الخطوط الأفقية التي تمثل الحيوانات المستنسخة الفردية (مراكز أنشطة الشباب / البكالوريا / PAC وcosmids). تمثل دائرة شغل في رد فعل PCR الإيجابي بين STS واستنساخ أشار ويمثل x تفاعل PCR سلبي. يمثل مربع صغير معبأ في STS المتقدمة من نهاية استنساخ والدوائر مفتوحة واسعة تشير STSS التي تم التسلسل. لاحظ أن واحدا فقط BAC استنساخ (GS179K9) من 'contig مركب'
(الشكل 3) ينشأ من المنطقة BP2، في حين أن الحيوانات المستنسخة متعددة تنبع من BP3A وBP3B، بما في ذلك GS119F13، الذي يمتد على نسختين داخل BP3. YAC y93C9 هو استنساخ يظهر لاحتواء BP3 بواسطة FISH (13) وحددت yA86C1 وyA168B8 باستخدام MN7
(24).
فرض غرامة على الخريطة البكالوريا لمناطق معينة BP، والتسلسل واحد على الأقل من أربعة STSS (S15، S16، S17 أو MN7) لجميع BAC / الدوريات
(جدول 4). وأظهر هذا التحليل أن استنساخ الوحيد GS179K9 نشأت من BP2، في حين أن 10 الحيوانات المستنسخة الأخرى المعينة لاثنين من مواقع مختلفة داخل المنطقة BP3
(الشكل 4 والجدول 4). على الرغم من أن العديد من مراكز أنشطة الشباب أظهرت وجود نسختين من S15 وMN7 (y962D11، y893H9 وA86C1)، أظهرت BAC / استنساخ PAC نسخة واحدة فقط من أي STS الفردية، مشيرا إلى فصل STSS تكرار لمسافة أكبر من حجم BAC استنساخ واحد. تسلسل S16 S17 وفي GS119F13، استنساخ التي لم تعين BP2، أشار موقع الذي يعبر الحدود بين نسختين من duplicon
(الشكل 4). وجود اثنين من سلاسل لS15 وMN7 في BP3 مراكز أنشطة الشباب مع تسلسل واحدة في استنساخ الفردية BAC يؤكد وجود نسختين من duplicon داخل BP3، التي سميناها BP3A وBP3B. الربط بين اثنين BP3 وduplicons بطريقة الرأس إلى الذيل في GS119F13 يدل على المباشر (جنبا إلى جنب) التوجه لBP3A وBP3B.
حتى وقت قريب، كانت قليلة نسبيا البيانات المتاحة على الآليات الجزيئية المتكررة إعادة ترتيب الكروموسومات الدستورية في البشر. وقد أدت خرائط مفصلة المادية من الكروموسومات البشرية إلى الاعتراف بأهمية منظمة الجينوم أو الهندسة المعمارية في آليات بعض الأمراض الوراثية البشرية
(40). وجود انخفاض في عدد النسخ، تسلسل كروموسوم معين DNA المتكررة يوفر فرصة للأحداث إعادة التركيب مثلي مما يؤدي إلى إعادة ترتيب الكروموسومات التي أحيلت إليها باسم "اضطرابات الجينوم"
(40)، لتمييزها عن آليات طفرية أكثر شيوعا المرتبطة أكثر الأمراض الوراثية المندلية.
هناك الآن العديد من الأمثلة المتكررة شذوذ الكروموسومات، بما في ذلك الحذف، الازدواجية والعكس، بوساطة نسخ متعددة من عنصر DNA مع التماثل تسلسل عالية. في معظم الأحيان، اختلالها من هذه السلاسل المتجانسة داخل منطقة الكروموسومات يؤدي إلى صرف الانتصافي غير المتكافئ. فإن المنتجات من هذه الأحداث إعادة التركيب مثلي أن يعتمد على: (أ) توجيه العناصر DNA. (ب) نوع الصرف حبلا الحمض النووي. و (ج) ما إذا كانت إعادة ترتيب هي أمور أو داخل الصبغي. عناصر الحمض النووي التي تتوسط هذه إعادة ترتيب قد تكون نسخا من الجينات ذات الصلة أو الخادعة (على سبيل المثال غلوبين)، ويتخلل شيوعا يكرر (على سبيل المثال ألو أو عناصر خط) أو غيرها من نسخة منخفضة يكرر كروموسوم معين
(40 -
42).
النموذج الكلاسيكي الآن لتكرار كروموسوم معين التوسط إعادة التركيب مثلي غير المتكافئ هو نوع متلازمة شاركو ماري توث 1A (CMT1A) والاعتلال العصبي وراثي مع المسؤولية ليشل الضغط (HNPP)
(43). CMT1A وHNPP نتيجة من الازدواجية وحذف الأحداث متبادلة، على التوالي، التي تنطوي على المنطقة ميغابايت 1.5 على 17p11.2 يحيط بها نسختين من سلسلة تكرار 24 كيلو بايت (CMT1A-REP) مرتبة في التوجه المباشر
(43، 44). اختلال بين الصبغيات وعبور أكثر داخل يكرر أثناء الانقسام الاختزالي I تنتج هذه الازدواجية وحذف الأحداث متبادلة. تم نقاط الإيقاف المعينة غرامة لمنطقة 557 نقطة أساس في حدود ممثلين CMT1A تحتوي على منطقة 456 نقطة أساس الهوية تسلسل مثالية. ويعتقد أن هذا يمثل شريحة معالجة فعالة الحد الأدنى، المطلوب لإعادة التركيب مثلي ويقع المجاور للعنصر
البحار العابر للposon مثل
(45). ومثل من كروموسوم معين انخفاض عدد النسخ يكرر المهيئة لإعادة ترتيب الكروموسومات غير أن نقص المرتبطة X السماك بسبب سلفاتاز الستيرويد (SS). ما يقرب من 90٪ من هؤلاء المرضى لديها 1.9 حذف ميغا بايت على Xp22.3 بوساطة يكرر VNTR مثل المرافقة فترة الحذف ويؤدي إلى الحذف التام من الجين
SS (46، 47).
في المقابل، عبور أكثر من تسلسل الحمض النووي المكررة التي هي في التوجه المقلوب يتوسط العكس الصبغي. هناك ثلاثة أمثلة مثل هذه متواليات تكرارها على القاصي XQ الذي توسط العكس وترتبط مع مرض وراثي. في الهيموفيليا A، ~45٪ من الطفرات هي نتيجة لحدث انقلاب تنطوي على نسختين من "الجين A '. يقع نسخة واحدة من هذا الجين في العامل الثامن الجينات، في حين تقع نسختين إضافية ~500 القاصي كيلو بايت في XQ
(48). وقد تم اقتراح آلية foldback الاقتران لجزء telomeric من XQ باعتبارها بنية وسيطة التي تبعتها الحدث عبر أكثر من بين اثنين من "جينات A 'نسخ
(48). وهذا يخلق انعكاس paracentric، مما يعطل العامل الثامن الجين عن طريق فصل الإكسونات 1-22 من الإكسونات 23-26
(48). وبالمثل، فإن الجينات نقص في متلازمة هنتر، وتعطلت iduronate 2-سلفاتاز
(IDS)، في ~13٪ من المرضى بسبب حدث انقلاب paracentric التي تنطوي على
IDS الزائفة الجين
(IDS-2)، وتقع 20 كيلو بايت البعيدة في المقلوب توجه
(49). الجين
emerin، المسؤولة عن الحجر-دريفوس ضمور العضلات، ويحيط بها نسختين من تكرار 11.3 كيلوبايت في التوجه المقلوب
(50). وقد أدى ذلك إلى تعدد الأشكال عكس الشائع، والذي ~33٪ من الإناث العادية هي متخالف لانقلاب paracentric. أكثر نادرا، وقد تم تحديد الحذف التام من الجين
emerin بسبب إعادة ترتيب أكثر تعقيدا في هذه المنطقة
(50، 51).
أن الصبغي عبور أكثر من duplicons مقلوب على كروموسوم 15 ويتوقع حدث انقلاب paracentric مماثلة لتلك التي لوحظت على Xq28. ومع أنه لم يتم الإبلاغ عن مثل هذه العكس، سيكون من الصعب للكشف من قبل معيار التحليل الصبغي G النطاقات والبحث المنهجي لأمر مقلوب من علامات الحمض النووي عن طريق FISH قد تكون ضرورية لمعالجة هذه المسألة. في المقابل، فإن الصبغيات عبور أكثر من هذه duplicons مقلوب يتوقع تشكيل الحزب الاتحادي الديمقراطي الجرد
(15)، بالإضافة إلى جزء لامركزي، وهناك حاجة إلى الأحداث الصرف حبلا DNA بديلة حتى للتوسط في الحذف الخلالي لوحظ في 15q11-Q13.
سيكون نموذج واحد لحدث حذف الصبغي بين duplicons مقلوب يتطلب foldback أو الجذعية حلقة بنية وسيطة، مع استئصال أو حذف جزء DNA "يحلق خارج 'التدخل. أفضل مثال يتميز هذا النوع من إعادة ترتيب هو V (D) J إعادة التركيب لاحظ مع الغلوبولين المناعي سلسلة الجينات الثقيلة والخفيفة
(52). بالإضافة إلى ذلك، تم اقتراح عدة أمثلة على الحذف في الإنسان كما يجري بوساطة هذه الجذعية حلقة وسيطة هيكل. في مقهورة الأحداث سحاف الكلية (NPH)، حذف متماثل من منطقة ~250 كيلوبايت على الصبغي 2q13 هي الآلية الأكثر شيوعا لاحظ تحور. ويحيط هذا الجزء المحذوف من قبل نسختين من ~100 كيلوبايت تكرار منطقة مرتبة في التوجه المقلوب
(53). وعموما، أظهرت 80٪ من الحالات الأسرية و 65٪ من حالات متفرقة من NPH وجود الحذف متماثل من هذه المنطقة
(53). في فرط كوليسترول الدم العائلي، تم الإبلاغ عن الحذف من مستقبلات LDL في الذي توسط في إعادة ترتيب من قبل عناصر ألو ترتيب التوجه inaninverted
(54).
الدعم لإعادة التركيب مثلي الصبغي ساطة بعض الحذف في PWS / AS يأتي من دراستين. في دراسة واحدة، تم تحديد أصل grandparental من الحذف في سبع عائلات PWS باستخدام علامات متعددة الأشكال المرافقة حذف
(55). وقد لوحظ إعادة التركيب بين الأليلات الكبرى الوالدي المرافقة موقع الحذف في خمس حالات (موح من الأحداث بين الصبغيات)، ولكن أظهر حالتين لا إعادة التركيب (بما يتفق مع حدث الصبغي)
(55). وفي دراسة مماثلة، وتحليل الأصل الكبير الوالدي في تسعة PWS / المرضى AS الحذف أظهر خمس حالات مع إعادة التركيب بين الأليلات grandparental وحالتين من دون إعادة التركيب
(9). معا، أربع حالات تتسق مع حدث حذف الصبغي، في حين أن 10 حالة توحي تبادل بين الصبغيات. ومع ذلك، في هذه الحالات 10 الأخيرة، لا يستطيع المرء أن يميز بين الصبغيات وحذف المرتبطة إعادة التركيب من حذف الصبغي بعد إعادة التركيب.
أن آلية الحذف بين الصبغيات كما يتوقع تشكيل المنتج ازدواجية المعاملة بالمثل، كما رأينا مع CMT1A / HNPP
(43). وقد لوحظ حالتين من حالات الازدواجية الخلالي على 15q11-Q13 التي تنطوي على BP3، بما يتفق مع هذا التوقع
(7). ومع ذلك، كما تم تحديد الازدواجية فراغي التي تنطوي BP4
(9)، مشيرا إلى آليات متعددة إنتاج هذه إعادة ترتيب. ارتفاع وتيرة PWS / AS الحذف [~1 / 10 000
(2، 3)] وندرة الحالات المبلغ عنها من ازدواجية فراغي 15
(59) تشير إلى أن آليات الصبغي قد يكون سبب شائع للحذف من 15q11-Q13. ومع ذلك، وعدم التثبت من الازدواجية 15 حالة قد يسهم أيضا في عدد أقل بكثير من الحالات المبلغ عنها.
حاليا، سبعة جينات / الخادعة، وقد تم تحديد والتي هي موجودة في كل من الداني (BP2) والبعيدة (BP3A / BP3B) المناطق. ثلاثة cDNAs (IMAGE 120151، 241447 و346304) تمثل النصوص غير معروفة، في حين أن اثنين آخرين (IMAGE 321824 و511845) تشبه إلى حد كبير إلى MYLE وتسلسل KIAA0393 مرنا، على التوالي. اثنين PAC ينتهي العرض هوية تسلسل عالية إلى BEM-1 / BUD5 القامع مثل البروتين (GS7484-T7) وATP ملزم البروتين كاسيت (GS7483-SP6)، وتقع على الكروموسومات الأخرى، وربما تمثل الكاذبة في-Q13 15q11 duplicons.
وقد تم تحديد واحد الجينات داخل duplicon وصف
HERC2 (26) أو
ERY-1 (25). ويرد A006B10 ضمن تسلسل KIAA0393، ونسخة 7.0 كيلوبايت تحتوي على MN7
(28)، ولكن ليس هذا الجين
HERC2 (26)، مشيرا إلى أن 7.0 و 15.0 كيلوبايت MN7 التي تحتوي على النصوص قد تمثل المنتجات تقسم بدلا من نفس الجين. وhomolog الماوس
لHERC2، يطلق
RJS (27) أو
herc2 (26)، وقد تم مؤخرا تحديد وخرائط لموقع واحد على الماوس كروموسوم 7 orthologous إلى BP3A
(28)، مما يوحي بأن BP3A هو duplicon السلفي في الإنسان. البيانات تسلسل [كدنا جنبا إلى جنب مع تحليل BLASTN جميع STSS يوضح وجود جينات متعددة / الخادعة في هذه duplicons مع وضعهم الوظيفي لم يتحدد بعد.
وقد أظهرت بيانات الخرائط المادي الأخيرة لعدة متلازمات microdeletion لوحظت في الإنسان إشراك قطاعات الجينومية المكررة كبيرة في نقاط التوقف حذف مشتركة
(40). وهذا يشمل متلازمة سميث Magenis (SMS) في 17p11.2، ومتلازمة وليامز (WS) في 7q11.2 ومتلازمة دي جورج (DGS) / VELO-القلب والوجه (VCFS) في 22q11.2. وأفضل وصف لهذه هو ~5 حذف ميغابايت المرتبطة SMS. تقع القسيم المركزي إلى المنطقة حذف / الازدواجية CMT1A / HNPP، ويحيط المنطقة الحذف SMS كتبها duplicons وصف-ممثلين SMS
(56). وقد وضعت contigs cosmid جزئي عبر-ممثلين SMS، وقدر أن يكون> 200 كيلو بايت في حجم
(40، 56)، ولكن توجه duplicons غير معروف حاليا
(56). أربع جينات،
SRP، TRE، KER وCLP، وتقع في كل من الداني والقاصي، ممثلين SMS وتحليل المرضى حذف SMS باستخدام مسبار
CLP كدنا] التعرف على مفترق جزء 1.2 ميغابايت الرواية في 29 من 31 مريضا تحليل
(56).
ويرتبط بمتلازمة وليامز مع الحذف من 7q11، بما في ذلك الإيلاستين
وLIMK1 الجينات، في> 90٪ من المرضى
(57 -
+59). اثنين من الجينات المكررة،
PMS2L وGTF2I، على حد سواء
موجودة في المناطق المحيطة في المنطقة الحذف WS، مما يوحي بأن duplicons يمكن أن تشارك في هذه إعادة ترتيب
(60 -
+62). تم الكشف عن رواية> 3 ميجا بايت تقاطع جزء في المرضى الذين يعانون حذف WS باستخدام مسبار [كدنا لIB291، وتقع ضمن المناطق المحيطة تكرار
(62).
ترتبط اثنين الحذف إما 3.0 أو 1.5 ميجا بايت على 22q11.2 مع DGS / VCFS
(63). المنطقة نقطة توقف الداني هو نفسه في كل من الحذف. ومع ذلك، لوحظ اثنين من نقاط التوقف البعيدة مختلفة. وقد حدد التوصيف الأولي لحذف كبير ~300 duplicons كيلوبايت ترتيب جنبا إلى جنب في مواقع إعادة ترتيب والتي تحتوي على ما لا يقل عن خمسة جينات / الخادعة
(64). ومن المثير للاهتمام، والزائدين علامة 22 الكروموسومات، لوحظت في متلازمة عين القط، وتنطوي على نفس المناطق نقطة توقف لوحظ في الحذف DGS / VCFS
(65)، وربما يشير إلى آلية مماثلة لتشكيل مثل الكروموسومات علامة الزائدين الصغيرة والكبيرة المتأتية من 15q11- Q13
(17).
حقيقة أن هذه المتلازمات microdeletion المشتركة الأربعة كلها تقع على مقربة نسبيا في المنطقة pericentromeric من كروموسوم يثير تساؤلات مثيرة للاهتمام بشأن آلية الازدواجية في هذه القطاعات الجينومية كبيرة. تظهر دلائل على أن المناطق pericentromeric، يقع بالقرب من صفائف قمرا صناعيا للالقسيم، تحتوي على نسخ paralogous من المناطق الكروموسومات تتكرر وtranslocated من مواقع أخرى داخل الجينوم البشري
(30). ومن المعروف أن منطقة pericentromeric من كروموسوم 15 لاحتواء نسخ جزئية من الغلوبولين المناعي السلسلة الثقيلة V وشرائح D
(66، 67)، الخادعة
NF1 (+68 -
70) والخادعة
GABRA5 (71). بالإضافة إلى ذلك، في حين أن نسخة واحدة من MN7 موجودة في الماوس، وتقع في منطقة syntenic مع موقع BP3A، نسخ متعددة موجودة في الإنسان بالقرب من المناطق pericentromeric على حد سواء 15q11.2 و16p11.2
(24). وD15S543 الصغرية، يقع البعيدة إلى BP2، هي أيضا موجودة على 16p13، مما يدل على أن الحدث الازدواجية الثاني بين كروموسوم 16 و 15q11.2. وتشير هذه البيانات إلى أن الازدواجية في مناطق الجينوم كبيرة بالقرب من المناطق شبه القسيم المركزي، يمكن أن تخلق عدم الاستقرار الجيني، الذي قد يؤهب لمزيد من إعادة ترتيب الكروموسومات.
استنساخ الجينومية
مراكز أنشطة الشباب المستخدمة في هذه الدراسة هي مستمدة من CEPH MARKI، CEPH مارك الثاني أو مكتبات سانت لويس وتم تعيينها من قبل STS الكتابة كريستيان
وآخرون. (29). وقد تم تحديد YAC yA162B8 باستخدام STS MN7
(24). تم الحصول عليها من مراكز أنشطة الشباب إما كلية بايلور لمركز طب الجينوم (هيوستن، TX)، والمعهد القومي للبحوث الجينوم البشري (NIH في بيثيسدا، MD)، أبحاث علم الوراثة (هانتسفيل، AL) أو CEPH (باريس، فرنسا).
وقد تم تحديد PAC GS5022 عن طريق فحص مكتبة P1 البشري الإجمالية باستخدام STS D15S18 (نظم الجينوم، سانت لويس، MO). وهذه نسخة نشرت من قبل هوانغ
وآخرون. (18) كما استنساخ 770c6. تم عزل الدوريات GS7483 وGS7484 من المكتبة P1 نفسها باستخدام STS 368H3L. وقد تم تحديد Cosmid 512 (c512) باستخدام STS S543 كما هو موضح سابقا
(18). تم تحديد جميع البكالوريا عن طريق PCR فحص مكتبة BAC الإنسان الإجمالية (نظم الجينوم)، وذلك باستخدام STSS المدرجة في
الجدول 1. تم عزل الحمض النووي من الحيوانات المستنسخة الجينومية باستخدام اوتوغن 740 (المتكاملة فصل الأنظمة، ناتيك، MA).تم إجراء التحجيم من الحيوانات المستنسخة BAC / PAC من قبل هضم الحمض النووي 1 ميكروغرام مع
عدم I لمدة 3 ساعات ويفصل على 1.0٪ SeaKem GTG agarose هلام (FMC المنتجات الاحيائية، روكلاند، ME) باستخدام جهاز بيو راد الشيف مخطط (بيو راد، هرقل، CA) مع وضع صناعة السيارات في خوارزمية تتراوح 5-300 كيلو بايت في 14 ° C. كانت ملطخة المواد الهلامية مع بروميد إيثيديوم، تصور على UVP GDS8000 نظام التوثيق هلام (UVP، المرتفعات، CA) والأحجام التي يحددها الاستقراء مع علامات حجم المعروفة.
وقد وضعت STSS جديدة من خلال تسلسل نهايات البكالوريا GS52I3، GS124B5 وGS229K19 والدوريات GS7483 وGS7484
(الجدول 2). لفترة وجيزة، تم عزل BAC DNA باستخدام اوتوغن 740 وتنقيته باستخدام Microcon 100 microconcentrators وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (المركزي Amicon، بيفرلي، MA). استخدمت واحد ميكروجرام من الحمض النووي BAC و 40 بمول من الاشعال في التسلسل مع مجموعة من ردود الفعل ABI بريزم BigDye المنهي دورة التسلسل جاهزة وتحليلها باستخدام ABI 377 المنظم DNA الآلي (النظم البيولوجية التطبيقية، فوستر سيتي، كاليفورنيا). وقد صممت STS الاشعال باستخدام برنامج Primer3 من معهد وايتهيد، معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (MIT؛
http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin...rimer3_www.cgi). وقد قدمت سلاسل كاملة لينتهي BAC لبنك الجينات مع الأرقام الانضمام المدرجة في
الجدول 2. وقد beendescribed جميع STSS أخرى سابقا (29).
وقد تم تحليل عشرة ردود الفعل ميكروليتر التي تحتوي على 1.0 ميكرولتر بيركن إلمر 10 × العازلة 1200 μMdNTP خلط، 0.5 ميكرومتر التمهيدي، 0.5 U Amplitaq الذهب (بيركن إلمر، فوستر سيتي، كاليفورنيا) و5-25 DNA قالب نانوغرام لكل STS ضد جميع مراكز أنشطة الشباب، والبكالوريا رسم الخرائط الدوريات في هذه المناطق. تم إجراء تحليل PCR وكما هو موضح سابقا (29).
FISH
وتم التحضير كروموسوم من الدم المحيطي أو خطوط الخلايا lymphoblastoid من الضوابط العادية وPWS / AS المرضى حذف باستخدام أساليب القياسية. وبالإضافة إلى ذلك، أدلى الاستعدادات الطورية من خطوط الخلايا lymphoblastoid من الشمبانزي العادي
(P.troglodytes) والغوريلا
(G.gorilla)، فضلا عن خط الخلية الليفية من المكاك أكل سرطان البحر
(M.fascicularis) (GM03446؛ Coriell معهد للبحوث الطبية، كامدن، NJ). وضع العلامات التحقيق، وأجريت تهجين الحمض النووي والكشف عن الأجسام المضادة من استخدام الأساليب المذكورة سابقا (72). وقد تم تحليل الشرائح FISH باستخدام مجهر زايس Axiophot مع مرشحات للكشف عن دابي، FITC ورودامين على حدة وكذلك ممر الموجة مرشح الثلاثي (أي 83000؛ تقنية كروما، براتلبورو، VT) للكشف عن الإشارات في وقت واحد. وقد تم جمع الصور ودمجها باستخدام كاميرا CCD تبريد (KAF 1400؛ Photometrics، توسن) وIP مختبر الطيف (اشارة تحليلات، فيينا، VA) أو المزح البرامج mFISH (Vysis، داونر غروف، IL). وقد تم تحليل لا يقل عن 10 خلايا المرحلة الفوقية لكل التحقيق للتحقق من موقع التحقيق والكشف عن أي التهجين عبر لالكروموسومات الأخرى. D15Z3 (pMC15)، وهو مسبار قمر صناعي للكروموسوم 15
(73)، وأضيف إلى حل التهجين للمساعدة في تحديد الهوية. إذا ظهر التحقيق لإعطاء إشارات متعددة على الصبغي 15، تم فحص نوى البيني إضافية.
لمسافات الجينومية في نطاق 50 كيلو بايت، 2 ميجا بايت، والمسافة الجسدية بين زوج من تحقيقات في الطور البيني (أي البيني المسافة أو ID) يرتبط المسافة الجينومية (74). تم تهجين تحقيقات المسمى مع أي البيوتين أو digoxigenin في أزواج لG 0 / G 1 تم قياس نوى الخلايا الليفية المتزامنة والمسافة بين الإشارات التحقيق باستخدام الأمر طول مقياس الواردة في IP مختبر الطيف حزمة برامج V.3 (اشارة تحليلات). تم معايرة الأمر طول المقياس باستخدام صور من مرحلة ميكرومتر زايس وقيست لا يقل عن 60 مسافات البيني لكل زوج من تحقيقات. وقدرت المسافة الجينومية من منحنى المعايرة ولدت في مختبرنا باستخدام cosmids من 4p16.3، التي كانت تستخدم سابقا لتوليد العلاقة بين المسافة البيني يعني مربع والمسافة الجينومية (75).
التسلسل من الحيوانات المستنسخة الجينومية
استخدمت ردود الفعل PCR باستخدام أربعة STSS (S15، S16، S17 وMN7) لتضخيم DNA من YAC، BAC واستنساخ PAC. أجريت ردود الفعل في 100 ميكرولتر ردود الفعل عن طريق التوسع في الظروف المشار إليها أعلاه. تم تنقية المنتجات PCR باستخدام Microcon 30 أو Microcon 100 مرشحات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (المركزي Amicon). تم معلق العينات إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر، واستخدمت 5 ميكرولتر التصور على 1.0٪ هلام الاغاروز للتحقق من وجود فرقة واحدة. تم quantitated المنتجات PCR ومن ثم التسلسل باستخدام مجموعة من ردود الفعل ABI بريزم BigDye TerminatorCycle التسلسل جاهزة وABI 377 المنظم DNA الآلي (النظم البيولوجية التطبيقية).
التسلسل من الحيوانات المستنسخة كدنا]
تم الحصول على استنساخ الموافق التكنولوجيات السليمة بيئيا SHGC17218 (IMAGE 346304)، SHGC15126 (IMAGE 511845)، SGC32610 (IMAGE 241447)، A006B10 (IMAGE 321824) وA008B26 (IMAGE 120151) من نوع الثقافة مجموعة أمريكا (روكفيل، MD) أو أبحاث علم الوراثة ( صيد فيل، AL). تم عزل الحمض النووي من 3 مل الثقافات من الحيوانات المستنسخة [كدنا 241447 و321824 باستخدام اوتوغن 740 في الحجم الكلي لل50 ميكرولتر. كان DNA النقي وتتركز باستخدام Microcon 100 مرشحات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (المركزي Amicon). واستخدمت aliquots من 1.5 ميكرولتر من التركيز DNA و 40 بمول من T3 أو T7 التمهيدي لتسلسل كل نهاية استنساخ باستخدام مجموعة من ردود الفعل ABI بريزم BigDye المنهي دورة التسلسل جاهزة وABI 377 الآلية المنظم DNA. تحليل تسلسل باستخدام Sequencher 3.1 (رموز الجينات، آن أربور، MI) لم يشر إلى التداخل في تسلسل، لذلك تم تصميم الاشعال جديدة لنهاية 3'من تسلسل باستخدام برنامج Primer3 من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا. تم إجراء جولة ثانية من التسلسل وأكد Sequencher 3.1 التحليل الانتهاء من تمرير تسلسل واحد. تم تنفيذ واحد تمريرة التسلسل على استنساخ 120151، 346304 و511845 من مصدر تجاري (SeqWright، هيوستن، TX).
ونود أن نشكر جولي Kuc للحصول على المساعدة الفنية للخبراء. تم تزويد cosmids 4p16.3 بسخاء من قبل B. Traskand M. ماكدونالدز. وأيد هذا العمل في جزء من منحة HD36111 المعاهد الوطنية للصحة.