عرض مشاركة واحدة
  #14  
قديم 11-22-2015, 10:57 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي تفاعل اثنين وراثية المنتجات الشلل النصفي التشنجي الجينات، spastin وatlastin، يشير إلى وجود مسار مشترك لصيانة محور عصبي

 

http://www.pnas.org/content/103/28/10666.full

ملخص

الشلل النصفي التشنجي وراثي (HSP) هو اضطراب الاعصاب التي تتميز تنكس محور عصبي الوراء الذي يؤثر على الخلايا العصبية في المقام الأول في العمود الفقري طويلة. هذا المرض هو غير متجانس سريريا، وهناك> 20 المواضع الجينية التي تم تحديدها. هنا، وتبين لنا التفاعل الجسدي بين spastin وatlastin، وهما جسمية مهيمنة منتجات الجين HSP. Spastin يشفر أنيبيب (MT) -severing AAA أتباز (أتباز المرتبطة بالأنشطة المختلفة)، وatlastin يشفر بروتين الغشاء لا يتجزأ GTPase المترجمة جولجي. Atlastin لا تنظم النشاط الأنزيمي من spastin. حددنا أيضا طفرة السريرية في atlastin خارج المجال GTPase الذي يمنع التفاعل مع spastin في الخلايا. ولذلك، فإننا نفترض أن عدم التفاعل المناسب بين هذين HSP منتجات الجينات قد تكون ذات صلة pathogenetically. وتشير هذه البيانات إلى أن ما لا يقل عن مجموعة فرعية من الجينات HSP قد تحدد مسار بيولوجي الخلوية التي أمر مهم في صيانة محور عصبي.
وراثي الشلل النصفي التشنجي (HSP) هو اضطراب وراثيا وغير متجانسة سريريا أن يتميز سريريا من قبل مشية تشنجية، حسي اهتزازي معتدل، والإلحاح البولي ومرضي من قبل axonopathy رجعية أن ينطوي في المقام الأول على الخلايا العصبية طويلة من الجهاز القشري والحزمة الناحلة (1 ). هناك> 20 جينات مرتبطة HSP. وقد وصفت لم التفاعل الجزيئي بين أي من البروتينات المشفرة بواسطة هذه الجينات.
بصفة عامة، وقد أدت وظائف ثبت أو الاستدلال من الجينات HSP إلى عدة فرضيات واسعة حول المرضية الجزيئي للHSP. وقد اقترح HSP أن يكون اضطراب الميتوكوندريا، استنادا إلى حقيقة أن اثنين من الجينات HSP، paraplegin (2) وmtHSP 60 (3)، هي بروتينات الميتوكوندريا مع الأدوار في مراقبة الجودة من البروتين وقابلة للطي. الطفرات في KIF5a، وهو كينيسين التقليدية التي يتم التعبير بشكل كبير في الخلايا العصبية، يسبب HSP (4)، مما يدل على أن نقل محور عصبي ضعف قد تكمن وراء بعض أشكال المرض. الطفرات في spastin (SPG-4)، وهو AAA أتباز (أتباز المرتبطة بالأنشطة المختلفة)، يسبب 40٪ من حالات جسمية مهيمنة من HSP (5). نحن وغيرنا قد أظهرت أن spastin هو أنيبيب (MT) انزيم -severing وأن الطفرات المرض يضعف هذا النشاط (6، 7).
وترتبط العديد من الجينات HSP مع مختلف العضيات غشائي ولقد استنتج الأدوار في الاتجار حويصلي. Spastin وspartin (SPG-20) (8)، جين آخر HSP، سواء تحتوي على معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (أنيبيب التفاعل والنقل) المجال (9)، والتي كثيرا ما وجدت في البروتينات المرتبطة الاندوسوم، بما في ذلك Vps4، وهو AAA أتباز أن يفكك ESCRT (endosomal الفرز المعقدة اللازمة لنقل) مجمعات البروتين كجزء من مسار الجسم عديد الحويصلات (10). MIT Spastin ويربط CHMP1B (11)، واحد من عائلة من البروتينات المتورطين في مسار الجسم عديد الحويصلات. الطفرات في atlastin (12)، والغشاء لا يتجزأ من البروتين GTPase الذي المترجمة في المقام الأول إلى جهاز جولجي (13)، كما يسبب HSP. الطفرات في alsin، التي لديها راب 5 وراك جوانين مجالات تبادل النوكليوتيدات، تشير إلى أن وجود خلل في الاتجار داخل الخلايا قد يسبب HSP (14، 15).
سريريا، يمكن HSP يكون المتغير فيما يتعلق عمر البدء، انتفاذ، التعبيرية من النمط الظاهري، ومجموعة من التشوهات العصبية الموجودة في المرضى. ونظرا لعدم التجانس وفرضيات لا تعد ولا تحصى من الأساس الجزيئي لفقدان محور عصبي في HSP، ينشأ السؤال المركزي حول ما درجة غير HSP مرض واحد. وبعبارة أخرى، القيام بأي أو بعض هذه الجينات مرض تعمل معا في المسار الخلوي واحد وظيفتها مهم في صيانة محور عصبي؟ التفاعل وصفنا بين spastin وatlastin تشير إلى أن مجموعة فرعية من منتجات الجين HSP قد تعمل بهذه الطريقة.
النتائج

لتحديد البروتينات التفاعل spastin، أجرينا الخميرة شاشة يومين الهجينة التي تستخدم بالطول spastin كطعم. فحص حقق 12 استنساخ المستقلة، واحدة منها المشفرة جزء من atlastin-1 (الشكل 1 A). مثل spastin، atlastin هو الصفة السائدة HSP الجين (12). Atlastin هو لا يتجزأ GTPase بروتين الغشاء جولجي المترجمة (13). كان استنساخ استردادها في إطار ويفتقر المجال GTPase لكن ترميز اثنين من شرائح الغشاء والذيل حشوية (C-الذيل) من atlastin. حذف المجال-C الذيل من هذا استنساخ (496 إيقاف) في atlastin-1 البشري إلغاء التفاعل في الخميرة فحص اثنين من الهجين (الشكل 1 A).

تين. 1.
Spastin-atlastin التفاعل. (A) A الخميرة الشاشة هجين اثنين حددت atlastin باعتباره interactor لspastin. وقد استخدم كامل طول spastin الإنسان كطعم وتفاعلوا مع ترميز استنساخ الأحماض الأمينية 408-558 من atlastin-1 البشري. وقد استخدمت هذه استنساخ ومتحولة الحذف تفتقر إلى C-ذيل atlastin (ΔCtail) لretransform الخميرة في فحص اثنين من الهجين. استنساخ الأصلي، ولكن ليس استنساخ ΔCtail، تفاعلت مع spastin في هذا الاختبار. (B) Coimmunoprecipitation من spastin وatlastin. خلايا هيلا وعابر. لمدة 24 ساعة مع 2HA-spastin وإما atlastin-صاحب-6X (المحللة 1) أو صاحب-6X الموسومة β-غال (المحللة 2) كوسيلة لمراقبة سلبية. تعرض لست] الخلية إلى مناعي مع الأجسام المضادة له-6X تليها مكافحة HA (يسار) أو مكافحة صاحب-6X (يمين) النشاف الغربي. وأعرب كلا لست] المبالغ المعادلة من HA-spastin (SM) وspastin coimmunoprecipitated مع atlastin ولكن ليس بيتا غال. في 50- وشرائح 20 كيلو دالتون هي سلاسل الثقيلة والخفيفة IG. (C) Coomassie هلام الزرقاء الملطخة تبين أن spastin بربط atlastin C-الذيل. تم المشقوق ضريبة السلع والخدمات من GST-spastin بدقة البروتيني (PP)، وخليط التفاعل الخام (حارة 3) تحتوي على 10 ميكروغرام من spastin تم تطبيقها على حبات الجلوتاثيون سيفاروز تحتوي على 10 ميكروغرام من GST-atlastin C-الذيل أو ضريبة السلع والخدمات وحدها ( الممرات 4-6) في إجمالي حجم 200 ميكرولتر. الممرات 1 و 2 عرض عينات من الخرز التي تحتوي على GST atlastin الوحيد C-الذيل أو ضريبة السلع والخدمات. جميع spastin أضاف لكن أيا من GST المشقوق أو PP منضمة إلى atlastin C-الذيل، وATP لم يكن مطلوبا للربط (قارن الممرات 4 و 5). وعلى النقيض من GST-spastin، لا يحتوي على البروتين GST atlastin-C الذيل موقع انشقاق PP.

المقبل، ونحن cotransfected خلايا هيلا مع البلازميدات ترميز spastin 2HA الموسومة وإما atlastin-6xHis أو β-غال-6xHis (الشكل 1 B). تعرض لست] توضيح لمناعي مع الأجسام المضادة لمكافحة 6xHis. جرى التحقيق Immunoprecipitates لspastin من قبل مكافحة هيماغلوتينين (HA) النشاف الغربي. Spastin coprecipitated مع atlastin ولكن ليس مع β-غال، على الرغم من أن أعرب عن البروتين السيطرة على مستوى أعلى من atlastin (الشكل 1 B). وأكد الغربية النشاف مع الأجسام المضادة لمكافحة HA أن كلا لست] أعربت المبالغ المعادلة من spastin. الأضداد HA الكشف عن شريطين المتعلقة spastin. على الرغم من أننا لا نعرف لماذا، ونحن نتصور أن الشريط العلوي قد تمثل صيغة معدلة posttranslationally من spastin. على الرغم من أنه يبدو كما لو سوى أقل الفرقة الزميلة مع atlastin، لا يمكننا استبعاد احتمال أن الشريط العلوي تربط لكن هذا لم نتمكن من الكشف عن ذلك بسبب وفرة أقل من هذا النموذج.
لأن الخميرة تحليل هجين اثنين أشارت إلى أن C-ذيل atlastin ملزم spastin، أنتجنا وتنقيته المؤتلف GST-atlastin C-الذيل. تم المشقوق شاردة GST الخروج من spastin المؤتلف مع البروتيني للموقع المحدد. تمت إضافة خليط التفاعل spastin / GST / البروتيني إلى يجمد حبة GST atlastin C-الذيل أو ضريبة السلع والخدمات. لا يحتوي على C-ذيل البروتين الانصهار GST atlastin موقع الدقة البروتيني، وبالتالي لم المشقوق من قبل البروتيني. Spastin متجهة إلى GST atlastin C-ذيل، ولكن ليس إلى GST، بطريقة ATP مستقلة، مما يدل على التفاعل المباشر (الشكل 1 C). أجرينا أيضا هذه التجربة مع كامل طول GST-spastin ثبتوا على حبات واستحوذ على كامل طول المالتوز المؤتلف البروتين atlastin ملزمة (في المخازن التي تحتوي على المنظفات) (انظر الشكل رقم 6، التي تصدر عن دعم المعلومات على شبكة الإنترنت PNAS موقع).
إضافة فائض المولي 10 أضعاف من GST-atlastin C-الذيل ولكن ليس GST تسبب زيادة طفيفة جدا في النشاط أتباز spastin في المختبر (الشكل 7، التي تصدر عن دعم المعلومات على الموقع الشبكي PNAS). بعد ذلك، طلبنا ما إذا كان هذا زيادة طفيفة في أتباز نتائج النشاط في تعزيز قطيعة MT. تحقيقا لهذه الغاية، ونحن المحتضنة ضريبة السلع والخدمات spastin مع، النظام التجاري المتعدد الأطراف استقرت التاكسول المسمى رودامين في غياب أو وجود فائض المولي 10 أضعاف من GST-atlastin C-الذيل. في نقاط زمنية مختلفة، وإزالة aliquots من كل رد فعل، ولم تتوقف انقطاع بإضافة غلوتارالدهيد. وقد تم قياس طول MT من الميكروسكوب، وحسبت متوسط ​​أطوال. الشكل. 2 A يدل على أن متوسط ​​طول النظام التجاري المتعدد الأطراف بمرور الوقت. نحن لم يكشف عن أي تغييرات التي يسببها atlastin في حد أو المعدل الظاهر من MT تقصير في هذا الاختبار. على الرغم من أننا لم يكشف أي تأثير atlastin، وفحص المرجح لديها هامش كبير من الخطأ، ونحن لا نستطيع استبعاد دور للatlastin في تحوير النشاط spastin. بالاتفاق مع المختبر في البيانات، لم cooverexpression من atlastin-FLAG جنبا إلى جنب مع الأصفر بروتين فلوري (YFP) -spastin في كوس-7 الخلايا لا يمنع بوساطة spastin انقطاع (الشكل 2 B).

تين. 2.
Atlastin C-الذيل لا تمنع بوساطة spastin MT انقطاع. استخدمت (A) استقرت تاكسول، النظام التجاري المتعدد الأطراف المسمى رودامين وspastin، قطع فحوصات بدون أو مع المؤتلف atlastin C-الذيل كما هو موضح في المواد وطرق. في النقاط الزمنية المشار إليها، توقفت ردود الفعل من قبل التثبيت في غلوتارالدهيد. تم تصويرها النظام التجاري المتعدد الأطراف، وحسبت متوسط ​​أطوال كما هو موضح في المواد وطرق. ويبين الرسم البياني شريط أطوال متوسط ​​± الخطأ المعياري. تظهر photomicrographs تمثيلية مدى MT انقطاع. لم يكن هناك فرق ملحوظ بين ردود الفعل المحتضنة مع أو بدون C-الذيل. يظهر Coomassie هلام الزرقاء الملطخة المبالغ النسبية لكل بروتين (تويولين، 0.1 ملغ / مل؛ spastin، 0.02 ملغ / مل). تم استخدام C-الذيل في 10 أضعاف الرحى الزائدة مقارنة مع spastin. تم cotransfected (B) كوس-7 الخلايا مع YFP-spastin وatlastin-FLAG. بعد 24 ساعة، تم إصلاح الخلايا وملطخة مكافحة FLAG و أضداد تويولين. Spastin (الخضراء) وatlastin (الأحمر) colocalize. الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل تظهر انخفض MT (الأزرق) محتوى مقارنة مع الخلايا المجاورة. (مقياس شريط 15 ميكرون).

ومع ذلك، فإننا لم تلاحظ أن في الخلايا cotransfected، ونمط atlastin-FLAG تلطيخ يبدو غيرت (الشكل 2 B) مقارنة مع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل فقط مع atlastin-FLAG (الشكل 8، التي تصدر عن دعم المعلومات على الموقع الشبكي PNAS ). في حين تم العثور على معظم atlastin الذاتية في جولجي (13)، وoverexpressed atlastin-FLAG colocalizes معظمها مع علامة جولجي (الشكل 8) في الخلايا cotransfected، وcodistributed atlastin-FLAG في نقاط ومع spastin. كما هو الحال مع اضطراب MT الناجمة عن العديد من العلاجات، نتائج فقدان MT-الناجم عن spastin في تشتت جولجي (لا تظهر البيانات). على الرغم من spastin overexpressed وatlastin وcolocalized في هذه التجربة (الشكل 2 B)، ويظهر لا البروتين نمط تلطيخ هذا هو الحال في أي الذاتية البروتين (انظر الشكل 4 A).
ومع ذلك، اقترحت هذه التجربة أن التجارب cotransfection قد يكون وسيلة مريحة لتحديد مجالات spastin وatlastin اللازمة لcoassociation في الخلايا. للالتفاف على حقيقة أن WT spastin يدمر النظام التجاري المتعدد الأطراف، وهذا بدوره قد تغير توطين التحت خلوية من البروتينات، وكنا E442Q spastin متحولة، الذي يربط النظام التجاري المتعدد الأطراف ولكن لا يمكن أن يطلق أو قطع (6)، وبالتالي يزين النظام التجاري المتعدد الأطراف في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. والمثير للدهشة، أدى cotransfection مع spastin E442Q وatlastin-FLAG في atlastin توزع جنبا إلى جنب مع spastin على النظام التجاري المتعدد الأطراف (الشكل 3). في نفس الخلايا، مورفولوجيا جولجي وفقا لتقييم GM130 تلطيخ يبدو طبيعي نسبيا (الشكل 9، التي تصدر عن دعم المعلومات على الموقع الشبكي PNAS). لأن atlastin هو بروتين الغشاء لا يتجزأ، ونحن نتصور أن الحويصلات تحمل تصنيعه حديثا atlastin-FLAG من الشبكة الإندوبلازمية إلى جولجي أو بعد جولجي-الحويصلات تحمل atlastin يجب أن يكون قد جند لspastin متجهة الى MT. من هذا الاختبار، فإننا نستنتج فقط أن اثنين من البروتينات في الخلايا تتفاعل بطريقة بحيث واحد يؤثر على توطين البعض. في المرضى المصابين حيث لا هى overexpressed spastin متحولة، وقد لوحظ عدم وجود علاقة مستقرة من spastin متحولة مع النظام التجاري المتعدد الأطراف (16).

تين. 3.
التفاعل Spastin atlastin في الخلايا. في كوس-7 خلايا cotransfected مع YFP-E442Q spastin وatlastin-FLAG، atlastin هو "تجنيد" إلى النظام التجاري المتعدد الأطراف جنبا إلى جنب مع متحولة spastin، مشيرا إلى أن اثنين من البروتينات تتفاعل في الخلايا (A - C). حذف المنطقة N-الطرفية (بقايا 1-132) من spastin (G - I)، ولكن ليس MIT (بقايا 116-194) (J - L) أو اكسون 4 (بقايا 195-227) (M - O) المجالات، منع تجنيد atlastin. حذف C-الذيل من atlastin منع تجنيد (D - F).

وعدم تجنيد Atlastin تفتقر إلى C-الذيل إلى spastin E442Q (الشكل 3)، بما يتفق مع ربط البيانات في المختبر أظهرت أن spastin بربط atlastin C-الذيل. لتحديد مجال spastin هي المسؤولة عن التفاعل atlastin، قدمنا ​​سلسلة من عمليات الحذف مجال واحد في spastin. بشكل عام، spastin هو جزيء ثنائي مع C-محطة مجال AAA أتباز (الأحماض الأمينية 344-616). المنطقة-N من محطة spastin (الأحماض الأمينية 1-343) يحتوي على أربعة نطاقات فرعية متميزة. 115 الأحماض الأمينية الأولى من spastin تحتوي على منطقة البرولين الغنية ومجال مسعور. وتشمل الأحماض الأمينية 116-194 المجال MIT (9). اكسون 4 (الأحماض الأمينية 195-227) وتقسم بدلا من ذلك، والقليل هو المعروف عن هذا المجال (17). المجال-N محطة، ولكن لا مجال MIT ولا اكسون 4، مطلوب للتجنيد atlastin (الشكل 3). معا، وهذه النتائج تشير إلى أن المجال N محطة من spastin بربط C-ذيل atlastin. اثنين من الأشكال (S44L وP45Q)، والتي قد تكون بمثابة المعدلات الوراثية (18)، وطفرة الأمراض المرتبطة (dupA102، S103) (19 تقع) في هذه المنطقة-N من محطة spastin. أيا من هذه التغييرات في spastin منع تجنيد atlastin في مقايسة cotransfection (الجدول رقم 1، التي تصدر عن دعم المعلومات على الموقع الشبكي PNAS). باستخدام فحوصات ترنسفكأيشن والعمل مع النظام التجاري المتعدد الأطراف النقاء في videomicroscopic قطع فحص (6)، وجدنا أن Δ1-227 spastin (تفتقر المنطقة N-المحطة، المجال MIT، واكسون 4) يمكن ما زالت تفصل النظام التجاري المتعدد الأطراف ولها نشاط مماثل أتباز لذلك من البروتين كامل طول (لا تظهر البيانات وبيانات غير منشورة).
درسنا عدة طفرات في كل spastin وatlastin باستخدام هذا الاختبار (انظر الجدولين 1 و 2، والتي يتم نشرها عن دعم المعلومات على الموقع الشبكي PNAS). قمنا بتحليل اثنين من الطفرات السريرية في atlastin C-الذيل وجدت أن R495W (20)، ولكن ليس ins1688A، تفاعلت مع spastin (الشكل 10، التي تصدر عن دعم المعلومات على الموقع الشبكي PNAS).
رفعنا الأجسام المضادة لكلا spastin وatlastin وفحص ما إذا كان spastin الذاتية وatlastin colocalize في خلايا كوس. وتظهر البقع غرب لست] الخلية باستخدام الأجسام المضادة تنقية تقارب (الشكل 11، التي تصدر عن دعم المعلومات على الموقع الشبكي PNAS). أظهر الأجسام المضادة atlastin نمط تلطيخ محيط بالنواة (الشكل 4) مماثلة لتلك التي نشرتها تشو وآخرون. (13). كثافة تلطيخ تنوعت بين الخلايا. وكانت كثافة تلطيخ spastin الذاتية يتناسب مع كمية من atlastin أعرب (الشكل 4 A). أيضا، كان هناك colocalization الجزئي لاثنين من البروتينات الذاتية.

تين. 4.
Colocalization من spastin الذاتية وatlastin. (A) كوس الخلايا وملطخة الأجسام المضادة لatlastin وspastin. تم الكشف عن إشارات باستخدام قبرصي-5-مترافق أو اليكسا فلور 488 الضد الثانوية. تم الكشف عن إشارة Spastin باستخدام فلور اليكسا 488. لاحظ colocalization الجزئي لاثنين من البروتينات. وكانت Atlastin كثافة تلطيخ المتغيرة، وإشارة spastin أعلى في الخلايا معربا عن المزيد من atlastin. (B) Spastin رني لا يغير بشكل ملحوظ atlastin تلطيخ. تم قمع التعبير Spastin (يسار) جزئيا ترنسفكأيشن من سيرنا spastin محددة ولكنها ليست سيرنا المخفوق. أظهر ترنسفكأيشن مع سيرنا المسمى رودامين أن> 90٪ من الخلايا و transfected (لا تظهر البيانات). كانت ملطخة coverslips مكررة أعدت من نفس transfections لatlastin الذاتية (يمين)، والتي ظهرت دون تغيير. (C) آثار atlastin رني على spastin. الخلايا كانت ثابتة 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وتكرار coverslips كانت ملطخة إما spastin أو atlastin. في هذه التجربة، لوحظ تلوين الخلفية من نوى في بعض الأحيان. الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل، التي حددها GFP التعبير (إدراجات) بالرمز النصال. كانت ملطخة النوى مع دابي (الأزرق). مقارنة مع الخلايا nontransfected، يتم منعها atlastin تلطيخ جزئيا في atlastin رني ولكن ليس في خلايا رني السيطرة. مقارنة مع الخلايا السيطرة transfected، أظهرت نسبة مئوية صغيرة من الخلايا تعرض لatlastin رني تركيز محيط بالنواة من spastin (29٪ مقابل 45٪، ن = 135 الخلايا من كل ترنسفكأيشن). التحليل الكمي لطخة غربية من عدد متساو من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل الحصول عليها عن طريق التدفق الخلوي يوضح أن atlastin قمع كان 60٪ وخفضت أن مستويات spastin أيضا درجة مماثلة. وتم تطبيع إشارات إلى كثافة أكتين. (أشرطة النطاق، 15 ميكرومتر).

سألنا عما إذا تدخل الحمض النووي الريبي (رني) إسكات بوساطة أي من spastin أو atlastin تتأثر البروتين الأخرى. قمع Spastin، باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل باختصار (سيرنا) التي تحققت، أدى إلى انخفاض ولكن لم تلغ تلطيخ spastin (الشكل 4 B) ولكن لم يغير بشكل ملحوظ إما نمط atlastin تلطيخ أو شدة. في تحليل لطخة غربية، لم قمع spastin بنسبة 50٪ بحلول رني لا يؤدي إلى مستويات atlastin تغيير (لا تظهر البيانات). لقمع atlastin، ونحن transfected الخلايا مع البلازميد التي تحتوي على الحمض النووي الريبي دبوس الشعر القصير (shRNA) معين لatlastin. الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل coexpress GFP جنبا إلى جنب مع shRNA. النشاف الغربي من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل الحصول عليها عن طريق التدفق الخلوي (الشكل 4 أظهر C) 60٪ قمع atlastin. ومن المثير للاهتمام، كما أدى atlastin رني في انخفاض مماثل في مستويات spastin. أدى Atlastin رني في انخفاض بنسب مختلفة atlastin تلطيخ مقارنة مع الخلايا السيطرة (الشكل 4 C). وفيما يتعلق تلطيخ spastin، أظهرت 45٪ من الخلايا السيطرة transfected منطقة محيط بالنواة مع المركز تلطيخ spastin (انظر الشكل 4 C). في المقابل، أظهرت 29٪ فقط من الخلايا atlastin رني transfected هذه الميزة. انخفاض في spastin تلطيخ محيط بالنواة يمكن أن تنجم عن أي انخفاض مستويات spastin أو عدم القدرة على التركيز spastin إلى المناطق التي تحتوي على atlastin.
كنا نتساءل عما إذا atlastin overexpression من شأنه أن يؤدي في التعيين وربما زيادة مستوى ثابت للدولة من spastin الذاتية. أيضا، لاختبار ما إذا كان atlastin C-الذيل هو ضروري وكاف لهذه الظواهر، أنشأنا اثنين من بنيات إضافية. بين أفادت والطفرات المسببة للأمراض في atlastin واحد هو أن يحذف أكثر من C-الذيل (21). هذه الطفرة، والإدراج من الأدنين في موقف 1688، تغير القراءة إطار 10 أأ إلى C-الذيل، ويضيف تسلسل غير الأصليين، ويدخل وقف كودون سابقة لأوانها. مثل بناء ΔC الذيل المستخدمة في الشكل. منعت هذه الطفرة التفاعل spastin في مقايسة cotransfection (الشكل 10). نحن أيضا خلق بناء (atlastin C-الذيل جولجي) مع atlastin C-الذيل FLAG شاردة تنصهر شاردة جولجي في توطين (بقايا galactosyl ترانسفيراز الأحماض الأمينية الترميز التي هي المسؤولة عن جولجي التعريب).
نحن transfected الخلايا مع البلازميدات ترميز WT-atlastin-FLAG، ins1688A-atlastin-FLAG، أو atlastin C-الذيل جولجي. تم إصلاح الخلايا وملطخة المزدوج لFLAG وspastin الذاتية (الشكل 5). في الخلايا overexpressing atlastin تفتقر إلى C-الذيل (atlastin-ins1688A)، لم colocalized spastin الذاتية مع atlastin overexpressed. في هذه الخلايا، وتلطيخ spastin أيضا أقل كثافة (الصورة المعروضة في الشكل 5 تم الحصول E باستخدام قتا أطول التعرض لجعل تلطيخ spastin مرئية). أيضا، وتلطيخ spastin في كل من الخلية transfected والخلايا nontransfected تظهر مشابهة في كثافة والتوزيع. في المقابل، في خلايا overexpressing WT atlastin-FLAG أو atlastin C-الذيل جولجي، وcolocalized spastin الذاتية مع atlastin overexpressed. وبمقارنة خلايا ثلاثة صورت في الشكل. 5 G و H، وكمية من تلطيخ spastin الذاتية يتناسب مع كمية atlastin-C الذيل جولجي التعبير عنها. وتشير هذه النتائج إلى أن C-ذيل atlastin ضروري وكاف لتجنيد spastin. جنبا إلى جنب مع البيانات في الشكل. 4 فإنها تشير أيضا إلى أن مستويات atlastin وspastin ترتبط. قمنا بقياس مضان atlastin-FLAG ومضان من spastin الذاتية في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل وnontransfected تم اختيارها عشوائيا. مؤامرة من شدة atlastin-FLAG مقابل كثافة spastin تبين أن هناك علاقة جيدة بين مستويات atlastin وspastin على أساس خلية تلو خلية (الشكل 5).

تين. 5.
وatlastin C-الذيل اللازم والكافي لتجنيد spastin الذاتية للجولجي. كوس و transfected الخلايا مع WT atlastin-FLAG (A - C)، ins1688A-atlastin-FLAG (D - F)، أو atlastin-C الذيل جولجي (G - I) لمدة 48 ساعة. كانت ملطخة الخلايا باستخدام الأجسام المضادة FLAG (قبرصي-5 الضد الثانوية في A، D، G و، كما هو موضح باللون الأحمر) والملون لspastin الذاتية (فلور اليكسا 488 كشف في B، E، H و، كما هو موضح باللون الأخضر). لاحظ colocalization الجزئي للspastin مع-C الذيل جولجي بالوزن وatlastin ولكن ليس مع ins1688A-atlastin. وتزداد كثافة Spastin في الخلايا معربا عن المزيد من atlastin-C الذيل جولجي (قارن الخلايا في G و H). تم الحصول على صورة في E مع زيادة مدة التعرض لتصور أفضل لتلطيخ spastin. لاحظ أن مستويات spastin هي نفسها في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل وnontransfected ولا المترجمة التي spastin مع atlastin. تظهر لطخة غربية أن الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع البلازميدات ترميز atlastin-YFP أو atlastin C-الذيل جولجي، ولكن ليس YFP، وتظهر زيادة مستويات spastin الذاتية (كما هو موضح باللون الأخضر). الأرقام أعلاه كل حارة تظهر الزيادة النسبية في مستويات spastin [مقارنة مع الخلايا YFP transfected وتطبيع للالأكتين التعبير (أحمر)]. ويبين الرسم البياني spastin كثافة مضان بوصفها وظيفة من كثافة مضان atlastin-FLAG في الخلايا المحددة بشكل عشوائي. لديها خلايا لا overexpressing atlastin-FLAG بمتوسط ​​كثافة spastin من 95 وحدة تعسفية.

المقبل، ونحن transfected الخلايا مع YFP، atlastin-YFP، أو atlastin-C الذيل جولجي. بعد 24 ساعة، تم فحص مستويات spastin عن طريق ويسترن الكمية النشاف (الشكل 5). فحص الخلايا YFP وYFP معربا عن تحلل قبل كشف الكفاءات ترنسفكأيشن متساوية من ≈70٪. overexpression من atlastin-YFP، ولكن ليس YFP وحده، أدت إلى زيادة ≈3 أضعاف في إشارة spastin، في حين أدى overexpression من atlastin C-الذيل جولجي في زيادة 7.8 أضعاف في spastin.

نقاش

أظهرنا أن المجال N-محطة من spastin يربط مباشرة إلى المجال-C محطة حشوية من atlastin. هذا التفاعل بين اثنين من المنتجات HSP جين المرض تشير إلى أن بعض> 20 الجينات HSP قد تحدد مسار بيولوجي الخلوية التي أمر مهم في صيانة محور عصبي. أظهرنا أيضا متحولة HSP المرتبطة ins1688A-atlastin لا تتفاعل مع spastin، مما يوحي بأن HSP يمكن أن تنجم عن عدم وجود تفاعل طبيعي بين spastin وatlastin.
لا حذف ولا الطفرات مغلطة في-N محطة GTPase مجال atlastin لمنع تجنيد (الجدولين 1 و 2). وبالتالي، فإن دور النشاط GTPase، إن وجدت، في تنظيم تفاعل atlastin spastin غير واضح.
في حين أن هذه الورقة تحت المراجعة، ساندرسون وآخرون. (22) أن spastin وatlastin التفاعل في الخميرة اثنين الهجين الفحص. وعلى النقيض من النتائج التي توصلنا إليها، فإنها ذكرت أن الجزء N-محطة من atlastin يربط spastin. واستند هذا الاستنتاج على تجربة حيث حضنت لست] من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع spastin مع GST-1-447 atlastin أو مع GST وحدها. لأن atlastin الذاتية كان حاضرا أيضا في هذه الخلايا، ولأن atlastin قادر على homooligomerization (13)، فمن الممكن أن التفاعل وحظ وغير المباشر. باستخدام الخميرة فحص اثنين من الهجين (الشكل 1)، وفحص التوظيف حيث الذيل C ولكن ليس مطلوبا أول 447 الأحماض الأمينية atlastin للتجنيد (التين. 3 و5 والجدولين 1 و 2)، والمؤتلف المنقى البروتينات (الشكل 2)، ودراسة spastin الذاتية (الشكل 5)، وتبين لنا أن atlastin C-ذيل يربط مباشرة إلى spastin وغير ضروري وكاف للتفاعل spastin.
لأن atlastin بربط منطقة spastin هذا هو الاستغناء عن MT انقطاع (لا تظهر البيانات)، ولأن وجدنا أن atlastin المؤتلف C-ذيل لم يغير بوساطة spastin MT انقطاع في المختبر (الشكل 2)، ونحن نعتقد أنه يجوز atlastin العمل في توطين spastin. الأدلة الحالية تشير إلى أن atlastin وجدت في جولجي ويترافق مع حويصلات في المحاور ومخاريط النمو في الخلايا العصبية (23)، أثار احتمال أن تكون بعض atlastin من جولجي يحصل تعبئتها في حويصلات جولجي مشتقة. Atlastin يمكن توظيف spastin إلى جولجي أو ربما إلى الحويصلات بعد جولجي في ظل الظروف لم يحدد بعد. وتمشيا مع هذه الفكرة، معربا عن الخلايا كميات أكبر من أي atlastin الذاتية (الشكل 4 أ) أو overexpressed عرض atlastin ارتفعت مستويات ثابتة للدولة من spastin وعززت colocalization مع spastin. أدى القمع الجزئي للatlastin أيضا في انخفاض مستويات ثابتة للدولة من spastin وتوزيع الخلوية تغير أقل ما يقال في بعض الخلايا.

المواد والأساليب

ثقافة هيلا وكوس-7 خلايا وTransfections.

وكانت مزارع الخلايا وtransfections كما هو موضح في المرجع. 6. حذف بنيات YFP-spastin الأصلية (6 تم انجازه) مع نظام الطفرات QuikChange (Stratagene)، وتأكدت الطفرات من تسلسل الحمض النووي. حذف بناء ΔN الأحماض الأمينية 1-132، حذف بناء ΔMIT الأحماض الأمينية 116-194، وحذف بناء Δexon 4 الأحماض الأمينية 195-227. تم الحصول على صورة استنساخ atlastin وFLAG- أو صاحب-6X الموسومة في محطة C. لبناء atlastin C-الذيل جولجي بناء، تم إضافة البادئ الأرصاد رامزة إلى DNA ترميز atlastin C-الذيل FLAG. وتنصهر تسلسل مسؤولة عن توطين galactosyl ترانسفيراز إلى جولجي (81 بقايا N-المحطة) 3 'إلى تسلسل FLAG.

الخميرة ثنائي هجين الفرز.

تم إجراء فحص الخميرة اثنين الهجين مع النظام Clontech صانع عيدان الثقاب. تم استنساخ spastin الإنسان إلى البلازميد pGBK-T7 باستخدام تقييد مواقع NdeI وBamHI، وكان يستخدم البلازميد لتحويل سلالة AH109. وتزاوج هذه الخمائر مع سلالة Y187 التي تم pretransformed مع كدنا] مكتبة هيلا (Clontech) المستنسخة في pGAD T7 تفصيل. كانت مطلية Diploids على الثلاثي المتوسطة التسرب (منخفض اختيار صرامة)، وكانت replated ايجابيات على لوحات التسرب رباعية (الصرامة العالية) التي تحتوي على X-α-غال. تم إعداد البلازميدات من الحيوانات المستنسخة الإيجابية واستخدامها لتحويل KC8 القولونية. والتسلسل البلازميدات تعافى وretransformed إلى سلالة AH109، وكررت الفحص هجين اثنين لتأكيد أننا قد عزل البلازميدات الصحيحة.

البروتينات المؤتلف.

كان التعبير Spastin وتنقية كما هو موضح في المرجع. 6. وكان جزء ترميز C-ذيل atlastin (الأحماض الأمينية 495-558) PCR تضخيم مع الاشعال مضيفا BamHI وEcoRI تقييد مواقع للاستنساخ في pGEX2T. وأعرب عن ضريبة السلع والخدمات atlastin C-الذيل في الخلايا BL21 RILP (Stratagene) من خلال تحريض الثقافات المرحلة لوغاريتمي مع 0.4 ملي الآيزوبروبيل β- د -thiogalactoside عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. تم تعطيل عمل خلايا غسلها، وكان تنقية البروتين GST الانصهار نفس لGST-spastin (6). تم المشقوق GST من spastin المؤتلف باستخدام البروتيني الدقة (GE للرعاية الصحية).

في المختبر MT قطع حبل.

، النظام التجاري المتعدد الأطراف استقرت التاكسول المسمى رودامين أعد كما هو موضح في المرجع 6 استخدمت (0.1 ملغ / مل تركيز النهائي) في قطع فحوصات أجريت في 25 ° C مع spastin (0.02 ملغ / مل)، وATP (1 ملم) في غياب أو وجود 10 أضعاف الزيادة المولي من atlastin C-الذيل. في بعض الأحيان هو مبين في الشكل. 2 أزيلت قسامات وثابتة في غلوتارالدهيد. وكانت مخففة العينات ورصدت على coverslips، وصورت MTS من 10 على الأقل المجالات المجهرية تم اختيارها عشوائيا ويتم قياسها باستخدام metamorph. تم تصوير حوالي 125-250 النظام التجاري المتعدد الأطراف وقياس لكل نقطة زمنية.

Coimmunoprecipitations.

و transfected خلايا هيلا في لوحات ستة جيدا لمدة 24 ساعة و lysed في RIPA العازلة (50 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4 / 100 ملي كلوريد الصوديوم / 2 مم MgCl 2/10٪ الجلسرين / 1٪ تريتون X-100 / 0.5٪ deoxycholate / 0.1 وقد تم توضيح روش العلوم التطبيقية، انديانابوليس)، ولست] بواسطة الطرد المركزي (20،000 × ز مركبات لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية)؛٪ SDS / البروتيني خليط المانع. تم precleared Supernatants مع بروتين G سيفاروز، وأضيفت 2.5 ميكروغرام من صاحب-6X الأجسام المضادة والبروتين G لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. تم غسلها حبات ثلاث مرات في المخزن RIPA ومزال في SDS عينة العازلة. جرى التحقيق لست] لspastin وatlastin التي كتبها α-HA وα صاحب الغربي النشاف، على التوالي. جرى التحقيق Immunoprecipitates عن محتوى spastin التي كتبها HA النشاف.
الأجسام المضادة والمناعي.

تم تحصين الدجاج مع GST-spastin، وكانت الأجسام المضادة تقارب-تنقيته من المستمدة من صفار IGY جزء باستخدام مصفوفة تقارب حيث ثبتوا بروتين النخاعين الأساسي (MBP) -spastin مع Affigel. تم انتشال الأجسام المضادة النقاء بتركيز 0.2 ملغ / مل وتخزينها في 50 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0). لجعل الأجسام المضادة atlastin، تم تحصين الأرانب مع GST atlastin C-الذيل. والأجسام المضادة تنقية تقارب على مصفوفة MBP-atlastin.
الكشف عن spastin الذاتية المناعي المجهري الحجب المطلوب من خلايا الميثانول الثابتة في BlockHen II (إيفس مختبرات، تيغارد، OR) للحد من تلوين الخلفية. أيضا، تم استخدام الأجسام المضادة في 1: 5،000-1: 20،000 التخفيفات، وتضخيم إشارة مع Tyramide تضخيم إشارة كيت اليكسا فلور 488 أو فلور اليكسا 594 (المسابر الجزيئية).تم استخدام الأجسام المضادة Atlastin في 1: 500 التخفيف أو في 1: 5،000-1: 10،000 عند استخدامها مع tyramide تضخيم الإشارات. تم استخدام الأجسام المضادة في التخفيفات التالية: Yl1 / 2 (Chemicon) لتويولين في 1: 500، أرنب مكافحة FLAG (الانجذاب BioReagents، محطة Neshanic، NJ) في 1: 250، ومكافحة صاحب-6X (Clontech) في 1: 250، والماوس مكافحة GM130 (BD العلوم البيولوجية) في 1: 250، والفئران-HA المضادة (روش العلوم التطبيقية) في 1: 250. تم تنفيذ النشاف الغربي الكمي باستخدام الأجسام المضادة صبغ مترافق الأشعة تحت الحمراء الثانوية بالتزامن مع نظام الأشعة تحت الحمراء التصوير / المسح Licor الأوديسة.
رني.

وقد تحقق Spastin رني باستخدام الوجهين سيرنا (العقاقير، 5'-rArUrArCrCrArUrUrCrCrArCrArGrCrUrUrGrCrUrCrCrUrUrC rUrG-3 '؛ المعنى، 5phos-rGrArArGrGrArGrCrArArGrCrUrGrUrGrGrArArUrGrGrUAT). و transfected الخلايا مع الوجهين سيرنا في 20 نانومتر المزدوجة باستخدام Silentfect (بيو راد) لمدة 48 ساعة. تم استخدام سيرنا سارعت في نفس التركيز كعنصر تحكم (المعنى، 5phos-rCrUrUrCrCrUrCrUrCrUrUrUrCrUrCrUrCrCrCrUrUrGrUGA؛ العقاقير، rUrCrArCrArArGrGrGrArGrArGrArArArGrArGrArGrGrArArG rGrA). وقد تحقق Atlastin رني باستخدام RNA دبوس الشعر القصير (shRNA) الذي سبق ان عرضه لقمع atlastin (23). تم استنساخ عنصر تحكم shRNA إلى alphafetoprotein (GGATCTGTGCCAAGCTCAGTTCAAGAGACTGAGCTTGGCACAGATCCTT TTTT) في pLentilox (24). وكانت البلازميدات استخدام ل transfect كوس-7 الخلايا، وتم فحص خلايا 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس