عرض مشاركة واحدة
  #2  
قديم 12-13-2015, 04:20 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي انخفاض AKT / mTOR س الإشارات وتخليق البروتين التقلبات في نموذج حيواني متلازمة ريت

 

http://hmg.oxfordjournals.org/conten...mg.ddq563.full




متلازمة ريت (RTT) هو اضطراب النمو العصبي مع عدم وجود علاج فعال الذي ينتج في معظم الحالات عن طريق الطفرات في الجين ميثيل الدليل السياسي الشامل ملزم بروتين 2 (MECP2). RTT يصبح واضحا بعد فترة من التطور على ما يبدو طبيعية ويسبب تباطؤ النمو وضعف النفسي الشديد والتخلف العقلي. هي نماذج حيوانية فعالة لRTT المتاحة وتظهر تشوهات morphofunctional من اتصال متشابك. ومع ذلك، ليست معروفة العواقب الجزيئية للMeCP2 اضطراب يؤدي إلى تغييرات العصبية ومتشابك. البروتين تنظيم التوليف عن طريق الهدف الثدييات من rapamycin (mTOR س) مسار أمر بالغ الأهمية في تنظيم متشابك، ويشارك اضطراب في عدد من الأمراض العصبية النمائية. نحن التحقيق في الفسفرة من البروتين الريباسي (RP) S6، الذي تفعيل تعتمد اعتمادا كبيرا من النشاط mTOR س. أظهر المناعية التي rpS6 الفسفرة تتأثر بشدة في الخلايا العصبية في جميع أنحاء المناطق القشرية من المسوخ Mecp2 وأن هذا التغيير تسبق مرحلة أعراض شديدة للمرض. وعلاوة على ذلك، وجدنا خلل شديد في الشروع في تخليق البروتين في دماغ سابق للأعراض Mecp2 متحولة التي لم تقتصر على مجموعة فرعية معينة من النصوص. وأخيرا، ونحن نقدم دليلا على وجود خلل وظيفي العام للAKT / mTOR س، ولكن ليس خارج الخلية التنظيم كيناز، مما يشير المرتبطة تطور المرض في العقول متحولة. نتائجنا تشير إلى أن العيوب في مسار AKT / mTOR س هي المسؤولة عن مراقبة متعدية تغيير في Mecp2 الخلايا العصبية متحولة وكشفت العلامات البيولوجية المفترضة جديدة للعملية المرضية. الأهم من ذلك، فإن هذه الدراسة سياق الرواية من التدخلات العلاجية التي يمكن أن تكون مصممة لكبح جماح بنجاح أو تحسين وضع RTT.
المقدمة

متلازمة ريت (RTT؛ MIM312750) هو اضطراب عصبي التدريجي الأطفال مما يؤدي إلى التخلف العقلي الشديد، وضعف النفسي والسلوك التوحد يصيب حوالي 01:10 000 الفتيات في جميع أنحاء العالم (1 - +3). الأطفال الذين يعانون من RTT يكون التطوير على ما يبدو العادية حتى 6 أشهر من الحياة، وبعد ذلك تخضع لالانحدار السريع تميزت تباطؤ النمو الرأس، وظهور حركات اليد النمطية، عدم انتظام التنفس ونوبات (4). الخسارة من وظيفة الطفرات في ميثيل الدليل السياسي الشامل ملزم بروتين 2 (MECP2) الجين X-مرتبط، منظم النسخي الذي يعمل من خلال آليات جينية على هيكل لونين (5)، يتسبب في 95٪ من الحالات RTT. الأهم من ذلك، تم العثور على طفرات هذا الجين أيضا في المرضى الذين يعانون من حالات عصبية أخرى مثل متلازمة تشبه Angelman والحركية وصعوبات التعلم، والمضبوطات، ومرض القطبين، والفصام الأحداث الحدوث، اعتلال الدماغ عند الوليد والتوحد (2، 7). وقد اقترح هذا الاكتشاف أنه في الفئران استهدفت تحور Mecp2 في الجهاز العصبي المركزي قد تنتج النمط الظاهري مشابهة لطفرة كامل الجسم أن ضعف وظيفة MeCP2 في الدماغ هو أمر حاسم لالمرضية للمرض (8، 9). وبالفعل، فقد أشار تحليل النماذج الحيوانية المتاحة للRTT أن تتغير مستويات MeCP2 في الخلايا العصبية تسبب عيوب شكلية في كل تعقيدات الشجيرية، رقم العمود الفقري وكذلك تغييرات في انتقال متشابك واللدونة (10 - 16). وأشارت هذه النتائج نموذجا للetiopathogenesis من RTT فيها التعديلات السلوكية الناجمة عن طفرة Mecp2 يمكن أن تعتمد على إدخال تعديلات على تنظيم متشابك الدماغ. ومع ذلك، يتم حتى الآن لم يعرف الأحداث الجزيئية الرائدة من اختلال Mecp2 التعبير في الدماغ إلى التعديلات الدوائر العصبية.
هناك أدلة متزايدة تظهر أن تخليق البروتين الخلايا العصبية الشاذة كما سبب واحد الكامن وراء المظاهر السريرية لاضطرابات طيف التوحد (17، 18). وقد شاركت التعديلات من الإشارات شلالات يشارك في تخليق البروتين التنظيم، مثل الهدف الثدييات من rapamycin (mTOR س) وفسفوإينوزيتيد 3-كيناز (PI3K) مسارات، في الأمراض العصبية النمائية المرتبطة التخلف العقلي الشديد (19، 20) مثل الهشة X (21)، والتصلب درني (22) ومتلازمة فيلان-مكديرمد (23). ومن المثير للاهتمام، وتنظيم تخليق البروتين عبر مسار mTOR س / PI3K تشارك بشكل حاسم في وظيفة متشابك، هيكل واللدونة (20، 24 - +26). في الخلايا العصبية بعد الإنقسامية، النشاط mTOR س والأهداف النهائية التي يمكن التحكم في حجم الخلايا العصبية سوما، الاستطلاعية محور عصبي والتجديد، والتغصنات تشجر، شجيري التشكل العمود الفقري واللدونة متشابك (20، 25). يثير الاهتمام والفضول، يتم تغيير كل هذه الجوانب في المسوخ Mecp2. لا تقترن هذه التغييرات، من المستغرب، من خلال تغييرات هامة في Transcriptome على (1، 27، 28)، مما يوحي بأن Mecp2 قد تتصرف بمهارة في مرحلة ما بعد النسخي. على الرغم من ذلك، الدراسات التي تصف فعالية تخليق البروتين أو الإشارات بين الخلايا المتعلقة بالترجمة في RTT ليست متاحة بعد.
في هذه الدراسة، ونحن التحقيق في ما إذا كان تفعيل البروتين الريباسي (RP) S6، وهو مكون من 40S الوحيدات الريباسي، أمر طبيعي خلال نمو الدماغ بعد الولادة من Mecp2 فئرانا معدلة وراثيا. على وجه الخصوص، نقوم بتحليل التعديلات التي تحدث في Ser235 / 236 و Ser240 / 244. هذه المخلفات يمكن مفسفر من قبل كل من كيناز الخلية التنظيم (إرك) وmTOR س / PI3K مسار وترتبط مع معدلات متعدية الخلوية (+29 - +31). وعلاوة على ذلك، لاختبار الفرضية القائلة بأن العجز متعدية قد يكون سبب RTT الاختلالات العصبية، ونحن ننظر في تعقيد polysomal ول mRNAs المرتبطة polysome في الدماغ من المسوخ Mecp2. وأخيرا، نحن نحلل مساهمة الإشارات بين الخلايا المنبع إلى تشريح خارج تخليق البروتين آلية التنظيم في الخلايا العصبية التي تفتقر إلى Mecp2 تماما.

النتائج

hypophosphorylation انتشارا rpS6 في Mecp2 - / العقول ص تسبق أعراض مظهر

mTOR س / التي تعتمد على PI3K تخليق البروتين في الخلايا العصبية هو أمر حاسم لتنظيم العصبية والمشبك الهياكل (على سبيل المثال التشعبات والعمود الفقري شجيري) فضلا عن اللدونة متشابك (+24 - +26). بالإضافة إلى ذلك، تخليق البروتين شجيري الناجمة عن تفعيل واللدونة من الاتصالات المشبكية يتطلب عمل تعتمد على ERK الإشارات (24، 32، 33). لمعالجة الطقس العيوب المحتملة لهذه الممرات داخل الخلايا قد تحدث في دماغ Mecp2 خروج المغلوب (KO) الفئران (Mecp2 tml.lJae) (8)، درسنا immunolocalization من فسفرته (ع) rpS6، هدفا تتلاقى كل من ERK والنشاط mTOR س / PI3K (31). قمنا بتحليل توطين rpS6 تفعيلها في الابتدائية الحسية (S1) القشرة وفي المنطقة CA1 من الحصين، حيث سبق لها أن وجدت التعديلات العصبية ومتشابك في نماذج الفئران من RTT (10، 12، 15، +34 - 37). تم إجراء التحليل في Mecp2 - / الفئران y في 8 أسابيع من العمر (P56) تظهر عليها علامات أعراض واضحة (أي ضعف الحركي، هند أطرافهم الشبك، مواظب الخدش والمخالفات التنفس). جرى التحقيق مع اثنين من الأجسام المضادة أقسام محددة. تعترف لأول مرة rpS6 فقط عندما يتم تفعيلها في Ser235 / 236، واثنين من المخلفات التي يمكن فسفرته من قبل كل من ERK وmTOR س الأنشطة / PI3K. يعترف الأجسام المضادة الشكل الثاني تفعيلها من rpS6 في Ser240 / 244 مواقع، وهو التعديل الذي يمكن أن يتسبب به عمل mTOR س / PI3K الطريق وعلى بعد ERK مستقل.
كما هو موضح في الشكل 1 A، لاحظنا انخفاضا قويا في ف rpS6 مناعية في جميع أنحاء القشرة S1 من المسوخ Mecp2 مقارنة مع البرية من نوع (WT) تتزاحم. بشكل عام، كان تفعيل rpS6 أكثر كثافة في طبقة 5 من القشرة من الحيوانات WT. وكشف تفتيش بالقرب من الأقسام immunolabeled أنه في العصبونات القشرية الفردية، rpS6 يمكن تفعيلها في كل من سوما والجزء الأكثر القريب من التغصنات قمي. كما يمكن الاستدلال على ذلك في الشكل 1 A الأشكال، وأظهر rpS6 تلطيخ الاختلافات بين الخلايا. بشكل ملحوظ، وتحديد حجم وكثافة immunosignal (الشكل 1 D)، المحسوبة على النحو الكثافة الضوئية (OD) قيم تلطيخ الغلوثانيون، أكدت حدوث انخفاض كبير في تفعيل rpS6 في كل Ser235 / 236 و Ser240 / 244 في المسوخ Mecp2. ولقد وجدنا انخفاض 32.2٪ في ف rpS6 (Ser235 / 236) تفعيل جميع أنحاء القشرة من الفئران KO بالمقارنة مع تتزاحم WT = 3، P <0.005)، في حين أن تفعيل ف rpS6 (Ser240 / 244) 30.2٪ في المسوخ أقل مما كانت عليه في الحيوانات التحكم (ن =P <0.05). في المقابل، اكتشفنا لا خلافات في التعريب (الشكل 1 A) ولا تغييرات كبيرة في immunolabeling شدة (الشكل 1 B) للبروتين rpS6 التام بين WT وMecp2 - / الفئران ذ. هكذا، وبسبب انخفاض الفسفرة، rpS6 لا يمكن أن تعمل بشكل صحيح في أعراض Mecp2 KO الفئران الذكور.

الشكل 1.
فقدان MeCP2 يؤدي إلى معيبة تفعيل rpS6 في القشرة S1 من فئران بالغة. (A) الميكروسكوب التمثيلية للS1 cryosections القشرة من الفئران أعراض في 56 يوما من العمر تبين انخفاض في كلا ف rpS6 (Ser235 / 236) وف rpS6 (Ser240 / 244) مناعية في الحيوانات MeCP2 KO. مجموع مناعية rpS6 لم يتغير بين WT والحيوانات السيطرة. إدراجات تظهر وجهات النظر أعلى التكبير من immunolabeling في الخلايا العصبية طبقة V. انخفاض سماكة القشري الذي أبداه أقسام MeCP2 KO مقارنة مع الضوابط WT هو ممثل عنها سابقا التعديلات التي تؤثر المسوخ المورفولوجية (61) وليس بسبب القطع الأثرية تثبيت أو عدم تطابق المناطق القشرية التي تم فحصها في هذه الدراسة. (B - D) المدرج الإحصائي توضح تقييم مستويات الفسفرة rpS6 وكذلك مجموع التعبير rpS6 في كل طبقة (I-VI) من القشرة S1. يتم التعبير عن البيانات والقيم التطوير التنظيمي يعني من وضع العلامات المناعي. (B) في P14، وكثافة وضع العلامات لكل من تفعيلها ويظهر rpS6 مجموعه أي اختلافات ذات دلالة إحصائية بين الفئران KO وتتزاحم WT. انخفاض ف rpS6 (Ser235 / 236 و Ser240 / 244) كثافة العلامات مهم للغاية وينتشر في جميع أنحاء الطبقات القشرية من P28 (C) وP56 (D) الفئران KO مقارنة مع تتزاحم WT. لا يتم تبديل الكلي التعبير rpS6 في هذه الحيوانات. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± ووزارة شؤون المرأة. * P <0.05، ** P <0.01 *** P <0.001 (شريط النطاق، 100 ميكرون).

لمعالجة ما إذا كانت مختلة الفسفرة rpS6 في القشرة إما أن توقع أو تتطابق مع تطور المرض، درسنا القادم الحيوانات KO في وقت سابق الأعمار ما بعد الولادة (أي P14 P28 و). كما هو موضح في الشكل 1 C، في P28، أي قبل ظهور العجز الحركي واضحة والخلفية الشبك أطرافهم في الفئران Mecp2 KO، تظهر طفرات انخفاض ذو معنى في إشارات مناعيا ف rpS6 (ف rpS6-Ser235 / 236: انخفاض 23.6٪ في الفئران KO مقابل تتزاحم WT، ن = 3 WT وKO، P <0.005؛ P-rpS6-Ser240 / 244: انخفاض 41.4٪ في الفئران KO مقابل تتزاحم WT، ن = 3 WT وKO، P <0.001). يثير الاهتمام والفضول، في مرحلة تنموية في وقت سابق بعد الولادة (P14)، عندما المسوخ هي أعراض، أظهرت الفئران KO مستويات WT تفعيل rpS6 (الشكل 1 B). في هذه المرحلة التنموية ما بعد الولادة المبكرة، اكتشفنا عدم وجود فروق في rpS6 كثافة المناعية لأي من المواقع الفسفرة في جميع أنحاء الطبقات القشرية. وأظهر التقييم الكمي للrpS6 المناعية عدم وجود فروق بين الأنماط الجينية اثنين على حد سواء P14 P28 و(الشكل 1 C و D). وتشير هذه البيانات إلى أن بعد فترة من النشاط العادي المفترض، rpS6 يصبح hypofunctional في علاقة مع بداية الأعراض.
لتحديد ما إذا rpS6 الفسفرة قد تتأثر على نحو مماثل في مناطق أخرى من الدماغ، ونحن، بعد ذلك، قام الباحثون بتحليل المناعى مماثل من ف rpS6 التعريب في منطقة الحصين CA1 من المسوخ Mecp2 في العصور الثلاثة التي سبق فحصها. ومن المثير للاهتمام، على الرغم من أن الخلايا العصبية CA1 الهرمية في MeCP2 KO الفئران أظهرت أقل تفعيل rpS6 من الحيوانات WT (المواد التكميلية، الشكل S1) كان التأثير أقل حدة مما لاحظنا في القشرة S1. على وجه الخصوص، وجدنا أن هناك انخفاضا كبيرا في تفعيل rpS6 على Ser240 / 244 في P28 الفئران KO (المواد التكميلية، الشكل S1D.، OD WT: 0.16 ± 0.02، OD KO: 0.08 ± 0.01، ن = 3 WT وKO ، P <0.05).
وقد تبين مؤخرا أن الخلايا الدبقية تفتقر MeCP2 قد يسبب تشوهات في التشكل شجيري وتعقيد الخلايا العصبية MeCP2 الإيجابي-coltured شارك الأمر الذي يعني الدور الحاسم للالدبقية في التعديلات العصبية المرتبطة RS (38). لاستكشاف ما إذا كانت التغييرات rpS6 الفسفرة وحظ في Mecp2 ترتبط (P28) المسوخ مع بعض التعديلات التي تحدث أيضا في الخلايا الدبقية قمنا بتحليل rpS6 الفسفرة في أقسام الدماغ المسمى بشكل مزدوج مع الأجسام المضادة ضد GFAP أو NeuN. كما هو موضح في الشكل S2، كان عدد GFAP + الخلايا الدبقية منخفضة جدا في جميع أنحاء طبقات من القشرة S1 في كل WT والحيوانات متحولة. وعلاوة على ذلك، كان يكاد لا توجد شارك في التعريب بين GFAP + الخلايا وف rpS6-Ser235 / 236 أو ف rpS6-Ser240 / 244 immunosignal اكتشافها في أقسام من كل من المورثات (المواد التكميلية، الشكل. S2A وB) مما يدل على أن rpS6 يظهر للغاية مستويات منخفضة من التنشيط في الخلايا الدبقية. في المقابل، وجدنا أن عمليا كل ف rpS6 + الخلايا القشرية وبوضوح شارك المسمى مع NeuN الأجسام المضادة (المواد التكميلية، الشكل. S2A وB). الأهم من ذلك، لوحظ تفعيل معين rpS6 العصبية أيضا في الفروع وصفت من المنطقة CA1 من الحصين (التكميلي المواد، الشكل. S2A وB). في الواقع، في حين كان ف rpS6 المناعي لا يمكن كشفها في GFAP + الخلايا، وكانت NeuN + CA1 الخلايا العصبية الهرمية المشترك المسمى مع الأجسام المضادة ف rpS6. وهكذا، وهذه البيانات تشير إلى أن عواقب rpS6 hypofunction في الدماغ من المسوخ Mecp2 تعزى في المقام الأول إلى عيوب تنشيط الخلايا العصبية.
في النهج الثاني، ونحن بشكل مستقل قياس انخفاض في مستويات rpS6 الفسفرة في Ser235 / 236 و Ser240 / 244 عن طريق التحليل الغربي لطخة التي أجريت على ثلاث مناطق الدماغ معزولة، أي القشرة الدماغية، الحصين والمخيخ. وأكد مستويات فسفرته rpS6 الى انخفضت بشدة في القشرة والمخيخ، وإلى حد أقل، في حصين العقول تفتقر Mecp2، في حين بلغ إجمالي مستويات rpS6 دون تغيير (القشرة: ف rpS6-Ser235 / 236، خفضت إلى 55.1 ± 11.1 ٪ من مستويات WT، ن =P = 0.001؛ P-rpS6-Ser240 / 244، خفضت إلى 35.2 ± 10.7٪ من مستويات WT، N = 8 P = 0.009؛ المخيخ: ف rpS6-Ser235 / 236، خفضت إلى 31.9 ± 6.5٪ من مستويات WT، ن = 6، P = 0.005؛ P-rpS6-Ser240 / 244، خفضت إلى 29.5 ± 12.6٪ من مستويات WT، ن =P = 0.002؛ الحصين: ف rpS6-Ser235 / 236، خفضت إلى 56.2 ± 5.6٪ من مستويات WT، ن =P = 0.02؛ P-rpS6-S240 / 244، خفضت إلى 68.9 ± 16.6٪ من مستويات WT، ن = 11، P = 0.15؛ الشكل 2 A -C). بشكل عام، وجدنا انخفاضا في الفسفرة في Ser240 / 244 و Ser235 / 236، باستثناء الحصين، حيث كان الانخفاض في Ser240 / 244 الفسفرة لا يعتد به إحصائيا مما يدل على أن وظيفة rpS6 قد تتأثر بشكل مختلف في الدوائر العصبية المحددة من قبل غياب Mecp2.

الرقم 2.
يتم تخفيض S6 الفسفرة في القشرة، المخيخ والحصين من MeCP2 - الحيوانات / Y. البقع التمثيلية الغربية (أعلى) والبيانات الموجزة (القاع) تظهر ف rpS6 ومجموعه pS6 في لست] خلية كاملة من القشرة (A)، المخيخ (B) وقرن آمون (C) من P56 MeCP2 KO وWT الفئران. جرى التحقيق البقع الغربية مع الأجسام المضادة لف Ser235 / 236 S6، ف Ser240 / 244 S6 ومجموع S6. أدرج تويولين كعنصر تحكم التحميل. كشفت وصمة عار الكميات التي فسفرة S6 في Ser235 / 236 هو انخفاض في القشرة، المخيخ والحصين الحيوانات MeCP2 KO. تم تخفيض rpS6 Ser240 / 244 الفسفرة بشكل كبير في MeCP2 KO القشرة والمخيخ ولكن ليس في قرن آمون. لم يكن الفرق موجودة في مجموع التعبير rpS6. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. * P <0.05.

يتأثر تخليق البروتين بشدة في Mecp2 العقول متحولة

وينظم فسفرة rpS6 من قبل ERK (31) ومسارات mTOR س مع آخرها بارزة في معظم الخلايا، وحساسة للغاية لmTOR س تثبيط (39). وعلاوة على ذلك، rpS6 الفسفرة يرتبط مع تفعيل جهاز تخليق البروتين (30).
مع هذا في الاعتبار، قررنا أن تحليل تخليق البروتين في Mecp2 فئرانا معدلة وراثيا في P56. يتم وضع علامات عصبية مرضية بالفعل في هذه المرحلة التي تجسدت عدم الاتزان الحركي، العاهات وكذلك العجز المعرفي والسلوك القلق (تعلم 37) وضعت بالفعل.
لديك مهلة قراءة تخليق البروتين، تم فحص إدماج 35 S-ميثيونين إلى بروتينات جديدة على في المختبر شرائح الدماغ مثقف من WT = 3) وMeCP2 العقول متحولة = 3). وأظهرت هذه العلامات الأيضية الاتجاه في الانخفاض في التأسيس ميثيونين (P = 0.06) في المسوخ (المواد التكميلية، الشكل S3)، مما دفعنا إلى تحليل تخفيض معين في الشروع في ترجمة بواسطة ملامح polysomal.
وتم إعداد مقتطفات خلية حشوية من Mecp2 متحولة ولست] الدماغ WT ومنشقة على التدرج السكروز. الرقم 3 ويظهر مقتطفات خلية الشخصية التي يتم تقليل نسبة polysomal الواضح في اثنين من المسوخ MeCP2 مختلفة (الخط الأحمر) بالمقارنة مع WT (خط أسود) العقول (WT، ن = 3؛ KO، ن = 3). لذلك، تضاءل تجمع العام للpolyribosomes ترجمة نشطة بشكل غير طبيعي في المخ متحولة حيث تقدم المرض. في الواقع، مسح قياس الكثافة من لمحات polysomal P56 الدماغ (الشكل 3 أظهر B) انخفاضا كبيرا في مجال قمم الريباسي في جزء polysome من Mecp2 الفئران لاغيا فيما يتعلق تتزاحم WT (نقصان 8 ± 0.1٪ من WT، ن = 3، P <0.05). باستمرار، كان هناك زيادة في مجال قمم الريباسي في الجزء خالية من مرنا من التدرج في Mecp2 الفئران لاغيا فيما يتعلق الضوابط WT (بزيادة قدرها 7.9 ± 0.08٪ من WT، ن =P <0.05).

الرقم 3.
يتم تخفيض الشروع في الترجمة في MeCP2 - / - الكبار والفئران الشابة. لمحات (A) Polysomal من WT P56 وMeCP2 KO مقتطفات مخ الفأر. كانت مجزأة مقتطفات الدماغ حشوية المستمدة من WT P56 والفئران MeCP2 KO على 15-50٪ (ث / ت) التدرج السكروز الخطية. تظهر ملامح Polysomal الفرق في الشروع في الترجمة بين الفئران الخالية WT وMeCP2. على وجه التحديد، والزيادة في 80S وانخفاض في polysomes القمم تشير إلى أن مستوى الترجمة في MeCP2 KO ينخفض. وتقدم (B) قياس الكثافة المسح الكمي لP56 الدماغ ملامح polysomal في رسم بياني شريطي. تمثل أشرطة الخطأ والانحرافات المعيارية من الوسائل. * P <0.05. ملامح (C) Polysomal من WT P26 وMeCP2 الماوس لاغيا مقتطفات الدماغ. كانت مجزأة مقتطفات الدماغ حشوية المستمدة من WT P26 والفئران MeCP2 KO على 15-50٪ (ث / ت) التدرج السكروز الخطية. وقد أجريت التجربة ذاتها إلى الكبد على الماوس، يظهر قليلا أو أي اختلاف في الترجمة بين WT وMeCP2 KO. وتقدم (D) قياس الكثافة المسح الكمي من منطقة قريبة من قمم الريباسي من P26 الدماغ ملامح polysomal في رسم بياني شريطي. تمثل أشرطة الخطأ والانحرافات المعيارية من الوسائل. ** P <0.01. (E) تم جمع الكسور من ملامح polysomal من WT P26 وMeCP2 العقول فارغة، TCA تتركز وتحليلها بواسطة SDS-PAGE. جرى التحقيق البروتينات لMeCP2، Rack1 (علامة من 40S، 80S وريبوسوم ترجمة) وeIF6 (علامة من 60S الحرة).

قد يكون سبب هذا الخلل من الشروع في معدل الترجمة من قبل الدولة للخطر العامة للطفرات في هذه المرحلة المتأخرة من المرض. في البديل، وهذا الخلل قد يكون حدث في وقت مبكر من تطور المرض الذي، مع ذلك، لا تزال كشفها حتى في المراحل المتأخرة من الأمراض. للتمييز بين هذين الاحتمالين، أجرينا لمحات polysomal في الشباب Mecp2 الحيوانات فارغة في مرحلة ما قبل الأعراض (P26). مقتطفات جديرة بالملاحظة، خلية لمحات تمثل ملحوظ خفض جزء polysomal عند مقارنة Mecp2 لاغيا مع العقول WT (WT، ن = 3؛ KO، ن = 3) (الشكل 3 C). مسح قياس الكثافة من لمحات polysomal P26 الدماغ (الشكل 3 أظهر D) انخفاضا كبيرا في مجال قمم الريباسي في جزء polysome من Mecp2 الفئران لاغيا فيما يتعلق WT تتزاحم (نقصان 7.6 ± 0.04٪ من WT، ن =P <0.01). باستمرار، كان هناك زيادة في مجال قمم الريباسي في الجزء خالية من مرنا من التدرج في Mecp2 الفئران لاغيا فيما يتعلق الضوابط WT (بزيادة قدرها 7.6 ± 0.03٪ من WT، ن =P <0.01). وتماشيا مع هذا الاستنتاج، ومقدار Rack1، عنصرا رئيسيا في ترجمة الريبوسوم، تم تخفيض أساسا في الكسور المترسبة سريعة (7 - 10). حيث تقع polyribosomes في لاغية MeCP2 فيما يتعلق لست] سيطرة الدماغ (الشكل 3 د). على العكس من ذلك، في نفس هذا مرحلة الشروع في ترجمة وجد فقط تأثرت بصورة طفيفة في كبد MeCP2 متحولة مع الاحترام للحيوانات WT (WT، ن = 3؛ KO، ن = 3)، وهو جهاز محيطي مع النشاط الأيضي الشديد (الشكل. 3 B). وتوفر هذه البيانات في أول إشارة إلى أن العيوب في بدء متعدية هي علامة مبكرة للمرض الذي يصاحب أو حتى يسبق إعاقة للجهاز العصبي الأولي في الفئران الخالية MeCP2.
فشل في بدء قد يكون لها تأثير عام على الترجمة مرنا العالمية أو، بدلا من ذلك، قد تؤثر على نصوص محددة على وجه الخصوص. لمعالجة هذه القضية، تم عزل الحمض النووي الريبي من كل جزء من لمحات الريباسي من P26 Mecp2 متحولة ولست] الدماغ WT ومستويات النص لجين معين تم تقييمها من قبل الكمي RT-PCR (QRT-PCR). اخترنا اثنين من الجينات الترميز لجزيئات مع وظيفة محورية في نشاط الخلايا العصبية واللدونة مثل CAMKIIα وPSD95. بالإضافة إلى ذلك، ثلاثة جينات لم يترافق مع وظيفة الخلايا العصبية كما تم تحليل (Rack1، hnRNP A2 / B1 وGADPH). أخيرا، قمنا بتقييم مستويات 18S الريباسي RNA (الريباسي) والتي يتم تضمينها في 40S الوحيدات الريباسي. في اتفاق تام مع التشكيلات polysomal، في MeCP2 العقول متحولة، تم تخفيض الريباسي 18S في جزء polysome والتخصيب في الجزء خالية من مرنا من التدرج (الشكل 4 A). ولوحظ اتجاه مماثل لCAMKIIα وPSD-95 من mRNAs فضلا عن Rack1، hnRNP A2 / B1 وGADPH من mRNAs (الشكل 4 B-D). في الواقع، كان التأسيس polysomal من هذه النصوص أقل من ذلك بكثير في Mecp2 الفئران لاغيا فيما يتعلق WT (الشكل 4 B-D). هذه الملاحظة يمكن التعبير عنها كميا بالنسبة المئوية للرسول على polysomes (PMP)، والذي يحسب بقسمة مجموع الإشارات quantitated من الكسور الستة الماضية التي تحتوي على polysomes نشط من مجموع 11 الكسور. في حالة الأنسجة السيطرة، وكانت قيمة PMP أكثر من 60٪ لجميع الجينات الست، في حين أنها حصلت على خفضت إلى ~50٪ في Mecp2 العقول متحولة (الشكل 4 D). معا، وهذه البيانات تظهر انخفاض مماثل في معدل ترجمة كل من mRNAs اختبارها.

الرقم 4.
وانخفض التأسيس Polysomal من 18S الريباسي وكذلك CAMKIIα، PSD95، Rack1، hnRNP A2 / B1 وGADPH من mRNAs في غياب MeCP2. كانت مجزأة مقتطفات الدماغ حشوية المستمدة من WT P26 وMeCP2 الفئران فارغة على 15-50٪ (ث / ت) التدرج السكروز الخطية. ومجزأة كل التدرج إلى 11 الكسور 1 مل، تم استخراج الحمض النووي الريبي من كل الكسور وQRT-PCR تحليل الحمض النووي الريبي مجموع أجريت في كل جزء خارجا مع الاشعال محددة ل18S، CAMKIIα PSD95، Rack1، hnRNP A2 / B1 وGADPH. نتائج مجمعة إلى خمس مجموعات: حلالة مائية (H)، 40S، 60S، 80S وpolysomes. تمثل أشرطة الخطأ والانحرافات المعيارية من وسائل = 3). * P <0.05 لKO مقابل WT التي كتبها الطالب ر -test. وانخفض 18S، CAMKIIα وPSD95 مرنا مستويات كبيرة في polysomes نشط من MeCP2 KO الدماغ (A - D). هذه البيانات تشير إلى أن انخفاض مستويات الترجمة مرنا في MeCP2 KO. وتفيد التقارير (D) الرسم البياني للPMP. تم احتساب PMP بمقارنة مستوى مرنا من الكسور التي تحتوي polysomes النشط مع مستوى مرنا من جميع الكسور 11.

ومن دواعي AKT / mTOR س الإشارات في Mecp2 أنسجة المخ متحولة

الترجمة مرنا هي عملية تنظيم للغاية وتمثل الهدف النهائي من مسارات الإشارات المتنوعة التي يحس كل من المحفزات من البيئة الخارجية وكذلك احتياجات التمثيل الغذائي. ولذلك، قررنا أن التحقيق في أي تغييرات في مسارات الخلايا المختلفة المشاركة في تخليق البروتين. ومن المعروف جيدا أن rpS6 هو الركيزة الرئيسية P70 S6 كيناز (S6K) الذي يعزز الفسفرة مخلفات سيرين متتالية في الجزء rpS6 C-المحطة، وبالتالي تحفيز ترجمة البروتين (30). تفعيل S6K P70 يعتمد على الأحداث الفسفرة متعددة تحدث بطريقة هرمية ضمن المجال autoinhibitory-C محطة (40). ومن المثير للاهتمام، تم تخفيض مستويات الفسفرة S6K في لست] دماغ P48 Mecp2 متحولة فيما يتعلق تتزاحم WT (نقصان 35 ± 6٪ من WT، ن = 3 WT وKO؛ P <0.05) (الشكل 5 أ و ب). في المقابل، تم الكشف عن أي تغيير ملموس في S6K فرة البروتين بين Mecp2 لست] فارغة وWT الدماغ (الشكل 5 أ و ب).

الرقم 5.
قمع يشير mTOR س في MeCP2 - / ص مخ الفأر. تم فصل (A) لست] الدماغ من WT P26 وMeCP2 الفئران الخالية التي كتبها SDS-PAGE، ومن ثم تم تحليل الفسفرة P70 S6K لطخة الغربية. جرى التحقيق البقع الغربية مع الأجسام المضادة ضد S6K ف Thr421 / Ser424-P70 و P70 مجموعه S6K. أدرج GADPH كعنصر تحكم التحميل. وكشف تحليل لطخة غربية أن الفسفرة P70 S6K يتم تقليل باسالي في MeCP2 KO الدماغ. وتقدم (B) قياس الكثافة المسح الكمي من الوفرة النسبية للف P70 S6K في رسم بياني شريطي. قيم تتوافق مع وسائل ثلاث تجارب مستقلة. تمثل أشرطة الخطأ والانحرافات المعيارية من الوسائل. (C) نفس التجربة كما هو الحال في (A) قد نفذ مع الأجسام المضادة لف Ser2448-mTOR س ومجموع mTOR س. أدرج تويولين كعنصر تحكم التحميل. (D) بيانات موجزة تبين الوفرة النسبية للف Ser2448-mTOR س في لست] كامل الدماغ من MeCP2 KO وWT الفئران. قيم تتوافق مع وسائل ثلاث تجارب مستقلة. تمثل أشرطة الخطأ والانحرافات المعيارية من الوسائل. * P <0.05.

وقد أظهرت مجموعة كبيرة من الأدلة على أن مسار rpS6-S6K لرقابة مشددة من قبل النشاط كيناز mTOR س الذي يدمج إشارات من العوامل مولد للتفتل النمو، والمغذيات، والإجهاد، ومستوى الطاقة الخلوية لتعزيز تخليق البروتين (41، 42). ولذلك، درسنا وفرة والفسفرة من mTOR س في Ser2448، وهو مؤشر البيوكيميائية تفعيل mTOR س (41)، في Mecp2 KO ولست] الدماغ WT. تم تخفيض الفسفرة mTOR س في Ser2448 في لست] خلية كاملة من الدماغ من MeCP2 فئرانا معدلة وراثيا (نقصان 27 ± 7٪ من WT، ن = 3 WT وKO؛ P <0.05) بالنسبة لتلك التي تتزاحم WT (الشكل. 5 C و D). في المقابل، كان مقدار البروتين الكلي mTOR س يعادل في كل من التراكيب الوراثية مما يدل على الفرق استنساخه حصرا لشكل فسفرته لها (الشكل 5 C و D). ومن المعروف rpS6 تفعيلها أيضا يشير التعاقبي RAS-ERK من خلال الفسفرة من قبل P90 الريباسي S6K حصرا في Ser235 / 236 (31). وهكذا، درسنا مستويات تفعيل Erk1 / 2 تحركات في أدمغة تفتقر Mecp2. لم يلاحظ أي فرق في ERK2 الفسفرة في نفس الفئران (94.4 ± 17٪ من مستويات WT، ن = 11، P = 0.56) (الشكل 6 A و B).

الرقم 6.
يتم تخفيض AKT الفسفرة في MeCP2 - / - مخ الفأر. (A) البقع التمثيلية الغربية (أعلى) والبيانات الموجزة (القاع) يظهر رفع معنوياته ومجموع ERK في لست] من الدماغ كله من MeCP2 KO وWT الفئران. أدرج تويولين كعنصر تحكم التحميل. أظهر (B) وصمة عار الكمي أن أي تغيير في pERK2 أو الكلي ERK2 كان حاضرا في الفئران MeCP2 KO. بسبب مستويات منخفضة للغاية من التعبير عن ERK1، تم تحليل ERK2 فقط. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للسائل. (C) البقع التمثيلية الغربية تظهر PAKT ومجموع AKT في لست] كامل الدماغ من P56 MeCP2 KO وWT الفئران. لاحظ أن الفسفرة AKT في Ser473 وانخفض في الحيوان MeCP2 KO. (D) وصمة عار الكميات أظهرت أن PAKT هو انخفاض واضح في الفئران MeCP2 KO. لم يكن تأثير موجودة على المستويات الإجمالية AKT. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للسائل. * P <0.05.

النتائج الواردة في التقرير وبالتالي توحي بكثير عيب معين وليس في mTOR س الإشارة في دماغ الفئران MeCP2 KO. اثنين على الأقل من المجمعات mTOR س موجودة، mTORc1، المنبع من rpS6، وmTORc2. حالة الفسفرة S473 يعتمد بشكل مباشر من حيث نوع النشاط mTORc2 ويمثل مؤشرا على النشاط mTOR س الكلي في الخلية (وبالتالي 43). ومن المثير للاهتمام، وجدنا تخفيض ثابت في AKT S473 الفسفرة في متحولة Mecp2 مقارنة مع WT لست] P46 الدماغ (الانخفاض إلى 45.7 ± 9.5٪ من مستويات WT، ن = 10، P = 0.037) (الشكل 6 C و D).
الفرق في الفوسفات-AKT يبدو أن يعزى إلى تغيرات في ولاية تفعيل القاعدية، بسبب وفرة مجموع AKT لم تختلف كثيرا في فئرانا معدلة وراثيا النسبي لتتزاحم WT (الشكل 6 A و B).
بشكل إجمالي، فإن هذه النتائج تقدم دليلا على وجود خلل وظيفي العام للإشارات AKT / mTOR س المرتبطة تطور المرض في Mecp2 العقول متحولة.

MeCP2 ليس البروتين المقيمين الريباسي

لتقييم أي مشاركة مباشرة من MeCP2 في السيطرة على تخليق البروتين، ونحن التحقيق ارتباطه مع الآلات الريباسي. في لمحات polysomal، والمترجمة MeCP2 أساسا في الكسور 1-5 جزئيا شارك بكسر مع مفارز الريباسي 40S، 60S 80S وكما تم اختبارها من قبل immunoblotting مع اثنين من الأجسام المضادة مختلفة في كل جزء من التدرج (انظر المواد وطرق). لتحديد ما إذا كان المشارك الترسيب من MeCP2 مع ريبوسوم مستقر، كررنا ملامح الريباسي بعد علاج مقتطفات الخلية مع EDTA (30 م م) والذي يسبب التفكك الكامل للريبوسوم ترجمة إلى وحدات والإفراج عن mRNPs polyribosomal. في هذه الحالة، البروتينات المرتبطة الريباسي لم يعد تم جمعها من الكسور التدرج المترسبة سريعة، ولكن تم استردادها من كسور في الجزء العلوي من التدرج السكروز (المواد التكميلية، الشكل. S4). وتماشيا مع هذا، Rack1، وهو بروتين مستقرة المرتبطة ريبوسوم، بعد العلاج EDTA ويقع معظمها في المحتوى القابل للذوبان الخلوي تؤكد النتيجة المتوقعة. ومع ذلك، في ظل هذه الظروف، كان النمط الترسيب MeCP2 لا تحول إلى الكسور أخف وزنا ولا يتغير بطرق واضحة أخرى (المواد التكميلية، الشكل. S4). وتشير هذه النتائج إلى أن MeCP2 يرتبط المجمعات الجزيئية العالية مرجح لكن لا يرتبط مستقر مع المجمعات الريباسي.

الفسفرة rpS6 غير طبيعي في Mecp2 +/- إناث الفئران

Mecp2 ص / - المسوخ هي نموذج حيواني الأكثر استخداما لتقييم العواقب القاسية للMeCP2 الطفرة. ومع ذلك، فإن أكبر عدد من المرضى RTT المتأثرة-تحور MECP2 متغايرة الفتيات. Mecp2 +/- إناث الفئران تمتلك الصفات المظهرية مختلفة من المرضى RTT، مثل الحركي اللاإرادي والتعديلات والسلوك المعرفي والعاطفي الشاذ وكذلك عمر عادية نسبيا .
وبالتالي قمنا بتحليل إذا انخفضت فسفرة rpS6 في الدماغ من 10 شهرا المسوخ متخالف الإناث التي أظهرت علامات واضحة لعلم الأمراض (مثل الهزات، وتخفيض حجم والعيوب الحركي الحاد). كما هو مبين في الشكل 7 A، وجدنا أن شدة المناعية لأشكال فسفرته من rpS6 (Ser235 / 236 و Ser240 / 244 موقعا) وانخفاض شديد في الدماغ من Mecp2 +/- المسوخ مقارنة مع إناث الحيوانات WT من نفسه سن. وقد لوحظ انخفاض في مستويات ف rpS6 في جميع أنحاء طبقات من القشرة S1 وفي المنطقة CA1 من الحصين (الشكل 7 A). في الواقع، وتحليل OD من شدة immunolabeling (الشكل 7 B) أظهر انخفاضا كبيرا في تفعيل rpS6 في كل Ser235 / 236 (P <0.001) وSer240 / 244 (P <0.001) في القشرة S1 من MeCP2 المسوخ متخالف. وجدنا انخفاض 60.1٪ في ف rpS6 (Ser235 / 236) التنشيط في قشرة Mecp2 +/- الفئران فيما يتعلق تتزاحم WT = 5، P <0.001)، في حين أن تفعيل ف rpS6 (Ser240 / 244) وكان 41.9٪ في المسوخ الإناث أقل مما كانت عليه في الحيوانات التحكم = 5، P <0.001). وبالمثل، كان هناك انخفاض في تنشيط immunolocalization rpS6 في طبقة الخلايا الهرمية في المنطقة CA1 في حصين طفرات الإناث مقارنة مع الضوابط WT (الشكل 8 C؛ ف rpS6-Ser235 / 236: OD WT، 0.45 ± 0.02 و OD KO، 0.26 ± 0.03، ن = 5، P <0.001؛ P-rpS6-Ser240 / 244: OD WT، 0.38 ± 0.03 و OD KO، 0.21 ± 0.03، ن = 5، P <0.01). لم يتم العثور على الاختلافات في مجموع التعبير rpS6 في المنطقتين درست بين Mecp2 +/- المسوخ والفئران WT (الشكل 7 A-C؛ P> 0.5). وتشير هذه النتائج إلى أن مستويات غيرت من تفعيل rpS6 يمكن العثور عليها في نموذج حيواني من RTT تشبه عن كثب أمراض الإنسان.

الرقم 7.
يتم تخفيض تفعيل rpS6 في دماغ MeCP2 أعراض +/- إناث الفئران. (A) كشف المناعى للف rpS6 (Ser235 / 236)، ف rpS6 (Ser240 / 244) ومجموع rpS6 في القشرة S1 وفي المنطقة CA1 من الحصين في MeCP2 +/- إناث الفئران وWT يتحكم في 10 شهرا من العمر. إدراجات تظهر وجهات النظر التكبير العليا للنمط immunolabeling في الخلايا العصبية طبقة V من القشرة S1. (B وC تظهر) المدرج الإحصائي التحليل الكمي للكثافة وسم ف rpS6 ومجموع التعبير rpS6 في طبقات I-VI من القشرة S1 وكذلك في طبقة الخلايا الهرمية CA1 من الحصين. وانخفض التعبير عن ف rpS6 (Ser235 / 236) وف rpS6 (Ser240 / 244) إلى حد كبير في MeCP2 +/- الفئران مقارنة مع الضوابط WT في كل طبقة القشرية (B)، وكذلك في المنطقة CA1 من الحصين (C) مقارنة مع الحيوانات السيطرة. مجموع كثافة rpS6 المناعية هي دون تغيير بين الأنماط الجينية في المنطقتين فحصها. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SEM. ** P <0.01 *** P <0.001 (الحانات النطاق، 50 ميكرومتر).


الرقم 8.
التعديلات من rpS6 الفسفرة هي غير خلية مستقلة في MeCP2 أعراض +/- طفرات الإناث. (A) ليزر الممثل الصور مبائر تظهر العلامات المزدوج المناعي للف rpS6 (Ser235 / 236) أو ف rpS6 (Ser240 / 244) (الخضراء) وMeCP2 (الحمراء) في الخلايا العصبية طبقة V من القشرة S1 من WT وMeCP2 +/- الفئران. الخلايا العصبية التي تفتقر إلى MeCP2 مناعية في الإناث MeCP2 +/- يشار إلى الفئران (السهام). لاحظ أنه إشارة المناعي للف rpS6 (Ser235 / 236) وف rpS6 (Ser240 / 244) ملاحظته انخفاض في الخلايا العصبية من MeCP2 +/- الفئران مقارنة مع WT. لا توجد فروق واضحة في كثافة تلطيخ يمكن اكتشافها بين MeCP2 + وMeCP2 - الخلايا العصبية في MeCP2 +/- أقسام القشرية. (B) المدرج الإحصائي تبين أن الكمية، مقارنة مع الضوابط WT، هناك انخفاض كبير في ف rpS6 (Ser235 / 236) وف rpS6 (Ser240 / 244) المناعي في MeCP2 +/- الفئران التي تحدث مع عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية سواء في MeCP2 + وMeCP2 - العصبونات القشرية. (C) الإسفار تظهر MeCP2 مناعية في تركيبة مع دابي مباين في القشرة S1 من MeCP2 الإناث صورة +/- الفئران. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SEM. * P ≤ 0.05 *** P ≤ 0.001 (شريط النطاق، 20 ميكرومتر).

MeCP2 غير الخلية تأثير مستقل على rpS6 الفسفرة

وأخيرا، فإننا نفترض أنه إذا Mecp2 آثار الخسارة الناتجة عن مثل هذه الإشارات المسار المعقد، ونقص في قد يؤدي إلى عدم خلية آثار الحكم الذاتي. على العكس من ذلك، إذا تم إنتاج العجز تفعيل rpS6 من خلال آلية تماما خلايا مستقلة في الإناث متخالف الخلايا فقط التعبير عن أليل باطل سوف يحمل النمط الظاهري. لاختبار هذه الفرضية، ونحن كميا تحليلها ف rpS6 التعريب في القشرة S1 من Mecp2 الإناث متغايرة التي تظهر التعبير فسيفساء من العدم والبرية من نوع Mecp2 الأليلات الناجمة عن تعطيل عشوائي واحدة مرتبطة X Mecp2 أليل (44). ومن المثير للاهتمام، وأظهر تحليل تضخم عالية صور متحد البؤر التي ف rpS6 المناعي تم تخفيض الواضح ليس فقط في الخلايا العصبية MeCP2 سلبية، ولكن حتى في MeCP2 معربا عن الخلايا المجاورة (الشكل 8 A). في الواقع، وقياس متوسط ​​ف rpS6 كثافة مضان في سوما الخلية (الشكل 8 B) كشفت عدم وجود فروق بين MeCP2 + وMeCP2 - الخلايا العصبية (ف rpS6-Ser235 / 236، MeCP2 + مقابل MeCP2 - الخلايا، ن = 4، P> 0.3؛ ف rpS6-Ser240 / 244، MeCP2 + مقابل MeCP2 - الخلايا، ن = 4، P> 0.1). لاحظ أنه في MeCP2 + العصبونات القشرية من Mecp2 الإناث متغايرة، إشارة المناعي للMeCP2 بالضبط شارك محلية مع نقاط ومشرق للدابي مباين في النواة (الشكل 8 C). هذه النتيجة تشير إلى أن حتى خسارة فسيفساء من MeCP2 في أنسجة الإناث متغايرة قد تمارس انخفاض أعم في مسارات إشارات والمستجيبات لها المصب.

نقاش

في هذه الدراسة، حددنا كيف يتم تقليل الفسفرة rpS6 على نطاق واسع في مناطق الدماغ المختلفة وعلى مراحل مختلفة في الفئران التي تفتقر Mecp2. والمثير للدهشة، وهذا العيب هو كشفها في وقت مبكر للغاية أثناء التطور بعد الولادة قريبا قبل علامات عصبية لهذا المرض تتجلى بوضوح. rpS6 مستويات غير طبيعية منخفضة من الفسفرة هي ملحوظة في كل من Mecp2 الذكور والإناث فارغة متغايرة وديناميكية للحد من يتبع تدهور الظروف العصبية. لذلك، ف rpS6 قد تمثل العلامات البيولوجية قيمة من ظهور المرض وتطوره. وهذا أمر مهم خاصة بالنسبة للRTT التي تفتقر حاليا أي الواسمات الجزيئية يمكن الاعتماد عليها لمتابعة تقدمه عصبية مرضية.
لاحظنا أن فسفرة rpS6 يتم تخفيض في كل MeCP2 - وMeCP2 + الخلايا العصبية في أدمغة Mecp2 متخالف الإناث. وتشير هذه النتيجة إلى أن rpS6 الفوسفات المستويات في MeCP2 الخلايا معربا يتم رفع القيود عن وجود المجاورة Mecp2 الخلايا العصبية فارغة. قد يكون ذلك بسبب إفراز شاذة من الخلايا العصبية أو الخلايا الدبقية متحولة من العوامل القابلة للذوبان (s) مع التأثيرات السمية العصبية. يمكن الافتراض أنها كذلك أن اضطراب وظيفي للخلايا العصبية متحولة يمنع نشاط الخلايا العصبية في الخلايا المجاورة وبالتالي الحد من rpS6 الفسفرة. كلا الاحتمالين ليست بديلة، ويمكن أن تحدث في وقت واحد في مختلف الرتب. وقد اقترحت الخلل في غير الخلية مسارات مستقلة فعلا بالمساهمة في RTT التقدم. في الواقع، Mecp2 تم العثور على الخلايا النجمية متحولة وكذلك الخلايا الدبقية الصغيرة للحث على عيوب متعددة في الخلايا العصبية WT بما في ذلك الزخرفة الجذعية، تشكيل المشبك والاستقرار أنيبيب (+45 - +48). ومع ذلك، أشارت دراستنا أن ف rpS6 immunolabeling التعبير في الخلايا الدبقية تحت مستوى الكشف عن عالية الدقة متحد البؤر المجهري، مما يشير إلى أن الخلايا الدبقية قد لا تسهم إلى حد كبير في الحد من rpS6 الفسفرة في دماغ الفئران MeCP2 KO. توضيح من غير الخلية الآليات الجزيئية مستقلة تعمل في الشبكات العصبية فسيفساء لMecp2 سوف طفرة ستكون حاسمة لفهمنا للإمراض المرض لدى البشر، مما يؤثر في الواقع الفتيات متخالف في المقام الأول.
هنا، اكتشفنا انخفاض في إشارة AKT / mTOR س مرتبطة بضعف تخليق البروتين في Mecp2 العقول متحولة. على حد علمنا، هذه هي المرة الأولى التي تقوم فيها سلسلة الجزيئية الخلوية مع وظائف عديد المظاهر في السيطرة على توازن الخلية تم العثور على تغيير في RTT. هذه العيوب الجزيئية مجتمعة قد تكون مسؤولة على الأقل جزئيا عن انخفاض عدد نقاط الاشتباك العصبي الحصين مثير وصفها في الفئران التي تفتقر Mecp2 (13، 15، 34 - +36). ومع ذلك، RTT يعرض العيوب الجزيئية المعاكس بالمقارنة مع الاضطرابات العصبية النمائية المماثلة، مثل X الهشة، والتصلب درني والتوحد PTEN التي تعتمد، حيث، بدلا من ذلك، يشير mTOR س ونتيجة تخليق البروتين aberrantly يصل تنظيم (49). وهكذا، RTT تقديم ميزات الجزيئية غريبة حيث يترافق hypoactivation من الإشارات mTOR س وتخليق البروتين محدود مع انخفاض اتصال متشابك كما افترض بالفعل كيليهر والدب (17). وعلى الرغم من الأساس الجزيئي مختلف من RTT فيما يتعلق بالأمراض المذكورة الأخرى، والناتج النهائي هو لا يختلف ذلك، كما هو الحال في كلتا الحالتين، فإنه يسبب خسارة في أداء الشبكة العصبية. في هذا السيناريو، والأعراض العصبية السريرية الشاملة وصفها بأنها العجز المعرفي والتوحد وضعاف اللغة والتواصل قد تنشأ من إيجابية وكذلك عدم الاتزان السلبي لنفس العمليات الجزيئية.
مجموعة كبيرة من الأدلة تشير إلى أن AKT / mTOR س إشارات الطريق هو المغير أساسيا في عملية الترجمة، وكثيرا ما يرتبط نقصه مع عيوب في السيطرة تخليق البروتين (41، 42، 50). وتمشيا مع هذه الأدلة، حددنا انخفاض ملحوظ في معدل ترجمة الشامل في Mecp2 العقول متحولة. وكان هذا الانخفاض واضحا من خلال تحليل جزء polysomal التنميط الريباسي، في حين أن أقل أهمية في خارج الجسم الحي الأيض نظام وضع العلامات. وربما يرجع ذلك لاختلاف مستويات حساسية / الضوضاء المرتبطة مع اثنين من المناهج المختلفة. بدلا من ذلك، وعجز في دوران بروتين في أدمغة متحولة قد تؤثر على النتيجة النهائية للوضع العلامات الأيضية، في حين لا تؤثر في بأي حال من الأحوال التنميط الريباسي التي تمثل لقطة من الشروع في الترجمة. والدراسات المستقبلية التحقيق في ما إذا كان ضعف دوران البروتين في MeCP2 العقول متحولة.
يثير الاهتمام والفضول، وعيوب تخليق البروتين تحدث في RTT في وقت مبكر جدا. حتى لو كان، في الوقت الحاضر، ونحن لا يمكن أن تشير إلى ما إذا كان هذا عيب متعدية يقف كسبب أو تأثير المبكر للمرض، فمن المرجح أنه يسهم في تطور الشامل للمرض. في هذه الدراسة، ونحن لم تعالج ما إذا كان معدل تخليق البروتين المحلي يتأثر على نحو مماثل. ومع ذلك، فإن الانخفاض في النشاط mTOR س هو مثل المتفشي في Mecp2 العقول متحولة من المرجح أن تؤثر على كل من عمليات التوليف العالمية والمحلية في المدى قابلة للمقارنة.
لتحديد ما إذا كان القمع متعدية في Mecp2 المسوخ يؤثر النصوص المختلفة مع حجم مماثل، قمنا بتقييم كمية الفعال من mRNAs على polysomes للجينات غير مباشرة ذات الصلة مع دورا محوريا في نشاط الخلايا العصبية مثل CAMKIIα وPSD-95. ومن المثير للاهتمام، وجدنا أن إدماج polysomal من النصوص اثنين كان أقل من ذلك بكثير في Mecp2 الفئران لاغيا فيما يتعلق WT. ولوحظ اتجاه مماثل لRack1، hnRNP A2 / B1 وGADPH من mRNAs. هذه كود ثلاثة جينات لجزيئات التي لا تشترك في نشاط الخلايا العصبية واللدونة. على الرغم من أن يقتصر على تحليل بعض الجينات، فإن هذه النتائج تشير إلى أن ضعف الترجمة ليس حدثا مقتصرا على عدد قليل من النصوص فقط الجينات التي تؤثر على على معدل إنتاج البروتين في مستويات مماثلة.
على هذا الأساس، نحن نؤيد فكرة أن على نطاق واسع إنتاج محدود البروتين في Mecp2 الخلايا العصبية فارغة قد كبح بمرور الوقت نشاطهم التمثيل الغذائي، وفي نهاية المطاف، استثارة واللدونة.
وبالنظر إلى أن MeCP2 هو النسخي المنظم المرتبط ونين، وقد تم وضع جهد كبير في تحديد الجينات تغير يحدث في Mecp2 العقول متحولة. ومع ذلك، فقد تم تحديد كمية صغيرة نسبيا من الجينات أن أعرب aberrantly التي لا حساب لشرح الكامل لتطوير علامات عصبية مرضية (1، 27، 28). لماذا هذا هو الحال فإنه لا يزال لا يزال بعيد المنال. وقد اقترح أن المرض قد تكون مترسخة في ذلك، ولكن خفية على نطاق الجينوم، ورفع القيود مستويات التعبير الجيني العالمية (51). بدلا من ذلك، التعديلات الجينات المرضية هي نوع من الخلايا العصبية بدقة محددة وشاقة الكشف عن هويته في الدراسات الشخصي التعبير التي أجريت حتى الآن على المناطق الفرعية الدماغ بأكمله (52). ومع ذلك، وصفنا مستوى جديد من التعقيد للمرض الذي يمثله ديسريغولاتيون على نطاق واسع لعملية تخليق البروتين.
وبالنظر إلى نتائجنا، الجينات اضطراب وظيفي في RTT قد تنجم عن مجموع الجينات المحررة من القيود التنظيمية تليها قدرة محدودة لإنتاج بروتينات وظيفية.
وبالنظر إلى التعديلات التي اكتشفنا في عمليتين ترتبط ارتباطا وثيقا مثل AKT / mTOR س الإشارات ومعدل تخليق البروتين، فإننا نقترح وجود خلل في هذا الممر الخلوي هو المسؤول عن مراقبة متعدية تغيير في Mecp2 الخلايا العصبية متحولة. في المقابل، لم نجد أي دليل على وجود دور مباشر لMeCP2 في آلية الريباسي السيطرة على عمليات متعدية. وهذا هو أيضا يتفق مع توطين التحت خلوية من MeCP2 تقتصر على وجه الحصر تقريبا في نواة الخلايا العصبية متباينة (11، 44، 53). وعلاوة على ذلك، يتم استبعاد MeCP2 من الأنوية في مقصورة النووية حيث نشأة الريباسي تتخذ أساسا مكان (54، 55) (S. ريكياردي وV. القرنبيط، ونتائج غير منشورة). ومع ذلك، لا يمكننا استبعاد أن MeCP2 قد تنظم ترجمة المبادرة من خلال ربط مع مكونات المجمع قبل الشروع (56). قد يكون هذا يتفق أيضا مع قدرة MeCP2 لربط RNA وتنظيم التجهيز لها (57). هذا الاحتمال تستدعي التحقيقات في المستقبل أن يكون أفضل المرسومة.
في الختام، حددنا يشير AKT / mTOR س كمسار الجزيئي ينظم إلى أسفل في Mecp2 الخلايا العصبية فارغة. وتمشيا مع هذا الاستنتاج، هو انخفاض rpS6 الفسفرة في مناطق واسعة من Mecp2 اغية الذكور أو الإناث العقول متخالف توفير العلامات البيولوجية مثيرة للاهتمام لمتابعة ديناميات الأمراض. وأخيرا، تم العثور على العملية العامة لتخليق البروتين من الواضح ضعف بشكل مفاجئ حتى في مرحلة مبكرة قبل أعراض، مما يجعل من المحتمل مساهمتها في تطور المرض. على الرغم من أن نتائجنا أظهرت سيطرة متعدية كعملية إضافية تتغير من خلال عملية المرضية. ومع ذلك، لأنها توفر سياق الرواية حيث يمكن تطوير التدخلات العلاجية لكبح جماح بنجاح أو تحسين وضع RTT.

المواد والأساليب

الحيوانات

وأجريت التجارب التي أجريت في هذه الدراسة وفقا لتوجيهات مجلس الاتحاد الأوروبي 86/609 / EEC لرعاية واستخدام حيوانات التجارب مع البروتوكولات التي وافق عليها مجلس الوزراء الايطالي للبحوث العلمية. للحصول على ليترات من الحيوانات WT وMecp2 المسوخ المستخدمة في هذه الدراسة، متخالف Mecp2 tml.lJae الفئران مع اكسون 3 الحذف في Mecp2 (8) وقد عبرت لC57BL6 لجيل واحد، تليها تربية الأبناء بين وتمت المحافظة على خلفية مختلطة . واستخدمت تتزاحم العمر المتطابقة في كل الظروف التجريبية لتجنب العواقب المحتملة لخلفية وراثية لا علاقة لها Mecp2 طفرة (37).

المناعية والمناعي

تم تخدير الحيوانات مع حقن داخل الصفاق من الكلورال هيدرات وperfused transcardially مع الثلج الباردة بارافورمالدهيد 4٪ في 0.1 م العازلة الفوسفات (PB، ودرجة الحموضة 7.4). بعد نضح، تم تشريح أدمغة والاحتفاظ بها في نفس الحل تثبيتي بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. بعد عدة غسلات في 0.1 م PB، والعقول ثم cryoprotected عن طريق الغمر في 10 و 20 و 30٪ حلول السكروز وخفض في وقت لاحق في الفروع 30 ميكرون مع ناظم البرد. تم جمع Cryosections في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 0.01 م، ودرجة الحموضة 7.4) ومعالجتها لالمناعية التعويم الحر كما هو موضح (58). بعد خطوة حظر في حل PBS تحتوي على 0.05٪ تريتون X-100 و 10٪ مصل الماعز العادي (خ ع)، وأقسام ثم حضنت بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع الأجسام المضادة الأولية التالية: أرنب مكافحة الفوسفات-rpS6 (Ser235 / 236) (1: 100)؛ أرنب لمكافحة الفوسفات-rpS6 (Ser240 / 244) (1: 200)؛ أرنب المضادة للrpS6 (1: 100) من خلية اشارة التكنولوجيا (دانفرس، MA، الولايات المتحدة الأمريكية). وكانت مخففة الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني مع 3٪ NGS و 0.05 تريتون X-100. وبعد ذلك يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني (4 × 10 دقيقة)، المحتضنة لمدة 1 ساعة مع الأجسام المضادة الماعز المضادة للأرنب البيروكسيديز الثانوية (1: 250؛ ناقلات مختبرات، بورلنجام، CA، الولايات المتحدة الأمريكية) المخفف في 3٪ NGS و 0.05٪ تريتون X- 100 في برنامج تلفزيوني وتحويلها إلى محلول يحتوي على مجمع البيوتين أفيدين (1: 100، المتجهات مختبرات). وتصور ناتج تفاعل البيروكسيداز التي كتبها حضانة في محلول يحتوي على 3،3'-diaminobenzidine (0.05٪ في تريس، HCI، ودرجة الحموضة 7.6) مع 0.01٪ H 2 O 2 لمدة 3 دقائق. وقد شنت المقاطع على الشرائح الزجاجية المغلفة الجيلاتين ويلاحظ مع مجهر الضوء (الكسوف 800، نيكون، اليابان) مجهزة بكاميرا CCD (Axiocam الهيئة العليا للإغاثة، زايس، ألمانيا).
وقد أجريت المناعي مزدوج مع اضافة في وقت واحد من الأجسام المضادة الأولية كما هو موضح (59). لفترة وجيزة، وأغلقت cryosections في 10٪ مصل حمار عادي مع 0.05٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة، ثم حضنت في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية التالية: أرنب مكافحة الفوسفات-rpS6 (Ser235 / 236) (1: 100)، الأرنب مكافحة الفوسفات-rpS6 (Ser240 / 244) (1: 200)، الماعز المضادة للMeCP2 (1: 250، سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، سانتا كروز، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية)، والماوس مكافحة NeuN (1: 100، Chemicon، بيليريكا، MA، الولايات المتحدة الأمريكية) والفأر مكافحة GFAP (1: 100، خلية اشارة التكنولوجيا). بعد PBS الغسيل، وحضنت المقاطع مع الأجسام المضادة الفلورسنت الثانوية (حمار المضادة للأرنب اليكسا 488، المسابر الجزيئية؛ حمار المضادة للماعز اليكسا 594، إينفيتروجن، حمار المضادة للماوس اليكسا 594، المسابر الجزيئية) لمدة 1 ساعة، وبعد عدة يشطف PBS ، حضنت مع دابي (1: 500، إينفيتروجن)، التي شنت على الشرائح الزجاجية المغلفة الجيلاتين، ولاحظ مع المجهر متحد البؤر (زايس LSM-5 باسكال، ألمانيا).

تحليل البيانات المناعى

تم تحليل وضع العلامات الكلي للبيروكسيديز في التجارب المناعية كميا عن طريق قياس OD في الميكروسكوب (10 ×) باستخدام المجال العام البرمجيات المخصصة (يماغيج، الولايات المتحدة الأمريكية) من قبل المشغل أعمى إلى التركيب الوراثي. وقد تم الحصول على قياسات OD في القشرة من 100 × 50 ميكرون صناديق قياس التي تم وضعها بشكل عشوائي في كل طبقة القشرية. تم الحصول على القيم التطوير التنظيمي في قرن آمون من طبقة الخلايا الهرمية CA1. توضح رسوم بيانية متوسط ​​OD تم الحصول عليها من ثلاثة تدابير المتكررة في أقسام 4-5 في حيوانات التجارب في جميع الأعمار فحص (الذكور WT ن = 3؛ من الذكور MeCP2 KO ن = 3؛ الإناث WT ن = 5؛ MeCP2 الإناث +/- ن = 5 ). وقد طرح في OD متوسط ​​الجسم الثفني كما تلوين الخلفية.
وقد اكتسبت مجهرية المزدوج مضان من العينات القشرة S1 مع المجهر متحد البؤر المسح بالليزر، وذلك باستخدام طريقة متعدد المسارات لتجنب تداخل الإشارات مضان (الثقب: 1.0 وحدة مهواة). للتحليل الكمي لوضع العلامات مضان الفوسفات-rpS6 في الخلايا العصبية القشرية، تم الحصول Z-سلسلة أكوام من أربعة أقسام مبائر متتالية (512 × 512 بكسل) متباعدة من قبل 2 ميكرون في 20 ×. تم مضافين الصور من كل القنوات وطرح وضع العلامات الخلفية. وقد تم تحليل مستويات مضان على الصور مبائر عن طريق قياس متوسط ​​كثافة بكسل في الخلايا العصبية إما MeCP2 الإيجابية أو السلبية MeCP2 باستخدام برنامج يماغيج. رسوم بيانية تمثل شدة متوسط ​​مضان محسوبة في ما لا يقل عن 50 العصبونات القشرية لكل حيوان (WT الإناث ن = 4؛ MeCP2 الإناث +/- ن = 4). يتم عرض جميع البيانات كما يعني ± SEM. وقد تم تحليل الإحصائي الطالب اختبار t، فضلا عن واحد أو اتجاهين ANOVA باستخدام برنامج GraphPad بريزم (لا جولا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). للعرض، تم تجهيزها الميكروسكوب الرقمية مع يماغيج البرمجيات. تم استيراد الملفات إلى أدوبي فوتوشوب (أدوبي سيستمز، سان خوسيه، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية)، حيث تم اقتصاص الصور.

لمحات Polysomal

وأجريت لمحات Polysomal كما هو موضح سابقا (60)، مع بعض التعديلات. تم استخراج أنسجة المخ من الجمجمة والمتجانس في 50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.4 درجة الحموضة)، 100 م م كلوريد الصوديوم، و 30 م م MgCl 2، 0،1٪ NP40، 100 ميكروغرام / مل من سيكلوهيكسيميد، 40 U / مل من RNasin ® ومثبط البروتياز الكوكتيل (سيغما الدريخ). وقد تم توضيح مقتطفات كامل الدماغ عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 000 15 ز. أي ما يعادل 10 وحدة الامتصاصية في 254 نانومتر والطبقات على التدرج السكروز 15-50٪ في 50 م م تريس، خلات، ودرجة الحموضة 7.5، 50 م م NH 4 الكلورين، 12 م م MgCl 2 و 1 م م DTT وطرد في 4 درجات مئوية في الدوار SW41Ti بيكمان لمدة 3.5 ساعة عند 39 000 دورة في الدقيقة. وسجلت الامتصاصية في 254 نانومتر البيولوجية LP برنامج (بيو راد) وكسور تم جمعها. من أجل تعطيل 80S ريبوسوم وpolysomes، وعولج مجموع مقتطفات مع 30 م م EDTA لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تعامل EDTA وكانت عينات -untreated ثم تحميلها على التدرج السكروز. وقد عجلت الكسور بنسبة 10٪ TCA (حمض الخليك ثلاثي الكلور) وفقا لبروتوكول قياسي، وفصلها على SDS-PAGE وتحليلها بواسطة لطخة غربية. تم عزل الحمض النووي الريبي من كل جزء بواسطة الفينول: الكلوروفورم: isoamilalcool (25: 24: 1) (سيغما الدريتش) ول mRNAs تم تحليلها من قبل QRT-PCR. لقياس الكمية، تم مسحها ضوئيا لمحات polysomal ومنطقة من قمم الريباسي المقررة مع يماغيج (NIH) والبرمجيات.

وضع العلامات الأيضية

أعدت ستة أقسام 400 ميكرون من الدماغ كله لكل حيوان (متوسط ​​العمر P40) باستخدام تقطيع الأنسجة. تم الحفاظ على شرائح في carbogenated، في 32.5 ° C ACSF (120 م م كلوريد الصوديوم، 2.5 م م بوكل، 1.2 م م MgCl 2، 2،5 م م CaCl 2، 26.2 م م NaHCO 3، 1 م م ناه 2 PO 4، 11 م م الجلوكوز) لمدة 1.5 ساعة. بعد 1.5 ساعة الانتعاش، تم نقل شرائح إلى 15 netwells مم (كورنينج) تحتوي على 5 مل من ACSF carbogenated. لكل حيوان، وحضنت ثلاث شرائح لمدة 30 دقيقة في ACSF carbogenated مع 100 ميكروغرام / مل من سيكلوهيكسيميد. ثم تم تحضين شرائح في ACSF carbogenated تحتوي على 11 μCi / مل من PROMIX 35 ميثيونين S المسمى (أمرشام) لمدة 1 ساعة. ثم تم نقل Netwells على طبق 12-جيدا تحتوي عازلة تشريح الجليد الباردة لوقف تخليق البروتين وإزالة الفائض من 35 ميثيونين S المسمى. أزيلت شرائح في وقت لاحق والمتجانس في المخزن الجليد الباردة تحلل (50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 150 م م كلوريد الصوديوم، 1٪ NP40 ومزيج من البروتياز مثبطات من سيغما الدريخ). مقتطفات من 10 ميكرولتر تم TCA عجل على مرشحات زجاجية مجهرية (هتما) وعدها. وتم تطبيع القيم التي تم الحصول عليها عن طريق محتوى البروتين عينة، كميا باستخدام bicinchoninic فحص البروتين حمض (بيرس). وأعرب عن البيانات النهائية كما النسبة بين التهم أدرجت في الدقيقة (CPM) من شرائح غير المعالجة وCPM من شرائح المعالجة سيكلوهيكسيميد.

النشاف الغربي

تم استخراج أنسجة المخ من الجمجمة والمتجانس في تحلل العازلة (50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 150 م م كلوريد الصوديوم، 1٪ NP40، 0.1٪ SDS ومزيج من الفسفاتازات والبروتياز مثبطات من سيغما الدريخ) في 4 ° C. وقد تم توضيح لست] بواسطة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 18 000 غرام، وتم تحديد تركيز البروتين من طاف باستخدام ألبومين المصل البقري (BSA) كمعيار (برادفورد كاشف فحص، سيغما الدريخ). تم المغلي مجموع لست] في SDS عينة العازلة، مفصولة SDS-PAGE ونشف لغشاء النيتروسليلوز (أمرشام). تم منع المرشحات في تريس مخزنة المالحة توين-20 (0.1٪) (TBST) (10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 150 م م كلوريد الصوديوم و 0.05٪ توين-20)، بالإضافة إلى 5٪ BSA (سيغما الدريتش) و حضنت مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 16 ساعة في 4 درجات مئوية. تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: الأرنب بولكلونل مكافحة MeCP2 (1: 1000، سيغما الدريخ)، الأرنب بولكلونل MeCP2 (1: 1000، مجموعة Lansberger)، والأرنب بولكلونل المضادة - الفوسفات-P70 S6K (Thr421 / Ser424) (1: 1000، خلية اشارة التكنولوجيا)، الأرنب بولكلونل مكافحة P70 S6K (1: 1000، خلية اشارة التكنولوجيا)، الأرنب بولكلونل لمكافحة الفوسفات-mTOR س (Ser2448) (1: 1000، خلية اشارة التكنولوجيا)، الأرنب وحيدة النسيلة mTOR س (1: 1000 ، خلية اشارة التكنولوجيا)، الأرنب بولكلونل المضادة للphospo-AKT (Ser473) (1: 1000، خلية اشارة التكنولوجيا)، والماوس وحيدة النسيلة المضادة للdiphosphorylated ERK-1 & 2 (بيرك) (1: 1000، سيغما الدريخ)، والماوس وحيدة النسيلة المضادة غير المتمتعة مفسفر ERK-1 & 2 (1: 1000، سيغما الدريخ)، والماوس وحيدة النسيلة المضادة للGADPH (1: 5000، ميليبور). بعد غسل ثلاث مرات مع TBST، وحضنت المرشحات مع الأجسام المضادة البيروكسيديز مترافق الثانوية (مكافحة فأر أو أرنب مفتش؛ 1: 5000) (أمرشام) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تم إجراء الكشف عن طريق تعزيز التوهج (EuroClone، بيرو، إيطاليا). لقياس الكمية، تم مسحها ضوئيا autoradiographs وكثافة الإشارة تقييم مع يماغيج (NIH) والبرمجيات.

الكمي RT-PCR

وقد كتب حجم مساو من RNA من كل جزء مرقمة أحد عشر العكس مع الاشعال مسدوس العشوائي من قبل مجموعة Transcriptor الدقة العالية كدنا] التجميعي (روش)، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تنفيذ الوقت الحقيقي PCR مع الاشعال محددة وSsoFast ™ EvaGreen ® Supermix (بيو راد) في C1000 TM cycler الحرارية (بيو راد). كمية من قالب وعدد من دورات التضخيم والأمثل مبدئيا لكل PCR لتجنب ظروف التشبع. لمرنا الكمي، اقمنا منحنى القياسية مع التخفيف المتسلسل من الحمض النووي الريبي. بالنسبة للعينة التجريبية، تم حساب مستوى مرنا باستخدام المنحنى القياسي الذي حصلت عليه لأنه مرنا. وكانت أزواج التمهيدي المستخدمة في QRT-PCR على النحو التالي: 5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3 "(إلى الأمام) و5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3" (عكس) ل18S مرنا. 5'-GGACACCTGGATACCTCTCCC-3 "(إلى الأمام) و5'-GTACAGGCGATGCTGGTCTT-3" (عكس) لCAMKIIαmRNA. 5'-GTGGGCGGCGAGGATGGTGAA-3 "(إلى الأمام) و5'-CCGCCGTTTGCTGGGAATGAA-3" (عكس) لPSD95 مرنا. 5'-AGGGCCACAATGGATGGGTA-3 "(إلى الأمام) و5'-TCTGGTCAGCTTCCACATGAT-3" (عكس) لRack1 مرنا. 5'-GGCTATAATGGGTATGGAGGAG-3 "(إلى الأمام) و5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3" (عكس) لhnRNP A2 / B1 مرنا. 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3 "(إلى الأمام) و5'-TTCACCACCATGGAGAAGC-3" (عكس) لGADPH مرنا.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس