عرض مشاركة واحدة
  #8  
قديم 11-23-2015, 08:31 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي بارديه-بيدل البروتينات متلازمة السيطرة على طول الأهداب من خلال تنظيم بلمرة أكتين

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/22/19/3858.full



أهداب الأولية هي الزوائد الخلوية مهمة لنقل الإشارة والاستشعار عن بعد في البيئة. بارديه-بيدل البروتينات متلازمة شكل مجمع وهذا أمر مهم لعدة عمليات تتعلق الهيكل الخلوي مثل تكون الأهداب، والهجرة الخلية والانقسام. ومع ذلك، فإن الآليات التي البروتينات BBS قد تنظيم الهيكل الخلوي لا تزال غير واضحة. اكتشفنا أن Bbs4- وBbs6 الخلايا النخاعية الكلى -deficient عرض السلوك المميز تضم الفقراء والهجرة، والالتصاق والانقسام مع عدم القدرة على تشكيل ملحقات lamellipodial وfilopodial. وعلاوة على ذلك، تم المهدبة خلايا متحولة أقل [48٪ ± 6 لالبرية من نوع (WT) خلايا مقابل 23٪ ± 7 لخلايا فارغة Bbs4؛ P <0.0001] وأهداب بهم كانوا أقصر (2.55 ميكرون ± 0.41 لخلايا WT مقابل 2.16 ميكرون ± 0.23 لخلايا فارغة Bbs4؛ P <0.0001). في حين أن الهيكل الخلوي microtubular والأكتين القشرية كانت سليمة، وتعطل تشكيل ألياف الأكتين الإجهاد الشديد، وتشكيل الشاذة قمي المجاميع الألياف الإجهاد. وعلاوة على ذلك، لاحظنا الالتصاقات البؤرية الإفراط في وفرة (FAS) في Bbs4-، Bbs6- والخلايا -deficient Bbs8. في ضوء هذه النتائج، ودور RhoA في تنظيم خيوط الأكتين البلمرة، أظهرنا أن مستويات RhoA-GTP تم upregulated غاية في غياب البروتينات BBS. على علاج Bbs4 خلايا -deficient مع مثبطات الكيميائية للRhoA، كنا قادرين على استعادة طول الأهداب وعدد وكذلك سلامة الهيكل الخلوي الأكتين. معا هذه النتائج تشير إلى أن البروتينات BBS تلعب دورا مركزيا في تنظيم الهيكل الخلوي الأكتين والسيطرة على طول الأهداب من خلال تغيير في مستويات RhoA.
مقدمة

أهداب الأولية هي الزوائد قمي الانفرادي موجودة على معظم الخلايا في الجسم. الأدلة الأخيرة حددت أنهم بعيدون عن أثري، بدلا يعمل كما هوائيات لنقل الإشارة. العمليات التي تنظم تكون الأهداب والإشارات بدأت بالظهور، إلى حد كبير نتيجة لدراسة نماذج الأمراض الحيوانية واضطرابات الإنسان.
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو عديد المظاهر السريرية، واضطراب وراثي جسمي مقهور في المقام الأول يتألف من السمنة، والتقدمية تنكس الشبكية المبكر يصيب، polydactyly، نقص الأعضاء التناسلية وضعف الإدراك والنمو الشاذ الكلى (1 - +4). وقد ارتبط هذا التناذر غير متجانسة مع الطفرات في لا يقل عن 15 BBS الجينات المسببة لل(5). ترتبط البروتينات وما شابه ذلك لالهدبي، الجسم القاعدية أو اختلال وظيفي centrosomal وبعض وقد ثبت أن تعدل النقل intraflagellar (IFT) (6). ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية الدقيقة لهذه الإجراءات لا تزال بعيدة المنال.
نحو فهم أفضل لدور البروتينات BBS في وظيفة الخلوية، وأظهرنا سابقا أن BBS4 مطلوب للIFT الوراء من مكونات centrosomal الرئيسية مثل PCM1 (مطلوب لتشكيل أهداب)، وبالتالي يتصرف بوصفه البروتين محول لتحميل البضائع على داينين المحركات الجزيئية (7). نحن أول من اقترح وظيفة الهدبية للبروتينات BBS بعد اكتشاف BBS8، وهو بروتين وهو ما يعبر عنه في ظهائر مهدبة والخلايا العصبية المهدبة في انواع معينة ايليجانس. وقد ثبت BBS7 وBBS8 لتنسيق المحركات الجزيئية خلال IFT في C. ايليجانس (6). كشفت دراسة تنقية جنبا إلى جنب تقارب أن سبعة البروتينات BBS (BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، TTC8 / BBS8 وBBS9) تشكل المعقدة (ويشار إلى أن BBSome)، والمشاركة في نقل حويصلي الخلايا في تركيبة مع Rab8a، وهي مطلوب مباشرة لتكون الأهداب (8). هناك وظائف الجزيئية الأخرى المقترحة للبروتينات BBS، مثل دور البروتينات BBS في كل من غير المقبول والمتعارف عليها إشارات Wnt (9، 10). ومؤخرا، على ضرورة DISC1 الفسفرة محددة لتجنيد البروتينات BBS إلى الجسيم المركزي وفقدان BBS1 يؤدي إلى عيوب في هجرة الخلايا العصبية، وإن كان بعض الآليات الجزيئية وغير معروف (11).
نحن ذكرت مؤخرا ان morphants الزرد bbs8 زيارتها المعيبة العصبية الهجرة الخلية قمة كما تفعل BBS8 خلايا -depleted، مشيرا إلى أن هناك حاجة أيضا البروتينات BBS لحركية الخلية (12). للحصول على فهم أفضل للآليات الأساسية المسؤولة لهذه العيوب الخلوية على ما يبدو أهداب المستقلة، درسنا آثار BBS استنزاف البروتين على الهيكل الخلوي الخلوي.
يبدو تنظيم الهيكل الخلوي أكتين أن يكون لها دور رئيسي في اثنين على الأقل من السمات الأساسية للBBS. لعسر تصنع الكلى، فقد أفيد لتنظيم الكلوي تكون الكيسة وخلية رجلاء ديناميات (+13 - 15). وعلاوة على ذلك، هناك أدلة قوية على الجينات المسؤولة عن تنكس الشبكية، مثل RPGR، التي تنظم تشكيل أهداب والاستقرار الأكتين (16).
هنا، ونحن التقرير أن Bbs4- وBbs6 الخلايا النخاعية الكلى -deficient تهاجر نحو رديء، تحمل أهداب أقل وأقصر ولها الهيكل الخلوي الأكتين التي تأثرت بشدة. وعلاوة على ذلك، لاحظنا على مدى وفرة الالتصاقات البؤرية (FAS) في Bbs4-، Bbs6- وBbs8 خلايا -deficient مرتبطة بزيادة مستويات مستويات RhoA-GTP. على علاج Bbs4 خلايا -deficient مع مثبطات ممر RhoA، كنا قادرين على استعادة طول الأهداب وعدد وكذلك سلامة الهيكل الخلوي الأكتين. نقترح دورا جديدا للبروتينات BBS في تنظيم الهيكل الخلوي الأكتين التي بدورها تنظم مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية لشرح النمط الظاهري واسعة الطيف المرتبطة مع العديد من ciliopathies.

النتائج

عرض BBS التي تعاني من نقص خلايا الكلى الحركة والانقسام السيتوبلازمي العيوب

في ضوء الملاحظات السابقة لدينا حيث يطلب من البروتينات BBS لحركية خلية في الزرد، ونحن التحقيق في سلوك الخلوي للخلايا النخاع الكلى المأخوذة من Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران (17، 18). في حالة غير متموجة، Bbs4 - / - وBbs6 - / - أظهرت الخلايا الأولية تأخر الحركة والانقسام والانقسام السيتوبلازمي وكانت بطيئة لأعد إلى الركيزة بعد الانقسام، ونحن سبق وصفه في خلايا BBS8 متحولة الإنسان (12) (الشكل . 1 A). على توثيق التفتيش، كان واضحا أن الخلايا الطافرة شكلت اعتقلت مجموعات مع ندرة أقدام صفاحية أو أرجل كاذبة خيطية، من المرجح أن تؤثر على قدرتها على الهجرة (الشكل 1التكميلية المادة، أفلام 1-3). اختبرنا المقبل سلوك خلايا متكدسة في الصفر ('التئام الجروح') المقايسات. كما كانت الهجرة المتوقع المعيبة في Bbs4 - / - وBbs6 - / - ثقافات مقارنة مع فحوصات السيطرة (الشكل 1 B و C). هذه البيانات متفقة مع الملاحظات السابقة للخلايا -depleted Bbs8 (12).

الشكل 1.
خلايا متحولة BBS تفتقر التنقل. (A) الأطر الزمنية الفاصل بين من خلايا الكلى غير متموجة. Bbs4 خلايا الكلى -deficient (رأس السهم الأبيض) لديها ندرة lamellopodia وأرجل كاذبة خيطية والهجرة بطيئة (انظر المواد التكميلية، فيلم 1). شريط نطاق 50 ميكرون. (B) Phalloidin (أحمر) ودابي (الأزرق) تلطيخ يظهر فحص التئام الجروح. مقارنة مع خلايا WT، تظهر Bbs4 وBbs6 خلايا فارغة الهجرة قصور وتأخر إغلاق الجرح. شريط على نطاق واسع 200 ميكرون. شريط صغيرة الحجم 50 ميكرون. (C). منطقة الانتعاش بعد فحص التئام الجروح. خلايا WT عرض مبلغا أكبر من سطح تعافى (286400 ميكرون 2) أو 86٪ من إغلاق الفجوة، بينما Bbs4 وBbs6 خلايا فارغة التعافي فقط 253500 ميكرون 2 و 255700 ميكرون 2 أي ما نسبته 74٪ و 75٪ من الإغلاق التام. WT مقابل خلايا متحولة Bbs4 P <0.001، WT مقابل Bbs6 خلايا متحولة P <0.001.

مطلوبة البروتينات BBS لتنظيم هيكل الخلية أكتين

لتحديد أساس عدم وجود تمديد lamellopodial والهجرة الخلية، ونحن التحقيق بجانب الهيكل الخلوي في الخلايا الليفية متحولة. ومن المثير للاهتمام، ونحن لم يكشف عن أي خلل في الهياكل microtubular على المناعية من tubulins (لا تظهر البيانات). نحن الملون بجانب هذه الخلايا مع phalloidin. في حين البرية من نوع (WT) خلايا عرضت ألياف الأكتين الإجهاد موازية تعقد بانتظام، لم تراع هذه في Bbs4 - / - وBbs6 - / - الخلايا. وعلاوة على ذلك، ونحن أيضا لاحظ الفوضى الإجمالي من الهيكل الخلوي الأكتين، وخاصة في المنطقة القمية من Bbs4 - / - وBbs6 - / - خلايا متكدسة (الشكل 2 A). ولوحظ وجود النمط الظاهري مشابهة جدا عندما يتم استنفاد Bbs8 بواسطة shRNAs في الخلايا NIH3T3 (الشكل 2 B)، كما هو موضح سابقا في (12). هناك يبدو أن الإفراط في وفرة من ألياف الإجهاد المحلية، حيث يبدو حزم من خيوط الأكتين أن ترتكز على الغشاء. خيوط الأكتين شكلت خطي مميزة مثل محور ميزة (19) مع الألياف الصغيرة المنبثقة عمودي على حزمة الألياف الرئيسية، تختلف تماما لترتيب نموذجي في خلايا WT، كما هو موضح في الشكل 2 C.

الرقم 2.
BBS الخلايا المنضب لديها الهيكل الخلوي أكتين معيب. (A و B) Phalloidin (أبيض) ودابي (الأزرق) تلطيخ (A) Bbs4- وBbs6 خلايا الكلى الأولية -deficient تنتج المجاميع أكتين في المنطقة القمية للخلية، مقارنة مع الخلايا WT. تظهر رؤوس سهام المجاميع أكتين على apically في الخلية (الأسهم الخضراء). (B) وبالمثل، خلايا NIH3T3 المنضب لBbs8 تظهر تعطل الأكتين مماثل بالمقارنة مع خطوط خلايا غير transfected. شريط النطاق الأبيض 20 ميكرون. أسود شريط نطاق 50 ميكرون (السهم الأخضر). (C) Phalloidin (الخضراء) ودابي (الأزرق) تظهر تلطيخ أن خيوط الأكتين الشاذة تنشأ من غشاء الخلية. التمثيل التصويري تبين درجات مختلفة من بلمرة خيوط الأكتين متفرعة حديثا ينتهي، وتشكيل هيكل يشبه مركزا على قمة الخلية. شريط نطاق 20 ميكرون. (D) لقطات من أكتين-GFP transfected WT وBbs4 خلايا -deficient (انظر المواد التكميلية والأفلام 3 و 4 و 5)، والتي تبين تجميع الأكتين على قمة خلايا فارغة Bbs4. صور إعادة الإعمار متحد البؤر (E) 3D تظهر المنظمة الأكتين في WT وBbs4 خلايا فارغة في التعليق التالي تلطيخ مع رودامين-phalloidin. لم تكن هناك اختلافات واضحة في تنظيم الأكتين القشرية بين Bbs4 - الخلايا وWT - /.

من أجل التحقيق في كيفية هذه الباقات شكلت في الجسم الحي، WT وBbs4 - / - و transfected الخلايا للتعبير عن الأكتين-GFP. اتخذت متحد البؤر الأفلام الوقت الفاصل بين ووحظت التراكمات الأكتين تشكيل في القرب من غشاء الخلية في الجانب قمي للخلية. وبالتالي قد تكون هذه المجاميع بمثابة المراسي، وتعطيل وظيفة طبيعية من الهيكل الخلوي كله (الشكل 2 C والمواد التكميلية، أفلام 4-6).
لاختبار ما إذا كان هذا النمط الظاهري الأكتين مستقلة من التفاعل خارج الخلية، قمنا بتحليل الأكتين في الخلايا في التعليق. وعلى النقيض من الخلايا الملتصقة، لم يكن هناك اختلاف في تنظيم الأكتين بين WT وBbs4 - / - الخلايا، وكلا عرضت توزيع القشرية منقط مماثل (الشكل 2 D). من أجل مزيد من الدراسة سلامة الأكتين القشرية في الخلايا BBS-ناقص، استخدمنا تقنية تطلع micropipette على الخلايا مع وقف التنفيذ. طموح Micropipette هو الاسلوب الذي يقيس الميكانيكا الحيوية من الغشاء الخلوي. تطبيق التحميل الميكانيكية يؤثر على تنظيم الأكتين من الغشاء، مما يسمح لنا لدراسة معدل الاسترداد والتي تعتمد على ديناميات البلمرة أكتين. يوفر هذا الأسلوب راسخة تقديرا لمعامل الخلايا الإجمالي الذي يعتمد على سلامة وديناميات الهيكل الخلوي الأكتين (20). في هذا الإعداد، تعطلت الأكتين القشرية بعد العلاج مع نتائج مثبط حركة الخلايا D في تشويه للخلية في micropipette، وتتميز انخفاض في معامل التوازن الخلية (21). WT وBbs4 - / - الخلايا، مع أو بدون ترنسفكأيشن مع أكتين-GFP (لاستبعاد أي تأثير الأكتين على التعبير)، تم تحليلها في نظام الطموح pipetting لالجزئي (. المواد التكميلية، الشكل S1 والتكميلية المادة، أفلام 7 -10). لم نعثر على أي اختلاف في معامل التوازن بين WT وBbs4 - / - الخلايا، أو بين الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل أو untransfected (الشكل 3 B). وتشير هذه البيانات إلى أن النمط الظاهري يتعلق فقط إلى تكوين ألياف التوتر بدلا من تنظيم الأكتين القشرية. لاختبار هذا، ونحن المصنف الخلايا وثابتة لهم، بعد تمسكهم الركيزة، تلطيخ لهم phalloidin-رودامين. أولا، لاحظنا تشكيلات الأكتين الشاذة في Bbs4 - / - الخلايا في بداية ألياف الإجهاد البلمرة (الشكل 3 A). ثم، حسبنا النسبة المئوية للخلايا في كل مجال تقديم ملحقات lamellopodia التي تعتمد على الأكتين في 3 و 4 و 5 ساعة بعد البذر الخلايا. يتم زيادة النسبة المئوية للخلايا تقديم lamellopodia في كل نقطة زمنية، كما هو متوقع. ومع ذلك، لاحظنا أقل ملحقات في خلايا فارغة Bbs4، مقارنة مع الخلايا WT (الشكل 3 C).

الرقم 3.
النمط الظاهري الأكتين هيكل الخلية يعطل البلمرة أكتين حشوية ولكن ليس الأكتين القشرية. (A) خلايا تمتد lamellopodia 5 ساعات بعد البذر. كانت ملطخة F-الأكتين مع phalloidin لإظهار ألياف الإجهاد تشكيل. بعد 5 ساعات، Bbs4 - / - خلايا كانت قد بدأت تتشكل خيوط الأكتين بلمرة خطأ (رأس السهم). (B) Micropipetting الخلايا مع وقف التنفيذ لم تظهر أي فروق ذات دلالة إحصائية في معامل التوازن بين الخلايا -deficient WT وBbs4 أو بين Bbs4 خلايا -deficient والخلايا -deficient Bbs4 تعامل مع مثبط Y27632 RhoA (مان-ويتني اثنين من الذيل، P> 0.05). (C) النسبة المئوية للخلايا في كل مجال الرؤية التي تحتوي على مجموعات الخلايا خلية / تطوير ملحقات lamellopodia. علقت WT وBbs4 - / - تم المصنف coverslips على وتم إصلاحها 3 و 4 و 5 ساعات بعد ذلك. وBbs4 - / - الخلايا لديها نسبة إحصائية بدرجة كبيرة من الخلايا مع lamellopodia في كل نقطة زمنية [-values ​​P لمدة 3 ساعات (P <0.027)، 4 ح (P <0.0185) و 5 ح (P <0.0277)] postseeding .

راقبنا بجانب انتعاش الأكتين التالية التحلل باستخدام مثبط حركة الخلايا دقائق D. عشرون بعد العلاج، لاحظنا تأخر والانتعاش الشاذة من الهيكل الخلوي الأكتين في Bbs4 - / - خلايا الفئران الطافرة مقارنة مع الضوابط (المواد التكميلية، الشكل S2.). على ترنسفكأيشن من خلايا mIMCD3 مع Bbs4 وBbs6 كامل طول بنيات التعبير (pCMV-Bbs4-HA وpCMV-Bbs6-cmyc)، اكتشفنا فشل خيوط الأكتين البلمرة بالمقارنة مع خلايا untransfected (الشكل 4)، لافتا نحو دور كابح خلال البلمرة أكتين. وتشير هذه النتائج إلى أن مستويات البروتين BBS ومتوازنة بدقة لتنظيم تشكيل ألياف الأكتين.

الرقم 4.
أدى overexpression من Bbs4 -HA وBbs6 -cmyc يبني تلطيخ Phalloidin-رودامين (الصفراء) وoverexpression من Bbs4 -HA وBbs6 -myc الموسومة (أبيض) (A) overexpression من Bbs4-HA أو Bbs6-MYC في البلمرة ناقصة من cytoplasmatic F -actin (arrohead أبيض)، مما يعوق بلمرة خيوط الأكتين، مقارنة مع الخلايا untransfected المجاورة (السهام البيضاء). تلك mIMCD3 خلايا متكدسة untransfected (السهام البيضاء) تظهر النمط العادي للألياف الإجهاد. (B) ترنسفكأيشن مع فارغة البلازميدات السيطرة هكتار أو ج myc لا يعطل البلمرة، ويتم بلمرة خيوط الأكتين بشكل صحيح. شريط نطاق 20 ميكرون.

يتم التعبير عن Bbs8 وBbs9 في الالتصاقات البؤرية ويترافق مع زيادة بلمرة الأكتين

وقد وصفت BBSome ومجمع من سبعة جينات BBS المطلوبة لتكون الأهداب التي BBS4 هي مجرد واحدة من المكونات (8، +22 - +24). وبالتالي فإننا التحقيق شركاء BBSome الآخرين، Bbs8 وBbs9، للقيام بأدوار المفترضة في تنظيم الأكتين. نحن مصممون التوزيع غير متوقع من Bbs8 وBbs9 في محيط الخلية، واصفة خيوط الخطية تشبه الأكتين (الشكل 5 A). لم هذه البروتينات لا التسمية بالاشتراك مع F-الأكتين ولكن بدلا من ذلك تم المرتبطة بشكل وثيق مع Vinculin التي بقع على وجه التحديد اتفاقات الصيد (الشكل 5 B و D). نحن أيضا لاحظ الجسيم المركزي / القاعدية توطين جثة Bbs8 وBbs9 في متموجة خلايا mIMCD3، بالإضافة إلى التعبير FA.

الرقم 5.
يتم التعبير عن Bbs8 وBbs9 في اتفاقات الصيد. يتم التعبير (A) Bbs8 وBbs9 في السيتوبلازم بطريقة شعاعي (السهام البيضاء) في الخلايا mIMCD3 الهجرة غير متموجة. شريط نطاق 20 ميكرون. وcoexpressed (B و C) كل من Bbs8 وBbs9 مع vinculin في اتفاقات الصيد. شريط نطاق 20 ميكرون. (D) Bbs8 وBbs9 توطين في بداية خيوط F-أكتين (رأس السهم). شريط نطاق 20 ميكرون. (E) لاحظ أن اتفاقات الصيد تتمركز في Bbs4- والخلايا ناقصة Bbs8- (السهام) مقارنة مع الخلايا WT حيث اتفاقات الصيد وغلبة في محيط الخلية (السهام). شريط نطاق 20 ميكرون. Vinculin تلطيخ للاتفاقات الصيد. النشاط (F) RhoA في خطوط BBS التي تعاني من نقص. ارتفاع كبير في مستويات المنشط RhoA في خلايا متحولة، على سبيل المثال هناك زيادة بنسبة 2 أضعاف للخلايا فارغة Bbs6 (SEM ± 0.07)؛ 2.5 أضعاف لخلايا فارغة Bbs4 (SEM ± 0.12) و 2.6 أضعاف لBbs8 -shRNA استنزاف الخلايا (SEM ± 0.09). بيانات تطبيع للنشاط WT RhoA. (G-J) الكمي لنسبة الأكتين F / G في Bbs8 -shRNA المنضب خلايا NIH3T3 وBbs4 خلايا الكلى لاغية الأساسي. استخدمت Phalloidin-رودامين والدناز I-اليكسا 488 لقياس مضان المنبعثة وحساب النسبة. وهذه النسبة أعلى في خطوط الخلايا الطافرة (WT 1.54 ± 0.28 مقابل Bbs4 باطل 1.96 ± 0.24؛ P <0.001 shRNA السيطرة 0.65 ± 0.17 مقابل Bbs8 -shRNA 1.12 ± 0.21؛ P <0.001). *** P <0.001. شريط نطاق 20 ميكرون.

اتفاقات الصيد هي مجمع محددة جيدا من البروتينات التي تصل المصفوفة خارج الخلية مع الهيكل الخلوي الأكتين ولعب دورا نشطا في الحركة الخلوية والأكتين البلمرة (إعادة النظر في (25)). وينظم شبكة الأكتين في أقدام صفاحية، أرجل كاذبة خيطية والإجهاد الألياف كبير من قبل اتحاد كرة القدم، وترتكز ألياف الأكتين الإجهاد في كرة القدم (25). يتم التعبير عن Bbs8 وBbs9 يبدو أن تلك النقطة التي يتم فيها بلمرة خيوط الأكتين (الشكل 5 D والتكميلية المواد، الشكل S3)، مما يدعم الافتراض المسبق لدينا التي تشارك البروتينات BBS في تنظيم الأكتين. لم يوجد فرق في توطين Bbs8 وBbs9 في Bbs4 - / - أو Bbs6 - / - الخلايا (. المواد التكميلية، الشكل S4 و S5)، ودعم فكرة أن Bbs4 هي المكون الأخير تجميعها في BBSome (26) وهذا النمط الظاهري وجدت في Bbs4 - / - وBbs6 - / - الخلايا لا يرجع إلى BBSome mislocalization كله.
هذه الملاحظات مع العيوب الهجرة في خلايا متحولة BBS تشير وجود صلة بين BBS، البلمرة أكتين وFA. لذا قمنا بحساب عدد فاس لكل خلية موجودة في غير متموجة-Bbs4 - / - خلايا الكلى الأولية والخلايا NIH3T3 ناقصة لBbs8 (shRNA) (12). في المتوسط، لاحظنا أن عدد فاس كان أعلى في الخلايا -deficient BBS مقارنة مع الضوابط (126 ± 8.725 N = 15 لBbs4 - / - خلايا مقابل 104.9 ± 3.867 N = 15 لخلايا WT: P <0.05) و (106 ± 4.057 N = 15 لخلايا Bbs8 shRNA مقابل 85.79 ± 2.158 N = 15 لخلايا تحكم؛ P <0.001)، من المحتمل تؤثر والتداخل مع الحركة الطبيعية للخلايا. وعلاوة على ذلك، قمنا بتحليل مسافة كل اتفاقات الصيد إلى غشاء في كل نوع من الخلايا الاكتشاف الذي Bbs4 - / - الخلايا والخلايا Bbs8 shRNA لديها اتفاقات الصيد توزيع أكثر مركزيا (6.594 ميكرون ± 0.1011 N = 123 لBbs4 - / - خلايا مقابل 5.406 ميكرون ± 0.2358 N = 107 للخلايا WT؛ P <0.001، وميكرون 13.02 ± 0.3518 N = 101 للخلايا Bbs8- shRNA مقابل 10.49 ميكرومتر ± 0.3521 N = 92 لخلايا تحكم؛ P <0.001). (الشكل 5 E والتكميلية المواد، الشكل. S6).
لاختبار هذه الفرضية أيضا، تم احتساب النسبة بين G-الأكتين وF-الأكتين في الخلايا متحولة مقارنة مع الضوابط. عن طريق قياس كثافة مضان النسبية phalloidin-رودامين (F-الأكتين) وDnaseI-488 (G-الأكتين) (الشكل 5 G-J)، وجدنا زيادة كبيرة في مستويات F-أكتين في Bbs4 - / - وBbs8 -shRNA خلايا تدل على زيادة في بلمرة الأكتين في الخلايا متحولة.

وبوساطة العيوب التحلل الأكتين وتكون الأهداب عن طريق زيادة النشاط RhoA الخلوي في خلايا متحولة BBS

وتشارك RhoGTPases في تنظيم ديناميات الأكتين وتشكيل فاس (19، 27، 28)؛ ولا سيما زيادة في النشاط النتائج RhoA في زيادة التجمع FA والبلمرة F-أكتين. للتحقيق في سبب زيادة مستويات FA، قمنا بقياس مستويات نشط RhoA-GTP باستخدام الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم في Bbs4 - / - وBbs6 - / - خلايا الكلى والخلايا Bbs8 -shRNA NIH3T3. ولوحظ وجود زيادة كبيرة في نشاط RhoA في الخلايا BBS المنضب بالمقارنة مع WT، وبالتالي يحتمل شرح الزيادة في تشكيل الاتحاد الانجليزي والبلمرة F-أكتين (الشكل 5 F).
بشكل جماعي، وتشير كل هذه المعطيات وجود صلة قوية بين الجينات BBS وتنظيم الأكتين هيكل الخلية البلمرة، التي ارتبطت في السابق مع تكون الأهداب (29). بعد تحديد سبب من الهيكل الخلوي الأكتين تعطلت، نحن شكك بجوار طبيعة العلاقة مع هدب الابتدائي وظيفة الهدبية. نحن التحقيق أهداب الابتدائي في Bbs4 - / - خلايا الكلى مشيرا الى انخفاض عدد كبير من الخلايا المهدبة (23٪ Bbs4 - / - مقابل 48٪ WT؛ P <0.001) بعد المجاعة في الدم وانخفاض في متوسط ​​طول أهداب مقارنة مع الشاهد الخلايا (الشكل 6 A-C). على علاج Bbs4 - / - الخلايا مع مثبط حركة الخلايا D، ونحن أيضا لوحظ استعادة كبيرا في أعداد طبيعية من الخلايا المهدبة ويصاحب ذلك زيادة في متوسط ​​طول الأهداب (الشكل 6 A-C). وتشير النتائج التي توصلنا إليها أن الجينات BBS تنظم تكون الأهداب من خلال تنظيم الهيكل الخلوي الأكتين، وهذه النتائج متسقة مع دراسة حديثة تربط جهري تكون الأهداب مع ديناميات الأكتين، حيث تعطل الهيكل الخلوي الأكتين الترويج تكون الأهداب (29).

الرقم 6.
استرداد عدد أهداب التالية التحلل (A). السيطرة ومثبط حركة الخلايا D تعامل WT وBbs4 الخلايا الأولية الكلى فارغة. منظر عام لميدان متكدسة وأهداب ممثل (الشكل). المعاملة مع مثبط حركة الخلايا D يسترد أرقام أهداب وطول في خلايا فارغة Bbs4 (رأس السهم الأبيض) مقارنة مع الخلايا WT (السهام البيضاء). شريط نطاق 20 ميكرون. أقحم مقياس شريط 10 ميكرون. (B) التمثيل البياني للطول أهداب الخلايا فارغة WT وBbs4 المعالجة وغير المعالجة. الخلايا غير المعالجة WT (2.55 ميكرون ± 0.41)، وخلايا WT المعالجة (4.67 ميكرون ± 0.53)، وخلايا فارغة Bbs4 غير المعالجة (2.16 ميكرون ± 0.23)، وتعامل خلايا فارغة Bbs4 (7.58 ميكرون ± 0.62). (C) النسبة المئوية للخلايا مهدبة فيما يتعلق العدد الكلي للخلايا. الخلايا غير المعالجة WT (48٪ ± 6.1)، وخلايا WT المعالجة (51٪ ± 3.2)، الخلايا غير المعالجة Bbs4 فارغة (23.01٪ ± 7.02)، وتعامل خلايا فارغة Bbs4 (49.29٪ ± 3.9). لاحظ أنه لا توجد زيادة في نسبة الخلايا المهدبة WT بعد العلاج مع مثبط حركة الخلايا (D)؛ ومع ذلك تعامل خلايا فارغة Bbs4 التعافي إلى مستويات WT. *** P <0.001، * P <0.05، نانوثانية. أهمية not-.

للتحقيق في ما إذا كانت زيادة النشاط RhoA قد توسط هذه العيوب التي تعتمد على الأكتين في تكون الأهداب، عرضنا Bbs4 - / - الخلايا الظهارية الكلوية لاثنين RhoA مثبطات ممر، Y27632 (مثبط محدد من رو المصاحب ملفوف لفائف تشكيل البروتين سيرين / ثريونين كيناز (ROCK) أسرة من تحركات البروتينات) وC3 ترانسفيراز (وهو إنزيم براني الذي يمنع المجال RhoA المستجيب ملزم للGTPase على وجه التحديد). ونتيجة لذلك وبما يتفق مع النتائج التي توصلنا إليها، أهداب تطول وزيادة عدد الخلايا المهدبة بشكل ملحوظ (الشكل 7 A-C والتكميلية المواد، الشكل. S7A وB). تم العثور على إنقاذ مماثل للطول الأهداب وأهداب عدد عندما Bbs6 - تعرضت الخلايا لY27632 - / (الشكل 7 D و E). ومن المثير للاهتمام، ونحن أيضا لوحظ إطالة أهداب الخلايا السيطرة. وعلاوة على ذلك، وعلاج Bbs4 - / - الخلايا مع Y27632 وC3 ترانسفيراز تشكيل تحول دون ألياف الإجهاد قمي (30) (الشكل 7 F والمواد التكميلية، الشكل 7C.). ولوحظ وجود ما يصاحب ذلك انخفاض 2 أضعاف في مستويات RhoA تنشيط (الشكل 7 G والمواد التكميلية، الشكل 7D).

الرقم 7.
تثبيط مسار RhoA مع Y27632 ينقذ الهيكل الخلوي الأكتين وطول الأهداب في الخلايا فارغة Bbs4. كانت (A و B) سيليا من WT المصل تجويع الخلايا المعالجة مع Y27632 أطول (4.256 ميكرون ± 0.2367) من الخلايا غير المعالجة (2.746 ميكرون ± 0.1527). وبالمثل في Y27632 تعامل خلايا فارغة Bbs4، كانت أهداب الخلايا تقريبا ضعف المدة غير المعالجة كما (3.429 ميكرون ± 0.2355 مقابل 1.923 ميكرون ± 0.1321؛ P <0.001). شريط مقياس مكون من 5 ميكرون. (C) عدد مهدبة خلايا فارغة Bbs4 (43٪ ± 1.95) يتعافى إلى مستويات WT (54٪ ± 0.99) عندما تعامل مع Y27632، P <0.0001. (D) نتيجة مماثلة تم الحصول عليها عندما تم علاج خلايا فارغة Bbs6 مع Y27632. كانت أهداب مرة أخرى لفترة أطول WT المعاملة (4.276 ميكرون ± 0.04531 N = 29) من الخلايا غير المعالجة (2.883 ميكرون ± 0.04899 N = 32). وبالمثل في Y27632 تعامل خلايا فارغة Bbs6، أهداب يتضاعف طول مقارنة مع الخلايا غير المعالجة (3.445 ميكرون ± 0.1529 N = 31 مقابل 1.224 ميكرون ± 0.08055 N = 24؛ P <0.001). (E) عدد مهدبة خلايا فارغة Bbs6 (16٪ ± 1.38) يتعافى إلى مستويات WT (44٪ ± 0.99) عندما تعامل مع Y27632، P <0.0001. (F) هناك انخفاض في تشكيل مجموع الألياف الإجهاد في خلايا فارغة Bbs4 بعد التعرض لY27632. مقياس شريط 30 ميكرون. النشاط (G) RhoA من الخلايا المعالجة مع 10 م م Y27632 لمدة 30 دقيقة. تم تطبيع كافة البيانات عن النشاط WT RhoA. بعد العلاج، تم تخفيض مستويات تنشيط RhoA إلى النصف في الخلايا WT المعاملة (0.4614 ± 0.05629). وجدنا نفس الحد من النشاط RhoA في خلايا فارغة Bbs4، من 1.788 ± 0،095-،7475 ± 0.0053. *** P <0.001.

عندما Bbs4 - / - تم علاج الخلايا في تعليق مع Y27632، تم حساب معامل التوازن التالية تقنية تطلع micropipette. لم يتم العثور على الفرق بين المعالجة وغير المعالجة في Bbs4 - / - الخلايا (الشكل 3 A). وهذا يشير إلى أن الإنقاذ لوحظ في الخلايا الملتصقة غير محددة لدور Bbs4 في ألياف الإجهاد وليس هو المسؤول عن اضطراب طبيعة الأكتين القشرية.
من أجل التحقيق في ما إذا كان تفعيل RhoA قد تكون ذات صلة الظواهر الموجودة في BBS، نحن اختبار ما إذا كان تثبيط RhoA بعد العلاج مع Y27632 يمكن إنقاذ الأجنة الزرد التي BBS الجينات كانت طرقت إلى أسفل. وقد استخدمت الزرد نطاق واسع لنموذج ciliopathies، وكما نحن وغيرنا قد ذكرت سابقا (17، 31، 32)، وجدنا أن ضربة قاضية من bbs6 أو bbs9 باستخدام أسفرت morpholinos التحقق من صحتها من قبل في الظواهر الهدبية نموذجية، بما في ذلك انحناء الجسم غير طبيعي، وعيون صغيرة والكلوية (سليفة الكلوة) الخراجات. نحن أيضا اختبار bbs4 وbbs8 morpholinos، ولكن وجدت أن الظواهر الناتجة كانت أقل اتساقا، وذلك ركزنا جهودنا لاحقة على bbs6 وbbs9. لأن علاج الأجنة الزرد مع Y27632 من المراحل الأولى للتنمية قاتلة (33)، اخترنا لعلاج الأجنة 24-48 ساعة بعد الإخصاب (HPF) باستخدام محلول مخفف من 100 ن م، وبعد ذلك كانت المخدرات washed- من والأجنة سمحت لتطوير حتى 4 أيام بعد الإخصاب.
استخدمنا العديد من المعلمات لقياس تأثير RhoA تثبيط على BBS morphants، بما في ذلك القطر من العين، وزاوية انحناء الجسم ومجال الخراجات سليفة الكلوة. وجدنا أن العلاج مع Y27632 أسفرت عن استرداد جميع الجوانب الثلاثة من النمط الظاهري. لmorphants bbs6 تعامل مع Y27632، لاحظنا انتعاشا 43٪ من القطر العين (39.66 ميكرون مقابل 56.74 ميكرون؛ P <0.0001) مقارنة مع morphants المعالجة السيارة، انحناء خفض الجسم (11.52 ° مقابل 4.072 °؛ P = 0.0176) و انخفاض معتدل في مجال الخراجات سليفة الكلوة (21.54 ميكرون 2 مقابل 14.30 ميكرون P = 0.0407). تم العثور على نتائج مماثلة لmorphants bbs9 قطر العين (44.07 ميكرون الإقليم الشمالي مقابل 79.18 ميكرون؛ P <0.0001)، انحناء الجسم (9،682 ° الإقليم الشمالي مقابل 3.993 °؛ bbs9 الإقليم الشمالي مقابل bbs9 ر P = 0.038) ومنطقة الكيسي (17.89 ميكرون 2 الإقليم الشمالي مقابل 9.131 ميكرون 2؛ bbs9 الإقليم الشمالي مقابل bbs9 ر؛ P = 0.0038 -value) (الشكل 8 والتكميلية المواد، الشكل 9.). كما وجدنا أن هناك انتعاشا في عرض القطع البدنية النمطية (bbs6 مو 30.0 ميكرون ± 1.19 مقابل مو bbs6 تعامل 43.0 ميكرون ± 0.668 وbbs9 مو 43.9 ميكرون ± 0.914 مقابل bbs9 مو تعامل 49.6 ميكرون ± 0.849)، والتي تتطلب بشكل خاص على درجة عالية نظمت الأكتين الهيكل الخلوي، رغم عدم وجود تغيير كبير في الزاوية التي شكلتها و somites (المواد التكميلية، الشكل 10).

الرقم 8.
الكمي من القطر العين، وزاوية الجسم ومنطقة الكيس سليفة الكلوة في تعامل bbs6 وbbs9 morphants. (A) تمثيل المقاييس المستخدمة لتحديد النمط الظاهري الزرد. اتخذت: ثلاثة قياسات مختلفة في 4 DPF الأجنة قطر العين من بطني لالظهرية، مجال الخراجات سليفة الكلوة إذا كان موجودا وزاوية من أعلى نقطة في جنين والجسم يعود إلى تمثيل للانحناء الجسم. ثم قارنا Y27632 morphants المعالجة وغير المعالجة مع اختبار ر -student. (B - D) الرسوم البيانية شريط تمثل آثار التعرض Y27632. (B) العلاج لا يؤثر على انحناء الأجنة WT (4،355 ° الإقليم الشمالي مقابل 5.198 ° ر)، وفي الوقت نفسه زاوية الجسم من bbs6 (11.52 ° الإقليم الشمالي مقابل 4.072 ° ر) وbbs9 (9،682 ° الإقليم الشمالي مقابل 3.993 ° ر) في المعالجة يتم استرداد الأجنة إلى المستويات العادية. (C) هناك انخفاض معتدل ولكن كبير في المنطقة التي الخراجات غطت في bbs6 المعالجة (21.54 ميكرون 2 الإقليم الشمالي مقابل 14.30 ميكرون 2 ر) وbbs9 (17.89 ميكرون 2 الإقليم الشمالي مقابل 9.131 ميكرون 2 ر) morphants. (D) وقطره العين لا يتأثر في الأجنة WT المعالجة (91.10 ميكرون الإقليم الشمالي مقابل 89.41 ميكرون ر)، ولكن يتم استرداد في bbs6 المعالجة (39.66 ميكرون الإقليم الشمالي مقابل 56.74 ميكرون ر) وbbs9 morphants (44.07 ميكرون الإقليم الشمالي مقابل 79.18 ميكرون ر). أرقام الأجنة WT لا تعامل ن = 52، morphants bbs6 الأجنة لا تعامل ن = 59، morphants bbs9 الأجنة لا تعامل ن = 51، وتعامل WT الأجنة ن = 43، bbs6 morphants الأجنة تعامل ن = 48، bbs9 morphants الأجنة تعامل ن = 43. P -values ​​موجز. قطر العين: WT الإقليم الشمالي مقابل WT ر P = 0.7219؛ bbs6 الإقليم الشمالي مقابل bbs6 ر P <0.0001؛ bbs9 الإقليم الشمالي مقابل bbs9 ر P <0.0001. منطقة كيس؛ bbs6 الإقليم الشمالي مقابل bbs6 ر P = 0.0407؛ bbs9 الإقليم الشمالي مقابل bbs9 ر؛ P = 0.0038. زاوية الجسم: WT الإقليم الشمالي مقابل WT ر P = 0.093؛ bbs6 الإقليم الشمالي مقابل bbs6 ر P = 0.0176؛ bbs9 الإقليم الشمالي مقابل bbs9 ر P = 0.038. ر، وتعامل. الإقليم الشمالي، لم يتم علاجها.

وقد تبين رودوبسين النبات إلى هدب لينظم إلى حد كبير من البروتينات استنادا Arf4، مثل ASAP1. استنزاف هذه البروتينات يقود الفشل إلى رودوبسين للوصول إلى هدب، الذي يرتبط الأكتين تراكم غنية في جميع أنحاء هدب المقبل لرودوبسين التعبير misslocalised (34). لذا رصدنا rho2 :: GFP الإيجابية في BBS morphants التالية Y27632 العلاج (35).فضلا عن الانتعاش من قطر العين، bbs6 أظهر morphants تعامل مع Y27632 الأرقام لم يزد من المستقبلات الضوئية، وفقا لتقييم رودوبسين التعبير، ولا سيما في الجزء البطني من شبكية العين (المواد التكميلية، الشكل S11).

نقاش

وpathomechanisms دقيقة الكامنة ciliopathies تتطلب مزيدا من الوضوح. ومع ذلك، فإننا نعرف أن إشراك مسارات الإشارات الرئيسية المرتبطة هدب الأساسي، وتشمل القنفذ الإشارات (36، 37)، وغير متعارف عليه الخلية القطبية WNT / مستو (PCP) الطريق (9) وmechanotransduction من خلال إشارات الكالسيوم (38) بين الآخرين. ولذلك فإنه ليس من المستغرب تماما أن البروتينات هامة لتكون الأهداب قد يكون لها أيضا أدوار إضافية رئيسية في العمليات الخلوية مثل الانقسام السيتوبلازمي، الهجرة و / أو تنظيم الأكتين هيكل الخلية.
البيانات المقدمة هنا هي متسقة مع فرضيتنا السابقة التي زادت البلمرة أكتين، من خلال RhoA التقلبات، يعطل وظيفة طبيعية من أهداب الابتدائي ويكمن وراء التسبب في BBS وciliopathies ربما آخرين. ويدعم هذه الملاحظات مزيد من الدراسات الأخرى حيث meckelin (MKS3)، من خلال التفاعل مع Nesprin-2، وينظم أيضا الهيكل الخلوي الأكتين (39، 40)؛ فقدان وظيفة البروتين ciliopathy، TMEM216 يؤدي إلى معيبة تكون الأهداب والالتحام centrosomal، مع ما يصاحب ذلك من hyperactivation RhoA وDishevelled (41)؛ والخلايا RPGR ناقصة خفضت أعداد أهداب، أبطأ تقدم دورة الخلية، وضعف التعلق الركيزة وزيادة الاستقرار FA (16). وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن شكل الخلايا وانقباض تنظم تكون الأهداب (42).
يتم التعبير عن البروتينات BBS في القاعدية الهيئات، centrosomes وaxonemes أهداب ومجموعة فرعية تشكيل مجمع ظيفية البروتين (BBSome) المطلوبة لتكون الأهداب (7، 43، 44). والمثير للدهشة، لاحظنا في هذه الدراسة أن Bbs8 وBbs9، سواء مكونات BBSome يتم التعبير، على مقربة من اتفاقات الصيد، مما يشير إلى وظيفة جديدة لهذه البروتينات في هذا الموقع. وصلة وظيفية بين اتفاقات الصيد والتجمع الأكتين هو راسخة (إعادة النظر في (45))؛ ومع ذلك، فإن إعادة توزيع الملاحظة (مركزيا) فاس في BBS-نقص الخلايا المهاجرة يشير إلى دور أكثر المحلي للبروتينات BBS في اتفاقات الصيد ربما الاستقرار. وبالنظر إلى حقيقة أن استنزاف النتائج RPGR في أكثر FA النضج (16) والتي RPGR يتفاعل مع الاتجار حويصلة البروتين Rab8 (المشار حاليا منصب Rab8a)، كما يفعل أعضاء BBSome، وتصل إلى تكون الأهداب وتنظيم طول الأهداب قد يكون أكثر وضوحا مما كان يعتقد سابقا.
ربما لدينا النتيجة الأكثر لفتا هي زيادة كمية نشط RhoA وجدت في Bbs4، Bbs6 وBbs8 خلايا متحولة. RhoA هو ضروري لبناء الأكتين قمي الزمنية شبكة لرسو السفن الجسم القاعدية والخيط المحوري النمو. في دراسة قام بها عموم وآخرون. (46)، منعوا تشكيل شبكة الإنترنت القمي والالتحام الجسم القاعدية من قبل انقطاع الأكتين إعادة عرض وكانوا يعتمدون على تفعيل RhoA. هذا النموذج هو يتفق مع النتائج في هذه الدراسة الحالية ومع تقرير سابق لدينا على الهجرة الجسم الأساسية، وعيوب لرسو السفن وتنظيم أكتين المعيبة عند فقدان bbs8 والبروتين PCP، vangl2 (42). وهذا، بدوره، يربط إلى دليل على وجود جهاز الإشارات المشترك يقودها أشعث الذي يحكم كلا قمي لرسو السفن ومستو استقطاب الهيئات القاعدية (47).
وخلاصة القول، توضح هذه الدراسة أن البروتينات BBS تلعب دورا مركزيا في تنظيم الهيكل الخلوي الأكتين من خلال تغيير في مستويات RhoA وتشكيل فاس. وعلاوة على ذلك، ديسريغولاتيون من هذه العملية يؤدي إلى انخفاض تكون الأهداب وبالتالي مختلف الاضطرابات مسار الإشارات التي تدعم الظواهر ciliopathy نموذجية. ولعل المستوى النسبي لهذا الاضطراب يشير خلال تطوير حسابات للحصول على درجة عالية من التباين الملاحظ في المرضى المصابين داخل وبين العائلات على حد سواء. بل انه قد يذهب بعض طريقة لشرح الاختلاف الأليلي شائع بين متلازمات.
هناك حاجة لدراسات مستقبلية لفهم الآلية الدقيقة التي الأكتين التحلل يؤثر تكون الأهداب. ومن الجدير بالذكر أن BBS4، BBS8 وBBS9 عنصران من مجمع BBSome، اللازمة لتكون الأهداب (23) والتي BBS4 وBBS8 تعدل PCP (17، 32) توفير رابط مؤقت.

المواد والطرق

زراعة الخلايا

تم الحصول على خلايا متحولة الأولية من Bbs4 وBbs6 الكلى الفئران فارغة. وقد نمت الخلايا والحفاظ في DMEM-Glutamax، 10٪ مصل وP / S. في التجارب التجويع المصل، كانت تزرع الخلايا حتى جوعا confluency ثم المصل لمدة 24 ساعة. الإنسان Bbs4 وBbs6 تم استنساخ السلطات الوطنية المعينة التكميلية في pCMV-HA ويبني pCMV-MYC وtransfected التالية Effectene ترنسفكأيشن الكاشف (QIAGEN) تعليمات. Bbs8 كان -shRNA سابقا تصميم والتحقق من صحتها في (12) وتبع بروتوكول ترنسفكأيشن نفسه.

أفلام

كانت مطلية خلايا الكلى الأولية غير متكدسة لمدة 12 ساعة في لوحات ستة جيدا قبل الحصول على الأفلام. وتم تشكيل لLSM 710 المجهر بمحركات مع الهدف × 63 حتى تأخذ إطار كل 10 دقيقة. تم استخدام البرمجيات Volocity (التايم، PERKINELMER) للسيطرة على المجهر وتحليل الأفلام.
للأفلام الأكتين مرور الزمن، كانت الخلايا غير المصنفة متموجة وtransfected في الزجاج 48-جيدا لوحات أسفل مع 10 ميكرولتر مع CellLight ™ أكتين-GFP * BacMam (إينفيتروجن). انتظرنا لمدة 48 ساعة، ومتحد البؤر Timelapse (متحد البؤر زايس 710 × 40 الهدف المياه) الصور أخذت كل 30 ثانية لمدة 1 ساعة.
للتجارب التئام الجروح وقد أخذت صور في بداية ونهاية التجربة. تم تحجيمها أربعة وثلاثون من هذه الصور وتم قياس السطح الفجوة استخدام برامج صورة J. وقد استخدم الفرق بين الأولى والنقطة الأخيرة أو مساحة تعافى من قبل الخلايا لأداء ر -test بين العينات.

المناعية

كان المثقف خلايا coverslips على وغسلها مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) قبل التثبيت. بعد غسلها 15 دقيقة في الخلايا الفورمالديهايد 3.7٪ في PBS مرتين. تم منع الخلايا مع 1٪ ألبومين المصل البقري في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة وحضنت مع الأجسام المضادة الأولية المخفف في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. تم غسلها الخلايا عدة مرات مع برنامج تلفزيوني والمحتضنة لمدة 1 ساعة مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المناسبة (إينفيتروجن اليكسا فلور). تمت إضافة Phalloidin-رودامين لمدة 20 دقيقة قبل دابي نوى تلطيخ. وأثيرت الأجسام المضادة ضد BBS9 وBBS8 في أرنب باستخدام الببتيدات محددة؛ SPHPAKTGDGAQAEDC لBBS9 وGFLRPSTQSGRPGTME لBBS8 (كما نشرت سابقا في (44) الأجسام المضادة تم اختبار خصوصية لطخة الغربية في الأنسجة المختلفة، واستخراج الخلايا كانت تركيزات الأجسام المضادة المستخدمة لمناعي:. جاما تويولين (Abcam GTU88) 1/200، تويولين الأسيتيل (سيغما T6793) 1/500، GAPDH (Abcam 9485) طخة غربية 1/1000، Vinculin (سيغما) 1/50، ومكافحة Bbs8 1/100 لالمناعي و1/200 لطخة غربية، ومكافحة Bbs9 1/100 و 1/200 لطخة غربية. لمثبط حركة الخلايا D (سيغما) التجارب، 1 م م كانت ثابتة أضيف من مثبط حركة الخلايا D إلى الآبار لمدة 5 دقائق، وغسلها مع متوسطة جديدة وسمح لاستعادة ل5 و 15 و 20 دقيقة. الخلايا مع 3.7٪ الفورمالديهايد وملطخة phalloidin-رودامين للحصول على أهداب طول مثبط حركة الخلايا D التجربة (100 ن م) وأضيف لمدة 24 ساعة. الخلايا كانت ثابتة والملون مع تويولين الضد الأسيتيل.

التنسيق الكمي التصاقات وقياسات مستوى F / G

وقد تم الحصول على Vinculin FA الصور المناعي من خلايا مفردة غير متموجة باستخدام فلوري المجهر زايس Z1 IMAGER مع كاميرا AxioCam MRM والبرمجيات Axiovision. تمت معالجة كل صورة يدويا وجميع اتفاقات الصيد لكل خلية حساب. لحساب المسافة بين اتفاقات الصيد وغشاء الخلية، واستخدمت صورا لخلايا Vinculin الملون. قمنا بقياس المسافة بين الجزء الأكثر البعيدة كل FA وأقرب غشاء الخلية. لquantifications الأكتين F / G، وقد استخدم نفس الإعداد المجهر. تم تجهيز جميع العينات معا لتجنب التغيرات في شدة. تم تأمين التعرض إلى 100 مللي من أجل اتخاذ جميع عمليات الاستحواذ لجميع العينات باستخدام نفس التعرض. تم استخدام صورة J البرمجيات لقياس كثافة كل من القنوات باستخدام المجال الكامل من كل صورة. تم استخدام هذه الكثافة لحساب نسبة الأكتين F / G.

قياس ميكانيكا الخلية باستخدام تطلع micropipette

تم استخدام نظام الطموح micropipette بالتزامن مع متحد البؤر المسح بالليزر المجهر (SP2، لايكا، UK) إلى نضح فرد WT وBbs4 - / - الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك تم إجراء المزيد من الدراسات باستخدام Bbs4 - / - الخلايا المعالجة مع المانع RhoA، Y27632. كان المثقف جميع الخلايا في أحادي الطبقة ومن ثم trypsinized واختبارها في تعليق. وشيدت على بال micropipettes من الزجاج الشعيرات الدموية (G-1، Narisinghe الدولية، المملكة المتحدة) وتكسرت إلى القطر الداخلي (على) من 6،5-7،5 ميكرون وظيفة جدار (φ) 2.1. تم تطبيق Sigmacote (سيغما، MO، الولايات المتحدة الأمريكية) لمنع التصاق الخلية إلى بال micropipettes. ويوضع تعليق خلية من 106 خلية / مل في غرفة مخصصة بنيت على مرحلة من مراحل المجهر المقلوب. وقد تم اختيار خلية فردية وضغط الفارغة من 1 سم H 2 O تطبيق لوضع الخلية في غيض من micropipette. ويستنشق الخلايا إلى أقصى الضغوط من 7 سم H 2 O بمعدل 5.48 سم H 2 O / ثانية. وسجلت الصور متحد البؤر GFPactin وما يقابلها من الصور brightfield كل 1.63 ق ل 180 ق باستخدام × 63 / 1،4 NA الهدف غمر النفط العائد الصور بحجم بكسل: 0.11 × 0.11 ملم. ويتكرر هذا الإجراء لمدة 10 خلايا من كل مجموعة. Bbs8 وBbs9 تم اختبار الأجسام المضادة خصوصية على الخلية لست] مختلفة البقع الغربية (التكميلي المواد، الشكل 8).
لكل خلية، وطول الطموح (L تم قياس) في micropipette من الصور brightfield وتآمر ضد الزمن. تم استخدام ماتلاب لتناسب التعبير التالي إلى البيانات استنادا إلى بولتزمان الصلبة الخطي قياسي (BSLS) نموذج اللزجة (48). ونتجت عن ذلك معامل التوازن الخلوي) التي تم استخدامها لتحديد صلابة من كل خلية.

RhoA فحص

لتفعيل الفحص RhoA، استخدمنا RhoA G-LISA ™ عدة تفعيل الفحص (الهيكل الخلوي BK124) باستخدام مجموع استخراج البروتين من الخلايا متموجة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. في المقايسات تثبيط RhoA، تم علاج الخلايا مع تركيز 10 م م من Y27632 (سيغما) لمدة 30 دقيقة، وغسلها مع برنامج تلفزيوني وتجهيزها لالمناعي أو استخراج البروتين. للتجارب ترانسفيراز C3، 2 ميكروغرام / مل رو المانع I ADP ribosylation رو الأسباراجين-41 (الهيكل الخلوي، CT04) في المصل خالية المتوسطة. للتجارب الأكتين هيكل الخلية، تم إصلاح الخلايا بعد 5 ساعات، وللتجارب طول أهداب الخلايا كانت ثابتة بعد 3 ساعات. تم العثور على البيانات الخام من هذه التجارب في التكميلية المواد، الجدول.

morpholinos الزرد

تم حقن morpholinos الزرد في الأجنة خلايا مرحلة واحدة. تسلسل morpholino والتراكيز المستخدمة هي؛ bbs6 ATG 5'-GCTTCTTCTTACTAATGCGAGACAT-3؛ 4 نانوغرام / جنين، bbs9 ATG 5'-GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAG-3؛ 4 NGR / جنين.
لعلاج Y27632، وdechoroniated الأجنة المحقونة في 24 HPF وفصلها في الآبار بمحلول مكون من 100 نيوتن متر من Y27632. بعد 24 ساعة (48 HPF) تم غسلها مرتين مع المياه العذبة وسمح لتطوير لمدة يومين آخرين. لكانت ثابتة الأجنة تلطيخ phalloidin رودامين مع 4٪ PFA بين عشية وضحاها، وغسلها مع برنامج تلفزيوني / توين 20 بنسبة 0.05٪ وملطخة بين عشية وضحاها بمحلول مكون من phalloidin-رودامين. تم الأجنة التي شنت شقة في Cytofluor وتم الحصول عليها أكوام متحد البؤر. تم استخدام صورة J البرمجيات لقياس عرض وزاوية و somites. للتعبير رودوبسين، استخدمنا خط المعدلة وراثيا تيراغرام (rho2: EGFP) CU3 الزرد التعبير عن EGFP كما هو موضح سابقا (35).

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس