عرض مشاركة واحدة
  #30  
قديم 12-06-2015, 06:22 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي على نطاق الجينوم التنميط التعبير من خطوط الخلايا lymphoblastoid يميز أشكال مختلفة من التوحد ويكشف تقاسم مسارات

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/16/14/1682.full



التوحد هو حالة غير المتجانسة التي يرجح أن يترتب من آثار جنبا إلى جنب العوامل الوراثية متعددة تتفاعل مع العوامل البيئية. وفي ضوء تعقيده، ودراسة التوحد المصاحب للاضطرابات جين واحد مندل أو مسببات الصبغية المعروفة تقدم وجهة نظر هامة. واستخدم الباحثون تحليل ميكروأري لمقارنة الشخصي التعبير مرنا في الخلايا lymphoblastoid من الذكور المصابين بالتوحد نتيجة لطفرة X الهشة (FMR1-FM)، أو الازدواجية 15q11-Q13 (الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q))، والضوابط غير التوحد. ملامح التعبير الجيني التمييز بوضوح التوحد من الضوابط وفصل الأفراد المصابين بالتوحد على أساس المسببات الجيني. حددنا 68 الجينات التي تم dysregulated مشتركة بين التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q). حددنا أيضا وصلة الجزيئي المحتمل بين FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)، وFMR1 حشوية التفاعل البروتين 1 (CYFIP1)، والتي كانت تصل التنظيم في الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) من المرضى. كنا قادرين على تأكيد هذا الرابط في المختبر من خلال إظهار التنظيم المشترك لاثنين من الجينات dysregulated أخرى، JAKMIP1 وGPR155، المصب FMR1 أو CYFIP1. نحن أيضا أكد الحد من البروتين Jakmip1 في Fmr1 الفئران خروج المغلوب، مما يدل على أهمية في الجسم الحي. وأخيرا، أظهرنا تأكيد مستقل لأدوار JAKMIP1 وGPR155 في اضطرابات طيف التوحد (أي إس دي إس) بإظهار التعبير عنها التفاضلية في أزواج السيب الذكور المتنافرة لASD مجهول السبب. وتوفر هذه النتائج دليل على أن التعبير خلايا الدم lymphoblastoid مشتقة الجينات من المرجح أن تكون مفيدة لتحديد مجموعات فرعية المسببة لمرض التوحد واستكشاف الفيزيولوجيا المرضية لها.
المقدمة

العوامل الوراثية هي المحددات الهامة من اضطرابات طيف التوحد (أي إس دي إس) الفيزيولوجيا المرضية (1 - 4). الآن، وقد أعاق تحديد الجينات المسببة بواسطة التجانس الوراثي والمظهري (1 - 18). وهكذا، فإنه يبدو من المعقول لتسريع عملية اكتشاف الجينات باستخدام مزيج من النهج التجريبية، مثل دراسة "جين واحد" أو أكثر من الأسباب بسيطة، مثل الاختلالات عدد نسخ الكروموسومات التي تشمل ASD (الظواهر 1 - +4). واحدة من هذه الفوضى هي متلازمة X الهش (FXS) (1 - 19)، والذي كان سببه التوسع في تسلسل المتكررة ثلاثي النوكليوتيد (CGG) ن في منطقة المروج للX التخلف العقلي الهش يقع 1 (FMR1) الجينات في Xq27.3 (20). هذا التحول يؤدي إلى عجز كبير من البروتين FMR1 (FMRP) والنمط الظاهري بما في ذلك ضعف الادراك والانحرافات السلوكية الأخرى التي تتداخل مع ASD. ويقدر انتشار ASD بين الحالات FXS في 15-33٪ (21، 22) و~1-3٪ من الذين يعانون من مرض التوحد وليس الخصائص الفيزيائية واضحة من FXS وجدت لديك FMR1-FM (19، 23).
اضطراب آخر يرتبط التعرض للASD هو الازدواجية الموروثة للأمهات من 15q11-Q13 (الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)) (+1 - +4، 24). عناصر تكرار متعددة داخل منطقة تتوسط مجموعة متنوعة من إعادة ترتيب، بما في ذلك الازدواجية الخلالي، triplications فراغي والزائدة الكروموسومات علامة isodicentric (25). الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) يحدث مع تردد المقدرة 1: 600 طفل مع تأخر في النمو (26)، وهو الأكثر شيوعا التباين في عدد النسخ تسبب ASD (3، 24). عدة أسطر من الأدلة (24، 27) تشير إلى أن التقلبات الجينات غير مطبوع في المنطقة تكرار يمكن أن تسهم في النمط الظاهري يعانون من التوحد لوحظ في الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q).
ولذلك، فإننا مسبب أن تحديد الجينات التي يتم dysregulated من قبل كل من FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) التعبير قد تكون ذات صلة ASD، منذ عقدين من تشوهات وراثية تمثل حالات الطفرات حيث واحدة، وإما تكرار ثلاثي النوكليوتيد أو نسخ تباين عدد (28 )، تسبب ASD. أردنا أيضا أن تدرس، كدليل على المبدأ، سواء ملامح التعبير lymphoblast الجينات التي حددها المجهرية يمكن أن تفرق أسباب هذه طفرة واحدة 'بسيطة' التوحد من بعضها البعض والضوابط. وهذا من شأنه توفير أساس لمواصلة تطبيق هذه الأساليب في التوحد مجهول السبب، حيث يمكن أن تشارك الميراث والبيئية التأثيرات مزيد من multigenic (1 - +4).
في الآونة الأخيرة، وأشارت العديد من الدراسات أن خلايا lymphoblastoid يمكن استخدامها للكشف عن الارتباطات معقولة بيولوجيا بين الجينات المرشحة والأمراض العصبية والنفسية، بما في ذلك متلازمة ريت (29)، مرتبطة X التخلف العقلي غير محدد (30)، والهوس الاكتئابي (31)، FXS (32) والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) (27). في هذه الدراسة، ونحن التحقيق ما إذا كانت ملامح التعبير الجيني للخلايا lymphoblastoid يمكن استخدامها ل: (ط) تمييز موضوعات التوحد الذين تم التحقق من وتشخيص وجود ASD في بورصة التوحد الوراثية الموارد (أوافق) (33) مستودع في فئات المسببة ( FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)) و (ب) تحديد الجينات والممرات المشتركة بين FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) التي قد تكون ذات صلة بمرض التوحد الفيزيولوجيا المرضية. هنا، علينا أن نبرهن على ملامح التعبير الجيني كانت قادرة على التمييز بوضوح الأفراد على أساس المسببات الخاصة بهم. حددنا أيضا 68 الجينات dysregulated في كل من التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q). ومن المثير للاهتمام، حددنا اتصال الجزيئي بين FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)، CYFIP1، الذي يتسبب بشكل كبير في الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) وكما هو معروف لاستعداء بعض جوانب وظيفة FMRP (34). أثبتنا أيضا أن التعبير عن يانوس كيناز وأنيبيب التفاعل البروتين 1 (JAKMIP1) وG البروتين يقترن مستقبلات 155 (GPR155) تم dysregulated عادة من قبل الحد من FMR1 أو تحريض CYFIP1 في المختبر. وdysregulated التعبير عن Jakmip1 أيضا في الدماغ من Fmr1 خروج المغلوب الماوس. وأخيرا، كنا قادرين على إظهار أن JAKMIP1 وGPR155 تم dysregulated في الذكور مع أي إس دي إس النسبية لأشقائهم غير المتضررة، وتوفير تأكيد مستقل لاقتراح ترتبط هذه الجينات مع ASD.

النتائج

المجموعات الهرمية وتحليل المكون الرئيسي الأفراد المتميزين بناء على مسببات وراثية

قمنا بتحليل كامل الجينوم الشخصي التعبير مرنا في الخلايا lymphoblastoid من 15 من الذكور التوحد (8 ذكور التوحد مع FMR1-FM و 7 ذكور التوحد مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)) و 15 من الذكور السيطرة غير التوحد من اغري (المواد التكميلية، الجدول S1) باستخدام اجيلنت الجامع الجينوم ميكروأرس الإنسان. وعموما، من 41 000 تحقيقات تحليلها، 31 044 تحقيقات، وهو ما يمثل 23 822 الجينات، وأعرب في الخلايا lymphoblastoid. للعثور على الجينات التي أعرب تفاضلي عبر المجموعات الخاضعة ثلاثة، تعرض ملف تعبير عن خلايا lymphoblastoid لتحليل التباين (ANOVA) (35). حددت ANOVA 293 المسابير (277 الجينات) أقل من معدل اكتشاف كاذبة محددة (FDR) عتبة 5٪ (المواد التكميلية، الجدول S2). وقد تبين أن التعبير عن FMR1 ينخفض ​​في الخلايا lymphoblastoid مع FMR1-FM (36)، وأنه تعبير عن UBE3A هو زيادة في الخلايا lymphoblastoid مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) (37). متطابقة مع هذه التقارير، كانت FMR1 وUBE3A بين 293 تحقيقات أعرب تفاضلي، وتوفير ضوابط مستقلة لتحليل ميكروأري.
كما هو مبين في الشكل 1 A و B، المجموعات الهرمية باستخدام 293 تحقيقات تصنف بشكل واضح الأفراد على أساس التركيب الوراثي بهم. تعرضوا للتحقيقات 293 أيضا إلى تحليل المكون الرئيسي (PCA). كما هو مبين في الشكل 1 C، ثلاثة عناصر PCA المهيمنة التي تحتوي على 70٪ من التباين في مصفوفة بيانات الأفراد فصل واضح على أساس المسببات الجينية. في هذه المؤامرة، وشكلت أول محور المكون الرئيسي ل56٪ من التباين في مجموعة البيانات وفصلها بشكل واضح التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) من الضوابط، في حين بلغت نسبة المكون الرئيسي الثاني (PC2) عن 10٪ من التباين والتوحد منفصل مع FMR1-FM من التوحد مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q). أفضل 10 الجينات التي تسهم في PC2 تشمل FMR1، UBE3A، CYFIP1، غير مطبوع في برادر ويلي / Angelman متلازمة 2 (NIPA2) ومجال وكان الحاخام هيشت وRLD 2 (HERC2). وتقع جميع الأخيرة أربع جينات في 15q11-Q13. وتشير هذه النتائج إلى أن تخفيض الانتقائي للFMR1 والحث الانتقائي لأربعة جينات تقع في 15q11-Q13 متباينة التوحد مع FMR1-FM من التوحد مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q). وتوفر هذه البيانات دليلا حاسما من حيث المبدأ أن ملامح التعبير الجيني للخلايا lymphoblastoid مفيد في دراسة مرض التوحد.

الشكل 1.
المجموعات الهرمية وPCA تفرق الأفراد على أساس المسببات الخاصة بهم. حددت ANOVA 293 تحقيقات مع التعبير يختلف كثيرا بين التوحد مع FMR1-FM = 8)، التوحد مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) = 7) والسيطرة = 15). تعرضوا للتحقيقات إلى المجموعات الهرمية وPCA. (A) التجميع الهرمي من 30 شخصا والجينات. يمثل كل صف الفرد ويمثل كل عمود واحد للتحقيقات 293. ويرد تمثيل الملونة الزائفة من كثافة نسبية، مثل أن اللون الأحمر يشير تعبير عالية واللون الأخضر التعبير منخفضة، مع حجم هو مبين أدناه. وأظهرت أيضا المسافة النسبية لكل التحقيق (المحور الأفقي) والأفراد (المحور الرأسي). (B) زيادة عدد أعضاء dendrogram المجموعات الهرمية من العينة في (A). كل ثمانية التوحد مع FMR1-FM، سبعة التوحد مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) و 15 الضوابط تتجمع بشكل صحيح ضمن فئاتها المسببة. يبين مقياس سبيرمان معامل ارتباط الرتب المستخدمة لبناء dendrogram. (C) PCA ملف التعريف التعبير عن تحقيقات 293 من 30 فردا. يظهر هنا ثلاثة عناصر رئيسية. وصفت التوحد مع FMR1-FM كما البرتقال، التوحد مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) كما أرجواني والسيطرة كما السماوي. تتجمع الأفراد وفقا لمسببات وراثية.

ميكروأري التحليلات كشف تداخل كبير من FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)

لتحديد مجموعة من الجينات الأكثر بقوة وأعرب تفاضلي في كل مجموعة، طبقنا ثلاثة الأساليب الإحصائية المختلفة، ANOVA، تحليل كبير من ميكروأري (SAM) (38) والرتبة تحليل المنتج (RankProd) (39). SAM هو تعديل الإحصائية ر -test، في حين RankProd هو إحصائية غير المعلمية التي يكشف العناصر التي يتم باستمرار مرتبة عالية في عدد من القوائم. حددت SAM 5139 تحقيقات وتحقيقات 1281 بالمهم (روزفلت <5٪) في التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)، على التوالي (الشكل 2 ألف وباء، التكميلية المواد، جداول S3 و S4). حددت RankProd 2281 تحقيقات و 1444 تحقيقات بالمهم (روزفلت <5٪) في التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)، على التوالي (الشكل 2 ألف وباء، التكميلية المواد، جداول S5 وS6). حددت مجموعة من ANOVA، SAM وRankProd 146 المسابير (120 الجينات) في التوحد مع FMR1-FM و 97 المسابير (80 الجينات) في التوحد مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) (الشكل 2 C). تم dysregulated ثلاثة وثمانين تحقيقات يمثلون 68 جينات في كل من التوحد مع FMR1-FM ومع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) (الجدول 1). وكانت هذه الدرجة من التداخل هامة للغاية (احتمال فوق الهندسي، P = 1.2 × 10 -153). تم dysregulated الخمسين اثنين من الجينات و 12 الجينات بشكل انتقائي في أي التوحد مع FMR1-FM والتوحد مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)، على التوالي (الجدول 2)، مع التغييرات أضعاف تتراوح بين 0.54 و 1.98 أضعاف.

الرقم 2.
وأعرب تفاضلي تحقيقات التي حددها ثلاثة الأساليب الإحصائية المختلفة، ANOVA، SAM وRankProd. فين الرسم البياني يبين عدد من التحقيقات التي تم تحديدها كما أعرب تفاضلي بين (A) التوحد مع FMR1-FM = 8) والسيطرة = 15) و (B) التوحد مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) = 7) والسيطرة ( ن = 15). (C) تداخل تحقيقات أعرب تفاضلي (الجينات) في التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q).


الجدول 1.
الجينات dysregulated في كل من التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)


الجدول 2.
الجينات dysregulated بشكل انتقائي في التوحد مع FMR1-FM أو الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)

أكد الكمي في الوقت الحقيقي PCR التعبير التفاضلية التي حددها تحليل ميكروأري

للتحقق من صحة التعبير التفاضلية التي حددها تحليل ميكروأري باستخدام أساليب مستقلة، أجرينا الكمي في الوقت الحقيقي PCR (qRTPCR) تحليل 19 الجينات اختيرت المقطع العرضي باستخدام نفس العينات المستخدمة في تحليل ميكروأري. أكد qRTPCR أن 17 من أصل 19 الجينات وأعرب تفاضلي كما هو متوقع من التحليل ميكروأري (الشكل 3 A-C). كان هناك ارتباط كبير للغاية الشامل بين ميكروأري والنتائج qRTPCR (ارتباط بيرسون، ص = 0.57، P <0.0001). وكانت أضعاف التغيرات الملحوظة مع qRTPCR أعلى عادة أن التغيير أضعاف أصغر لوحظ على المصفوفات.

الرقم 3.
تأكيد التعبير التفاضلي الجينات التي qRTPCR. تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من خلايا lymphoblastoid مع FMR1-FM، الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) أو السيطرة وqRTPCR أجريت للتأكد من التعبير التفاضلية التي حددها تحليل ميكروأري. (A) الجينات dysregulated تحديدا في التوحد مع FMR1-FM أو الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q). (B) الجينات التنظيم صعودا في كل من التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q). (C) الجينات downregulated في كل من التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q). وتمثل نتائج سائل ± SD من كل مجموعة. تم تعيين متوسط ​​قيمة الضابطة كما تم حساب 1. P -value التي كتبها مان ويتني U اختبار استخدام جهاز التحكم (N = 15) مقابل التوحد مع FMR1-FM (N = 8) أو التوحد مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) ( N = 7). * P <0.05، ** P <0.01 *** P <0.001.

كان CYFIP1 واحد من الجينات التي يسببها بشكل انتقائي في التوحد مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q). لأنه من المعروف CYFIP1 استعداء FMRP (34)، ونحن مسبب أن تحريض CYFIP1 في الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) قد يفسر بعض التداخل الكبير بين التوحد مع FMR1-FM ومع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q). JAKMIP1، المعروف أيضا باسم MARLIN- 1، وكان المستحث بشكل كبير في التوحد مع FMR1-FM، وكان اتجاها إيجابيا في التوحد مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) (P = 0.062)، مما يوحي بأن JAKMIP1 يمكن أن تمثل طريقا dysregulated عادة. في الواقع، حدد RankProd JAKMIP1 باسم الجينات بشكل ملحوظ التنظيم في الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) عن طريق التحليل ميكروأري (المواد التكميلية، جدول S6). هذا الجين هو مرشح لا سيما مهم من الناحية البيولوجية، نظرا لدوره المفترض في GABA B مستقبلات التعبير (40) والشبكات أنيبيب (41).

وظيفية الشرح كشف مسار ديسريغولاتيون

في محاولة للكشف عن الكسور الشائعة بين الجينات وأعرب تفاضلي، ونحن المصنفة الجينات في مجموعات الأنطولوجيا الجينات باستخدام DAVID (42). الجدول 3 يظهر أعلى المجموعات الثلاث التي حددها DAVID باستخدام الجينات 68 dysregulated في التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) أو 52 الجينات dysregulated بشكل انتقائي في التوحد مع FMR1-FM. وكان عدد من الجينات dysregulated بشكل انتقائي في التوحد مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) صغير جدا لتحليل باستخدام الوظيفي تجميع الشرح.

الجدول 3.
وظيفية تجميع الشرح باستخدام الجينات 68 dysregulated في كل من التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) أو 52 الجينات dysregulated بشكل انتقائي في التوحد مع FMR1-FM

الجينات المتعلقة بالاتصالات الخلية (P = 7.6 × 10 -6) ونقل الإشارة (P = 2.2 × 10 -5) وإثراء الأهم في الجينات 68 dysregulated عادة في التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q). وقد أثرى الجينات المتعلقة الاستجابة المناعية (P = 3.7 × 10 -3) والاستجابة الدفاع (P = 7.3 × 10 -3) أيضا في هذه المجموعة الجينات. الجينات المتعلقة كوصي تم تخصيب (P = 2.6 × 10 -2) والبروتين للطي (P = 3.2 × 10 -2) في 52 الجينات dysregulated بشكل انتقائي في التوحد مع FMR1-FM. الجينات المتعلقة RNA ملزم (P = 1.2 × 10 -2) ومرنا الأيض (P = 2.1 × 10 -2) وقد أثرى أيضا في هذه المجموعة الجينات، بما يتفق مع وظيفة البروتين FMRP باعتبارها بروتين ملزمة RNA المهم في الترجمة التنظيمية ( 43). تم العثور على المحرمين والبروتينات للطي عادة للعمل المشترك translationally، وتوفير وجود صلة محتملة مع وظيفة FMRP.
لتوفير تصنيف وظيفي أكثر دقة من الجينات، وكنا الإبداع تحليل المسار (IPA) (44)، أداة قوية للتحقيق في المسارات البيولوجية ممثلة في الجينات dysregulated عادة في التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q). يستخدم IPA البروتين البروتين والجينات الجين التفاعلات المعروفة التي تم اعدامها في قاعدة بيانات برعاية وشركاه قائمة الجينات وأعرب تفاضلي مع شبكات البيولوجية. حددت IPA ثلاث شبكات ذات دلالة إحصائية، تحتوي كل منها على 10 على الأقل الجينات (الجدول المواد التكميلية، الشكل S1). وكانت المهام الرئيسية المرتبطة بهذه الشبكات دورة الخلية (P = 5.2 × 10 -8)، حركة الخلوية (P = 1.3 × 10 -8) وخلية الى خلية الإشارات والتفاعل (P = 4.3 × 10 -8). وكانت "الإشارات والتفاعل خلية الى خلية" تتفق مع "خلية الاتصال" و "نقل الإشارة" فئات حددها DAVID. كان تحديد "النقل الجزيئي" مسار تحتوي على JAKMIP1 بالغا، نظرا لدور هذا الجين المعروف في الاتجار الجبار داخل الخلايا العصبية (41). وكانت هناك أيضا جينات أخرى مهمة في هذا المسار، بما في ذلك PSCD3، عاملا ADP-ribosylation من غير معروفة وظيفة الجهاز العصبي المركزي، وACTN1، وهو هيكل الخلية ترسيخ البروتين. JAKMIP1 يمكن أن تعمل جنبا إلى جنب مع هذه الجينات في فصل يشير المجمعات تشارك في نقل العصبي.

جدول (4).
شبكات الجينات التي حددها IPA باستخدام الجينات dysregulated في كل من التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)

تأثير downregulation من FMR1 ويصل تنظيم CYFIP1 في خلية العصبية على التعبير عن الجينات dysregulated المحددة في خلايا lymphoblastoid

على الرغم من أننا حددت الجينات dysregulated في التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) باستخدام خلايا lymphoblastoid، ونحن مهتمون في ما إذا كان التعبير عن هذه الجينات ستكون أيضا تعتمد على FMR1 وCYFIP1 في الخلايا العصبية. لدراسة تأثير FMR1 وCYFIP1 في الخلايا العصبية، استخدمنا خط جيدا اتسم الإنسان الخلية العصبية SH-SY5Y (45). FMR1 وCYFIP1 الاعتماد في الخلايا SH-SY5Y تم تقييمها باستخدام الحمض النووي الريبي دبوس الشعر القصير (shRNA) للحد من التعبير عن FMR1 وناقلات التعبير البلازميد للحث على التعبير عن CYFIP1، على التوالي. كما هو مبين في الشكل 4 A، تم تخفيض التعبير عن FMR1 إلى ~60٪ من المستوى الطبيعي في خلايا SH-SY5Y التعبير عن ثابت FMR1 shRNAs، في حين أن التعبير عن CYFIP1 وكان المستحث إلى حد كبير (11 ضعفا) في الخلايا SH-SY5Y ثابت مع transfected البلازميد CYFIP1.

الرقم 4.
وdysregulated JAKMIP1 وGPR155 بتخفيض FMR1 وتحريض CYFIP1. و transfected الخلايا SH-SY5Y مستقر مع (ط) ناقلات تعبر عن shRNA للسيطرة، (ب) ناقلات معربا عن shRNA لFMR1، (ج) ناقلات التعبير فارغة أو (د) ناقلات التعبير عن CYFIP1. تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من كل وأجريت qRTPCR للتحقق من تأثير FMR1 وCYFIP1 على التعبير عن JAKMIP1 وGPR155. (A) هو انخفاض التعبير عن FMR1 بشكل كبير في الخلايا SH-SY5Y معربا عن shRNA لFMR1، في حين أن التعبير عن CYFIP1 كان المستحث بشكل كبير في الخلايا SY5Y الإفراط في التعبير عن CYFIP1. (B) يتم تخفيض تعبير عن JAKMIP1 بشكل كبير في الخلايا SH-SY5Y معربا عن shRNA لFMR1 والإفراط في التعبير عن CYFIP1. هو فعل للتعبير عن GPR155 بشكل كبير في الخلايا SH-SY5Y معربا عن shRNA لFMR1 والإفراط في التعبير عن CYFIP1. وتمثل نتائج سائل ± SD من كل مجموعة. تم تعيين متوسط ​​قيمة كل عنصر تحكم كما تم احتساب 1. أهمية من اختبار مان ويتني U باستخدام الخلايا SH-SY5Y معربا عن shRNA من أجل السيطرة (N = 4) مقابل shRNA لFMR1 (N = 4) أو فارغة ناقلات التعبير (N = 8) مقابل ناقلات التعبير عن CYFIP1 (N = 7). * P <0.05، ** P <0.01.

كنا قادرين على مواصلة إثبات تأثير downregulation من FMR1 ويصل تنظيم CYFIP1 على التعبير عن اثنين من الجينات الرئيسية المصب (الشكل 4 B). في الخلايا SH-SY5Y مع transfected FMR1 shRNA، والتعبير عن JAKMIP1 وGPR155 انخفض بشكل كبير والتي يسببها، على التوالي. في الخلايا SH-SY5Y تم تخفيض أيضا الإفراط في التعبير عن CYFIP1، والتعبير عن JAKMIP1 وGPR155 والتي يسببها، على التوالي. وأظهرت هذه النتائج أن التعبير عن JAKMIP1 وGPR155 كان يعتمد أيضا على FMR1 وCYFIP1 في الخلايا SH-SY5Y وأن الحد من FMR1 وتحريض CYFIP1 يمكن أن تشترك الآثار المصب المشتركة على التعبير عن JAKMIP1 وGPR155.

كان التعبير عن بروتين JAKMIP1 تعتمد على FMR1 وCYFIP1

نحن التحقق من صحة بجانب تأثير FMR1 أو CYFIP1 على التعبير البروتين من JAKMIP1 في الجهاز العصبي المركزي (CNS). درسنا التعبير عن بروتين JAKMIP1 في قشرة Fmr1 خروج المغلوب (KO) والبرية من نوع (WT) الفئران والخلايا SH-SY5Y مع transfected في CYFIP1 الإفراط في التعبير البلازميد. تم تخفيض التعبير عن Jakmip1 في قشرة Fmr1 KO الفئران (الشكل 5 A) والخلايا SH-SY5Y الإفراط في التعبير عن CYFIP1 (الشكل 5 B). وأكدت هذه النتائج في المختبر النتائج التي كان التعبير عن Jakmip1 تعتمد على Fmr1 في مخ الفأر، مما يشير إلى أن على الأقل بعض التغيرات الملحوظة في الخلايا lymphoblastoid تعكس تغييرات مماثلة في الجهاز العصبي المركزي.

الرقم 5.
كان التعبير عن JAKMIP1 تعتمد على FMR1 وCYFIP1 في القشرة الماوس والخلايا SH-SY5Y. تم استخراج البروتينات من القشور من Fmr1 WT أو الفئران KO (A)، أو خلايا SH-SY5Y مع transfected ناقلات فارغة أو CYFIP1 كدنا] (B). تم تنفيذ النشاف الغربي للتحقق من أثر في الحد من FMR1 أو تحريض CYFIP1 على التعبير عن بروتين JAKMIP1. تم تخفيض التعبير البروتين من Jakmip1 في القشرة من الفئران Fmr1-KO (A)، وكذلك الخلايا SH-SY5Y مع transfected shRNA لFMR1 (لا تظهر البيانات) وSH-SY5Y أكثر، معربا عن CYFIP1 (B). وكانت البيانات الواردة في (A) و (B) ممثل تجربتين مستقلة.

كان التعبير عن JAKMIP1 وGPR155 تختلف كثيرا بين 27 أزواج السيب الذكور مخالف للASD مجهول السبب

لتحديد إمكانية تعميم المحتمل لهذه النتائج إلى التوحد مجهول السبب، قمنا بفحص ما إذا كان dysregulated التعبير عن JAKMIP1 وGPR155 أيضا في الخلايا lymphoblastoid من الحالات مجهولة السبب ASD. اخترنا 27 أزواج السيب الذكور المتنافرة لASD من اغري (المواد التكميلية، الجدول S1). لم الذكور 27 مع ASD ليس لديها FMR1-FM أو الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) وكان علامات الذكاء البديلة (المصفوفات الغراب التقدمية)> 70. كما هو مبين في الشكل والتعبير عن JAKMIP1 وGPR155 كان dysregulated بشكل ملحوظ في 27 من الذكور مع ASD بالمقارنة مع sibs من دون ASD. وتشير هذه النتائج إلى أن التقلبات من JAKMIP1 وGPR155 يرتبط مع ASD. عدم وجود الإعاقة الذهنية العامة في هذه المجموعة ASD تبين أيضا أن هذه dysregulations ليست مجرد نتيجة لضعف الادراك غير محددة أو الإعاقة الذهنية التي لوحظت في FXS والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q). ومع ذلك، في كل من في المختبر (خلايا SH-SY5Y) والحية (الدماغ) أنسجة الجهاز العصبي المركزي، وكانت توجيهات JAKMIP1 وتنظيم GPR155 معاكسة لتلك التي لوحظت في الخلايا lymphoblastoid. قد تعكس الاختلافات العديد من الحقائق، بما في ذلك تخليد أو مسارات الإشارات التنظيمية البديلة في الأنسجة المختلفة. ومع ذلك، وهذه البيانات هي ثابتة بين FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) وتشير إلى أن التعبير عن JAKMIP1 وGPR155 ينظمه كل من FMR1 وCYFIP1 المستويات، على الرغم من أن مختلف بين الأنسجة العصبية والخلايا lymphoblastoid، وتوفير مسارات الإشارات المشتركة المحتملة dysregulated في ASD ( الشكل 7).

الرقم 6.
وdysregulated JAKMIP1 وGPR155 في المستلفت ASD في المتنافرة أزواج السيب الذكور. تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من خلايا lymphoblastoid من 27 أزواج السيب الذكور المتنافرة لASD وqRTPCR أجريت للتأكد من التعبير التفاضلية من JAKMIP1 وGPR155. وتمثل نتائج سائل ± SD من كل مجموعة. تم تعيين متوسط ​​قيمة الضابطة كما تم احتساب 1. P -value من قبل اختبار Wilcoxon رتبة محصلتها استخدام وسائل منع (N = 27) مقابل ASD (N = 27). * P <0.05.


الرقم 7.
التقارب الجزيئي للFMR1-FM، الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) وASD مجهول السبب. وتمت مقارنة البيانات الشخصية التعبير مرنا في الخلايا lymphoblastoid من التوحد مع FMR1-FM أو الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) والتحكم باستخدام تحليل ميكروأري. تم dysregulated ثمانية وستين الجينات في كل من التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q). تحريض CYFIP1 في الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) هو وجود صلة محتملة بين الجزيئية FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q). بين الجينات dysregulated، وقد تم تحليل JAKMIP1 وGPR155 كذلك لتأكيد العلاقة السببية بين CYFIP1 والتعبير FMR1 والتعبير عنها في الخلايا العصبية أو الأنسجة وللتحقق من صحة ديسريغولاتيون من هذه الجينات في الخلايا lymphoblastoid من الموضوعات مع ASD مجهول السبب.

نقاش

التوحد هو حالة غير متجانسة والنتائج المحتملة من الآثار المجتمعة للتغيرات جينية متعددة بما في ذلك نسخة الاختلافات عدد والأشكال النووية المنفردة، والتفاعل مع العوامل البيئية (+1 - 4). تصنيف المرضى الذين يعانون من التوحد على أساس الوراثي والمعلومات المظهرية هي طريقة واحدة فعالة لتحديد مجموعات فرعية أكثر تجانسا والإسراع في التعرف على الجينات الكامنة وراء مرض التوحد (1 - 4). حوالي 3٪ من الأطفال الذين يعانون من التوحد إما FMR1-FM أو الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)؛ يضم هؤلاء المرضى السكان متجانسة للتحقيق.
في هذه الدراسة، أجرينا التعبير مرنا التنميط العالمي في الذكور المصابين بالتوحد تحمل إما FMR1-FM أو الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) والذكور في السيطرة. وجدنا أن هؤلاء الأفراد الذين يعانون من التوحد يمكن التمييز على أساس مسببات وراثية على أساس lymphoblast ملامح التعبير الجيني. ومن المثير للاهتمام، كما كشف هذا التحليل المشترك توقيع التعبير الجيني عبر هذه شرطين جينية منفصلة الذي كان مختلفا كثيرا عن ملامح السيطرة. كنا تقاطع ثلاثة الاختبارات الإحصائية المختلفة لتحديد الجينات الأكثر بقوة وأعرب تفاضلي (35، 38، 39)، وأكدت البيانات qRTPCR هذه الاستراتيجية اختيار الجينات.
ملامح التعبير الجيني للخلايا lymphoblastoid تحمل FMR1-FM

حددنا 120 الجينات وأعرب تفاضلي في ناقلات FMR1-FM مقارنة مع الضوابط. ومن بين هذه الجينات، NR3C1 وVIM تم تحديدها سابقا باسم الرنا الهدف من FMRP (46)، على الرغم من أن التغييرات مرنا التعبير عن هذه الجينات في FMR1-FM لم يتم الإبلاغ عنها. براون وآخرون. (32) التي سبق تحديدها 144 الجينات كما أعرب تفاضلي في الابيضاض اللمفاوي مع FMR1-FM باستخدام تجميع الخلايا lymphoblastoid X الهش والخلايا lymphoblastoid العادية المجمعة. لأنه لم يكن هناك أي تداخل فيما عدا FMR1 بين هذه الجينات 144 و 120 الجينات المحددة هنا مع التحليلات الأكثر صرامة لدينا باستخدام ANOVA، SAM وRankProd، استخدمنا قائمة الجينات أكبر تحديدها من قبل أي SAM و / أو RankProd للمقارنة مع الجينات 144 التي حددها براون وآخرون. وجدنا أن 13 جينات تم تبادل في قوائم الجينات هذه، بما في ذلك iduronate 2-سلفاتاز (IDS)، شعر ومحسن من الانقسام 1 (HES1) والغلوبولين المناعي الفصيلة، عضو 3 (IGSF3) ما يصل التنظيم الجينات والبروتينات المرتبطة CDK2 2 (CDK2AP2)، ببتيداز محدد بتحول 8 (USP8)، MAX مثل البروتين X (MLX)، البروتين الريباسي S5 (RPS5)، C-محطة بروتين ملزمة 1 (CTBP1)، الطحال التيروزين كيناز (SYK)، F-مربع بروتين 6 (FBXO6)، تنشيط بروتين كيناز mitogen كيناز كيناز 11 (MAP3K11)، والفرز نيكسين 15 (SNX15) وCD44 المستضد (CD44)، والجينات downregulated. ومع أنه لم يتم الإبلاغ عن هذه الجينات ما يرتبط بها مع FMR1 أو التوحد، وارتبط HES1 مع اضطراب نقص الانتباه فرط النشاط الحركي (47)، وهو أحد أعراض غالبا ما نراها في FXS (48) ومتداخلة مع ASD (49). التداخل منخفض نسبيا بين القوائم الجينات اثنين يمكن أن يعزى لاختلاف المظاهر السريرية للأفراد (التوحد مقابل يست محددة لمرض التوحد)، التصميم التجريبي (كل على حدة مقابل مجمع)، منصات ميكروأري (اجيلنت مقابل Affymetrix) والتحليل الإحصائي المستخدمة للعثور على التعبير الفرق بين المجموعات. الدراسة الأولية (32) هدفها الأساسي هو إيجاد FMRP mRNPs يجند كان أضعفت نسبيا لكشف الفروق الشاملة في التعبير الجيني واستخدمت دراستنا معايير إحصائية متحفظة جدا. ومع ذلك، هذه مجموعة أساسية من الجينات يوفر قائمة الجينات مثيرة للاهتمام لمزيد من التحقيق.

ملامح التعبير الجيني للخلايا lymphoblastoid مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)

حددنا 80 الجينات وأعرب تفاضلي في الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) ناقلات مقارنة مع الضوابط. ومن بين هذه الجينات، أربع جينات تقع في 15q11-Q13 (منطقة الازدواجية) UBE3A، CYFIP1، NIPA2 وGOLGA8F كانت يسببها جميع. ومن المهم أن نلاحظ أن خمسة جينات أخرى تقع في منطقة تكرار، تويولين جاما مجمع بروتين يرتبط 5 (TUBGCP5)، HERC2، HERC2 جين كاذب 2 (HERC2P2)، وقد تم تحديد NIPA1 وATP10A أيضا ما يصل التنظيم الجينات واحدة على الأقل من التحليلات الإحصائية الثلاثة المختلفة (المواد التكميلية، جدول S7). خمسة جينات أخرى في المنطقة تكرار، وحمض الغاما غاما A مستقبلات (جبر) بيتا 3 (GABRB3)، جبر ألفا 5 (GABRA5)، جبر غاما 3 (GABRG3)، عيني جلدي المهق II (OCA2) وhomolog necdin (NDN)، لم أعرب في المستويات التي يمكن اكتشافها في الخلايا lymphoblastoid. ومن المهم التأكيد على أن المنطقة 15q11-Q13 تخضع ليطبع الأب. ثلاثة جينات مطبوع أبويا، خاتم makorin البروتين إصبع 3 (MKRN3)، أظهر وأعرب عن 2 (MAGEL2) وSNRPN إطار القراءة المنبع (SNURF) -small بروتين نووي ريبوزي ببتيد النووي N (SNRPN) في الابيضاض اللمفاوي، ولكن مثل MAGE أي تغييرات كبيرة مقارنة لضوابط. هذه البيانات تتفق مع حقيقة أن المنطقة تكرار استمد للأمهات في جميع الحالات السبع التي تم تحليلها في هذه الدراسة. لذلك، وعموما، فإن هذه النتائج تشير إلى أن الجينات الموجودة في المنطقة تتكرر كانت على مستوى العالم باستثناء الجينات مطبوع أبويا التنظيم صعودا. كما تم الإبلاغ العالمي يصل التنظيم بسبب الجينات الجرعة في متلازمة داون (50، 51).
بارون وآخرون.(27) حددت 81 الجينات المعروفة باسم أعرب تفاضلي في الخلايا lymphoblastoid مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) (سبعة أشخاص) مقارنة مع الضوابط (ثمانية أشخاص) باستخدام منصة Affymetrix. حددوا يصل تنظيم UBE3A، NIPA1، NIPA2 وHERC2، والنتائج متسقة مع النتائج التي حققناها. استخدمنا قائمة الجينات التي حددها SAM و / أو RankProd للمقارنة مع الجينات 81 التي حددها بارون وآخرون. وحددت 11 الجينات الأخرى المشتركة في القوائم الجينات اثنين، تداخل كبير (احتمال فوق الهندسي هو 0.001). وكانت هذه الجينات abhydrolase مجال تحتوي على 6 (ABHD6)، قناة البوتاسيوم، فصيلة K، عضو 1 (KCNK1)، البروتين افتراضية KIAA1147 والزنك الاصبع، مجال DHHC تحتوي على 14 (ZDHCC14) ما يصل التنظيم ورو GTPase تفعيل بروتين 25 (ARHGAP25) ، استنساخ LOC387882، الليكوترين B4 12 hydroxydehydrogenase (LTB4DH)، استنساخ MGC27165، PFTAIRE بروتين كيناز 1 (PFTK1) والزنك البروتين إصبع 43 (ZNF43) وحلقة البروتين إصبع 41 (RNF41) كما downregulated. ولا تزال العلاقات بين هذه الجينات والتوحد غير معروفة. مرة أخرى، على غرار دراسات FMR1-FM، هذه الجينات تمثل مجموعة من الجينات تكرارها بشكل مستقل بين دراستين.

تداخل كبير من الجينات dysregulated في التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)

حددنا 68 الجينات التي تم dysregulated في كل من التوحد مع FMR1-FM ومع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)، وهي نتيجة كبيرة جدا (فوق الهندسي احتمال من هذا التداخل هو 1.2 × 10 -153). ومع ذلك، لا يمكننا استبعاد احتمال رسميا أن بعض الجينات 68 dysregulated المشتركة قد تكون ذات صلة لمسارات مشتركة بين FMR-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) لا علاقة لها ASD. هناك حاجة إلى تحليل ميكروأري باستخدام خلايا lymphoblastoid مع FMR1-FM أو الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)، ولكن من دون ASD لاستبعاد احتمال، كما حدث في حالات التصلب درني مع وبدون التوحد (51).
وجدنا أن التعبير عن CYFIP1 وكان المستحث بشكل كبير في التوحد مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q). وقد تبين CYFIP1 استعداء FMRP في النظام العين والجهاز العصبي من ذبابة الفاكهة (34). في FXS، وغياب FMRP، وهو شريك ملزمة لCYFIP1، والنتائج في CYFIP1 مجانا الزائدة. وبالمثل، قد يكون CYFIP1 مجانا تتجاوز نتائج الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q). وهكذا، antagonization من FMRP عن الإفراط في التعبير عن CYFIP1 و / أو إجراءات بديلة لCYFIP1 الزائدة قد تكون الروابط الآلية المشتركة بين FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q).

تأثير FMR1 وCYFIP1 على الجينات dysregulated عادة في SH-SY5Y ومخ الفأر

نحن التحقق من صحة تأثير downregulation من FMR1 في الخلايا SH-SY5Y والفأر الدماغ وتصل تنظيم CYFIP1 في الخلايا SH-SY5Y على التعبير عن الجينات dysregulated شيوعا التي تم تحديدها في خلايا lymphoblastoid المرضى. أثبتنا أن التعبير عن JAKIMIP1 وGPR155 كان dysregulated بتخفيض FMR1 وتحريض CYFIP1 في الخلايا SH-SY5Y. وdysregulated البروتين Jakmip1 أيضا الضربة القاضية من Fmr1 في مخ الفأر. ومن المثير للاهتمام، وكان اتجاه التغيرات التي لوحظت في كل من هذه الجينات في الأنسجة العصبية المعاكس (خلايا SH-SY5Y والدماغ) والخلايا lymphoblastoid. هذه الاختلافات بين خلايا المخ والدم وقد لوحظ سابقا في مسارات الإشارات الأخرى (31، 52). ومن المرجح أنه ليس الاتجاه الدقيق لوحظ في خلايا lymphoblastoid وهذا هو الاهم، ولكن التقلبات مشترك من JAKMIP1 وGPR155 المصب من هذه العيوب جين واحد، والذي لوحظ في ASD مجهول السبب.
JAKMIP1 يترافق مع تحركات يانوس (41)، الأنابيب الدقيقة (41) وجبر B مستقبلات (40). مستويات التعبير عن JAKMIP1 تؤثر على مستويات الخلايا من جبر B مستقبلات (40). لأن جبر B مستقبلات يمكن أن تتفاعل مع مستقبلات الغلوتامات metabotropic 1 (mGluR1) وزيادة حساسية الغلوتامات من mGluR1 (53)، JAKMIP1 قد تؤثر mGluR1 يشير من خلال جبر B مستقبلات. ومن المهم أن نلاحظ مبالغ فيه في ذلك إشارة mGluR Fmr1 الفئران خروج المغلوب (54) والتي glutamergic وتم الإبلاغ نظم GABAergic أن يكون غير طبيعي في التوحد (55). Jakmip1 يتم التعبير بدرجة عالية من مخ الفأر، وخصوصا في الحصين، حيث جبر B أيضا يتم التعبير عن درجة عالية من مستقبلات وmGluR1 (56). على الرغم من أن وظيفة Gpr155 غير معروفة، يتم التعبير عن ذلك بشكل كبير في الجهاز الحوفي في الدماغ الماوس (56)، مما يوحي بأن Gpr155 قد يكون لها وظائف ذات الصلة إلى الجهاز الحوفي.
ومن المثير للاهتمام أيضا للنظر في كيفية الحد من FMR1 وتحريض CYFIP1 قد تنظم التعبير عن JAKMIP1 وGPR155. وقد ثبت الزخارف G-quadruplex في الحمض النووي الريبي للعب أدوار هامة في FMRP ملزم (57). باستخدام QGRS مخطط (58)، وجدنا أن الإنسان والفأر JAKMIP1 كان كل اثنين من G-quadruplex (G 2 N 2-4 G 2 N 2-4 G 2 N 2-4 G 2) وأن الإنسان والفأر GPR155 وكان خمسة واحدة من G-quadruplex، على التوالي (لا تظهر البيانات). ويمكن أيضا ربط FMRP الرنا المستهدفة من خلال الرنا غير المكودة (59) أو microRNAs (60). باستخدام miRBase (61)، وجدنا المفترض الرنا الميكروي المواقع في الإنسان والفأر ملزمة JAKIMIP1 وGPR155 (لا تظهر البيانات). هناك حاجة لدراسات إضافية لتوضيح أهمية وظيفية من JAKMIP1 وGPR155 في التوحد وآلية تنظيم هذه الجينات التي FMR1 وCYFIP1. في هذا الصدد، والعلاقة المحتملة مع انتقال الخلايا العصبية هو فضول.

التعبير عن JAKMIP1 وGPR155 كان dysregulated أيضا في 27 من الذكور مع ASD مجهول السبب

وتشير هذه النتائج في التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) أن JAKMIP1 وGPR155 قد يكون متورطا بشكل عام في ASD مجهول السبب، منذ لوحظ التقلبات في الخلايا العصبية والمخ. نحن اختبار ما إذا كانت التقلبات من هذه الجينات كانوا أكثر للتعميم في عينة مستقلة من الحالات مجهولة السبب ASD. في محاولة للحد من عدم تجانس مجهول السبب ASD وتوسيع هذه النتائج تتجاوز تلك بالتخلف العقلي أو الإعاقة الذهنية، استخدمنا بديل IQ بناء على مصفوفات الغراب، والذي يرتبط ارتباطا وثيقا IQ يحددها تدابير أخرى (62). اخترنا 27 من الذكور ASD مع درجة الذكاء أكثر من 70. وهذه البيانات أظهرت أن التعبير عن JAKMIP1 وGPR155 كان dysregulated بشكل كبير في الخلايا lymphoblastoid من ASD مجهول السبب عند مقارنة مع الضوابط. هذه النتائج بناء على بيانات مستقلة على lymphoblastoid التعبير الجيني خلية من المواد ASD مع FMR1-FM، أو الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q)، وكذلك ASD مجهول السبب، تشير إلى أن JAKMIP1 وGPR155 قد يكون من المفيد والمؤشرات الحيوية لASD. في هذه العينة عموما، JAKMIP1 يبدو أن dysregulated أكثر بقوة من GPR155، على الرغم من أن ظهرت الخلافات التعبير غير المتجانسة. كيف ديسريغولاتيون من هذه الجينات يتعلق فرعية التوحد متميزة سيكون من المهم أيضا لتحديد في المستقبل.
آلية لتنظيم المعاكس من JAKMIP1 وGPR155 يبقى في الخلايا العصبية والخلايا lymphobastoid غير واضحة. هناك عدة تقارير سابقة من الجينات التي تبين التعبير المعاكس بين الخلايا lymphoblastoid والعقول في أمراض العصبية والنفسية. ومن الأمثلة على ذلك إينوزيتول monophosphatase 2 (IMPA2)، والتي تم تحديدها على أنها مكان معقول لالاضطراب الثنائي القطب (+63 - 65). التعبير عن IMPA2 تم تخفيض ويتسبب في الخلايا والعقول lymphoblastoid، على التوالي، في المرضى الذين يعانون من اضطراب ثنائي القطب (66). وجود ارتباط الوراثية بين IMPA2 تم تأكيد تعدد الأشكال المروج والاضطراب الثنائي القطب (67، 68). وفي هذا الصدد، تجدر الإشارة إلى أن GPR155 يقع على 2q31.1، 300 كيلو بايت من D2S2188، التي أظهرت صلة قوية إلى التوحد في الدراسات التي مجموعتين مستقلة (6، 69). تحليلات جمعية GPR155 وJAKMIP1 جارية باستخدام فوج اغري كبيرة. وتوفر هذه البيانات تحديد الأول والتحقق المستقل من أدوار JAKMIP1 وGPR155 التقلبات في ASD (الشكل 7). هناك حاجة إلى مزيد من العمل لفهم العواقب الوظيفية لهذه التغيرات في الدماغ النامية وتقييم فائدة العامة من هذه الجينات وغيرها من المؤشرات الحيوية المحتملة.

المواد والأساليب

الأفراد والخلايا lymphoblastoid تحليلها في هذه الدراسة

قمنا بتحليل الأفراد تشخيص ASD باستخدام المعايير القياسية التحقق من صحتها، بما في ذلك مقابلة تشخيص التوحد (ADI-R) (70) والتوحد جدول التشخيص مراقبة (ADOS) (71). وضعت ثمانية ذكور مع FMR1-FM وثلاثة ذكور مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) من آغر (33) (http://www.agre.org/). وقد حصلت على أربعة ذكور إضافية مع الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) من NCS سبعة وعشرون من الذكور دون التوحد، ووضعت FMR1-FM أو الحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) من آغر لعناصر. وبالإضافة إلى ذلك، تم اختيار 27 ذكور آخر مع ASD مجهول السبب ومع الأشقاء الذكور تتأثر من آغر لعينة المقارنة (المواد التكميلية، الجدول S1). وكانت درجات معدل الذكاء البديلة (باستخدام الغراب مصفوفات) المتاحة. تم فحص FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q) بواسطة PCR ومضان خارج الموقع في التهجين، على التوالي. وقد استمدت هذه المناطق تكرار 15q11-Q13 في الذكور سبعة تحليلها في هذه الدراسة جميع أمهات. كنا أيضا 14 شخصا آخرين من اغري للمرجعية مشتركة (تجمع) في تحليل ميكروأري (لا تظهر البيانات). وكانت خطوط الخلايا lymphoblastoid (ابشتاين بار فيروس تتحول الخلايا الليمفاوية الإنسان) من هؤلاء الأفراد المتاحة من اغري.
وقد نمت الخلايا lymphoblastoid من الموضوعات في RPMI 1640 متوسطة مع 2 م م L-الجلوتامين و 25 م م HEPES (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية)، و 10٪ مصل بقري جنيني، و1 حل × مضادات الحيوية مضاد فطري (إينفيتروجن) عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 غرفة. وقد نمت الخلايا إلى كثافة 6 × 10 5 / مل. وأولي اهتمام خاص للحفاظ على جميع خطوط الخلايا في نفس الظروف لتقليل التباين البيئي.

تجارب ميكروأري

ما مجموعه 9 × 10 6 وكانت المصنفة الخلايا lymphoblastoid في T-75 قارورة في 30 مل من المتوسط ​​الطازجة. بعد 24 ساعة، تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا باستخدام أدوات RNeasy البسيطة مع العلاج الدناز (QIAGEN، فالنسيا، CA، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم قياس كمية الحمض النووي الريبي والجودة من خلال ND-100 (معمل NanoDrop، ويلمنجتون، DE، الولايات المتحدة الأمريكية) و 2100 Bioanalyzer (اجيلنت، سانتا كلارا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية)، على التوالي.
تم تنفيذ إعداد المستهدفة باستخدام منخفض RNA الإدخال الفلورية الخطية التضخيم كيت (اجيلنت) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخرجنا مجموع RNA من خلايا lymphoblastoid من كل هدف على حدة وجعل وصفت مع Cy5 مضان. ونحن أيضا الهدف المرجع باستخدام تجميع الحمض النووي الريبي مجموع من 14 شخصا للرجوع إليها وصفت مع CY3 مضان. كانت الأهداف ولدت مختلطة وتعرض لالتهجين إلى الجامع الجينوم البشري صفيف G4112A (اجيلنت) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. وقد أجريت المسح الضوئي للالمجهرية التي كتبها ماسح ضوئي متطورة للحمض النووي (اجيلنت).
وكانت الماسح الضوئي الناتج ملفات الصور تطبيع وتصفيتها باستخدام v8.5 ميزة استخراج البرمجيات (اجيلنت). تم إجراء تطبيع لذلك هي أن نسبة كثافة الشاملة للCy5 إلى CY3 يساوي واحد. واستخدمت تحقيقات مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء> 2.7 في كل CY3 وCy5 في ما لا يقل عن 14 من 15 ضوابط لمزيد من التحليل.

التحليل الإحصائي للبيانات ميكروأري

تم تنفيذ ANOVA التي كتبها MeV3.1 (72). P حسبت -values ​​استنادا 1000 التباديل. تم تنفيذ المجموعات الهرمية باستخدام رتبة ارتباط سبيرمان مع متوسط ​​ربط المجموعات التي MeV3.1. تم تنفيذ PCA باستخدام GeneSpring GX7.3 (اجيلنت). SAM (38) وRankProd (39 تم تنفيذها) باستخدام Bioconductor (73) الحزم Siggene وRankProd، على التوالي. لعبر التحقق من صحة في SAM وRankProd، على التوالي، تم تنفيذ 100 و 1000 التباديل. كنا ثلاثة الاختبارات الإحصائية المختلفة لتحديد متحفظ الجينات الأكثر بقوة وأعرب تفاضلي. وقد تم تطبيق العديد من طرق اختيار الميزة لتحديد الجينات وأعرب تفاضلي في البيانات ميكروأري (74). الجينات التي تم تحديدها عادة من قبل ANOVA، SAM وRankProd من المرجح أن يتم التعبير عنها بشكل مختلف، نظرا لقوة النسبية لهذه الطرق الإحصائية (35، 38، 39، 74). تم إجراء وظيفي الشرح للمجموعات التي كتبها DAVID (42) مع تصنيف التشدد المتوسطة. ويستند خوارزمية التجميع على الفرضية القائلة بأن يجب أن يكون الشروح مماثلة أعضاء جين مماثل. يستخدم الوظيفي الشرح تقسيم اثنين إحصاءات مختلفة لقياس درجة من الجينات المشتركة بين اثنين من الشروح وتصنيف المجموعات مع شروح مماثلة. نقاط المجموعة التخصيب هو المتوسط ​​الهندسي (في - تسجيل نطاق) لأحد أعضاء لP -values ​​في كتلة الشرح المقابلة. وقد استخدم IPA لإيجاد مسارات هامة تتعلق الجينات dysregulated عادة في التوحد مع FMR1-FM والحزب الاتحادي الديمقراطي (15q). قاعدة معارف المسار الإبداع يبني شبكات الجينات بناء على البروتين والجين التفاعلات المعروفة (44). IPA يحدد النتيجة الإحصائية لكل الشبكة وفقا لاحتمال الشبكة التي وردت في قائمة الجينات. يوفر قاعدة المعارف الإبداع المسار مسارات مع وظيفة بيولوجية استنادا إلى الأدبيات العلمية. قيمة الأهمية المرتبطة الوظائف وسبل يقيس مدى احتمال هو أن جينات من ملف مجموعة البيانات تشارك في تلك الوظيفة البيولوجية. وأعرب عن أهمية باعتبارها P -value، والذي يحسب باستخدام اختبار الحق الذيل فيشر الدقيق.

تحليل qRTPCR

وقد استخدم واحد ميكروجرام من مجموع RNA لجعل كدنا] من قبل مرتفع الثالث لأول ستراند التجميعي SuperMix (إينفيتروجن). تم إجراء qRTPCR التي كتبها ABI بريزم 7900 (النظم البيولوجية التطبيقية، فوستر سيتي، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام البلاتين SYBR الأخضر QPCR SuperMix UDG مع ROX (إينفيتروجن). وتألفت الدراجات الحرارية خطوة مبدئية عند 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تليها خطوة أخرى في 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 50 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تم إجراء qRTPCR لمدة 16 الجينات. يتم عرض الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة في المواد التكميلية، جدول S8. TAQMAN التحقيق (Hs00327005_m1، النظم البيولوجية التطبيقية) وذلك لقياس JAKMIP1 التعبير في الخلايا lymphoblastoid. وتم تطبيع البيانات عن طريق كمية هيبوزانتين فسفوريبوزيل 1 (HPRT1). HPRT1 اختير بدلا من بيتا الأكتين، نازعة غليسيرألدهيد-3-فوسفات أو غيرها من الضوابط الداخلية المحتملة لأنه تبين لها أن تكون الأنواع RNA الأكثر استقرارا من خطوط الخلايا lymphoblastoid . هذا يسمح لنا لحساب التغير في كفاءة التحويل من رد فعل عكس النسخ.

تنبيغ shRNAs فيروسات

لبناء ناقلات الارتجاعي معربا عن shRNAs، [أليغنوكليوتيد ترميز الجذعية حلقة shRNAs لFMR1 تم ligated (المواد التكميلية، جدول S8) والسيطرة السلبية في BamHI وEcoRI موقع pSIREN-RetroQ (BD Clontech، ماونتن فيو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). و transfected الخلايا PT67 (BD Clontech) لإنتاج الفيروس الارتجاعي. ما مجموعه 6 × 10 6 وكانت المصنفة الخلايا SH-SY5Y في T-75 قارورة في 20 مل من متوسطة جديدة من DMEM (إينفيتروجن) مع 10٪ FBS. بعد 1 يوم، أصيب الخلايا SH-SY5Y مع الفيروسات في وجود 5 ميكروغرام / مل من polybrene. بعد 2 أيام، تم علاج الخلايا SH-SY5Y مع 10 ميكروغرام / مل من بوروميسين (سيغما، سانت لويس، MO، الولايات المتحدة الأمريكية). وقد تم جمع الخلايا التي نجت بعد 4 أسابيع، وكان يستخدم هذه الفئة من السكان من الخلايا لمزيد من التجارب. تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا باستخدام أدوات RNeasy البسيطة مع العلاج الدناز (QIAGEN) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قارنا الخلايا SH-SY5Y معربا عن FMR1 shRNA = 4) والخلايا SH-SY5Y معربا عن shRNAs للسيطرة سلبية = 4) لدراسة تأثير تخفيض FMR1 على التعبير عن JAKMIP1 وGPR155.

ترنسفكأيشن من CYFIP1

الإنسان CYFIP1 الترميز المنطقة (الأحماض الأمينية 1-1254) التي حصلت عليها PCR باستخدام IMAGE استنساخ 10625411 (آي تي سي سي، ماناساس، VA، الولايات المتحدة الأمريكية) وsubcloned في EcoRV وليس المواقع الأول من ناقلات البلازميد بيريس-neo3 (BD Clontech). وأكد تسلسل للبناء من تسلسل الحمض النووي الآلي.
ما مجموعه 6 × 10 6 وكانت المصنفة الخلايا SH-SY5Y في T-75 قارورة في 20 مل من متوسطة جديدة من DMEM (إينفيتروجن) مع 10٪ FBS. بعد 1 يوم، و transfected الخلايا SH-SY5Y مع 120 ميكرولتر من lipofectamine 2000 (إينفيتروجن) المخفف مع 3 مل من OptiMEM (إينفيتروجن) و 24 ميكروغرام من البلازميد (بيريس-CYFIP1 أو بيريس) المخفف مع 3 مل من OptiMEM (إينفيتروجن). بعد 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وكانوا جنبا إلى جنب والمحتضنة لمدة 20 دقيقة. وأضاف خليط التفاعل مع 16 مل من DMEM مع 10٪ FBS. تم استبدال مستنبت الخلية عن طريق هذا الحل. بعد 2 أيام، تم علاج الخلايا SH-SY5Y مع 500 ميكروغرام / مل من G418 (إينفيتروجن). وقد تم جمع الخلايا التي نجت بعد 3 أسابيع، وكان يستخدم هذه الفئة من السكان من الخلايا لمزيد من التجارب. تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا باستخدام أدوات RNeasy البسيطة مع العلاج الدناز (QIAGEN) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قارنا الخلايا SH-SY5Y ستابلي مع ناقلات التعبير عن CYFIP1 = 7) والخلايا SH-SY5Y مع transfected متجه التعبير فارغة = 8) لدراسة تأثير تحريض CYFIP1 على التعبير عن JAKMIP1 وGPR155 . تم استخراج البروتين أيضا باستخدام Cellytic M (سيغما) مع مثبطات بروتين (سيغما) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

الحيوانات وجمع الأنسجة

WT وFmr1 أثيرت KO الفئران في منشأة الحيوان جامعة إيموري ومعالجتها وفقا للInstitue الوطني للوائح الصحية وتحت موافقة لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة إيموري. WT وFmr1 أنتجت KO تتزاحم عن طريق تربية الإناث متخالف مع FMR1 الذكور KO في خلفية مسانج من C57BL / 6. وأكد التركيب الوراثي من كل حيوان عن طريق PCR. لجمع الأنسجة، تم تشريح القشور وتم عزل بروتين باستخدام Cellytic M (سيغما) مع مثبطات بروتين (سيغما) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

تحليل طخة مناعية

البروتينات المستخرجة من الخلايا SH-SY5Y أو القشور من Fmr1 تعرضوا WT والفئران KO إلى SDS-PAGE باستخدام NuPAGE NOVEX 4-20٪ مكرر تريس جل واجتماعات الأطراف العازلة (إينفيتروجن) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد الكهربائي، تم electroblotted المواد الهلامية على الأغشية PVDF (ميليبور، بيدفورد، MA، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد electroblotting، سدت الأغشية في SuperBlock عازلة تمنع (بيرس التكنولوجيا الحيوية، روكفورد، IL، الولايات المتحدة الأمريكية). جرى التحقيق الأغشية في عرقلة الحل في 4 درجات مئوية خلال الليل مع الأجسام المضادة التالية: FMRP (Chemicon، تيميكولا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية)، CYFIP1 (ريف، تيميكولا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية)، JAKMIP1 (41) أو GAPDH. وجرفت المياه الأغشية 3 × في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.05٪ توين 20 (PBS-T) وحضنت مع الأجسام المضادة الثانوية الفجل البيروكسيداز مترافق المناسب في عرقلة الحل لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. الأغشية تم غسلها مرة أخرى 3 × في برنامج تلفزيوني-T وتطورت مع SuperSignal الغربية بيكو Chemiluminescent (بيرس التكنولوجيا الحيوية). تم تجريد الأغشية التي كتبها استعادة البقعة الغربية تجريد العازلة (بيرس التكنولوجيا الحيوية) وتستخدم لأجسام مختلفة.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس