عرض مشاركة واحدة
  #27  
قديم 10-19-2015, 11:33 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي على البروتين Angelman متلازمة المصاحب، E6-AP، هو Coactivator لالنووية مستقبلات هرمون الفصيلة

 

http://mcb.asm.org/content/19/2/1182.full

https://translate.googleusercontent....kczMpmXk0rsc9g



+ الكاتب الانتماءات
  • قسم بيولوجيا الخلية و1
  • قسم الجزيئية وعلم الوراثة البشرية، 2 كلية بايلور للطب في هيوستون، تكساس 77030
الملخص

في هذه الدراسة، وجدنا أن البروتين E6 المصاحب (E6-AP / UBE3A) يتفاعل مباشرة مع وcoactivates النشاط النسخي من مستقبلات هرمون البروجسترون البشري (PR) بطريقة تعتمد على هرمون. كما coactivates E6-AP أنشطة النسخي التي تعتمد على هرمون أعضاء آخرين من هرمون النووي مستقبلات الفصيلة. سابقا، فقد تبين أن E6-AP يقدم دور يغاز بتحول والبروتين (E3) في وجود البروتين E6 من أنواع فيروس الورم الحليمي البشري 16 و 18. البيانات المتوفرة لدينا تدل على أن وظيفة يغاز بتحول والبروتين من E6-AP هو الاستغناء عنها لقدرته على coactivate مستقبلات هرمون النووية، وتبين أن E6-AP تمتلك اثنين من وظائف مستقلة للانفصال، على حد سواء coactivator ويغاز بتحول والبروتين. ويرتبط اختلال نسخة الأمهات من E6-AP مع متلازمة أنجلمان (AS)، وهو اضطراب عصبي وراثي يتميز التخلف العقلي الشديد، والمضبوطات، وضعف التعبير، وأعراض أخرى. ومع ذلك، فإن الآلية الدقيقة التي يسبب خلل E6-AP الجينات AS لا تزال مجهولة. لربط وظيفة coactivator وبتحول البروتين E6-AP ظائف يغاز مع AS النمط الظاهري، عبرنا عن أشكال متحولة من E6-AP معزولة عن AS المرضى وتقييم قدرة كل من هذه البروتينات متحولة إلى coactivate PR أو تقديم بتحول البروتين يغاز النشاط. وكشف هذا التحليل أنه في الغالبية العظمى من المرضى AS فحصها، وكانت وظيفة يغاز بتحول والبروتين من E6-AP المعيبة في حين كانت وظيفة coactivator سليمة. وتشير هذه النتيجة إلى أن نتائج النمط الظاهري AS من وجود خلل في بتحول-proteosome تدهور البروتين الطريق.

المنشطات، وهرمونات الغدة الدرقية، وفيتامين D، والرتينوئيدات تنظيم العمليات الحيوية المختلفة بما في ذلك النمو، والتنمية، والتوازن من خلال لهم وما شابه ذلك مستقبلات هرمون النووي، التي تشكل الفصيلة من المواد المرتبطة هيكليا العوامل الخلايا تنشيط يجند النسخ (18، 34، 40، 47 ). مستقبلات هرمون النووية تحتوي على زخارف الهيكلية المشتركة التي تشمل الأميني محطة وظيفة التنشيط سيئة الحفظ (عامل تنشيط 1 [AF-1]) الذي يؤثر على كفاءة النسخ، مجال الحمض النووي ملزم المركزي، التي تتوسط مستقبلات ملزمة لتسلسل محددة محسن DNA ويحدد استهداف خصوصية الجينات، وملزم هرمون المجال كربوكسي المحطة. ويتضمن المجال الأخير AF-2، وهي المنطقة التي تتوسط وظيفة التنشيط تعتمد على هرمون مستقبلات (40). وعندما يرتبط هرمون، هذه المستقبلات الخضوع لتغيير متعلق بتكوين، التفكك من بروتينات الصدمة الحرارية، مستقبلات dimerization، الفسفرة، DNA ملزمة في عنصر محسن من الجينات المستهدفة، والتفاعل مع coactivators، والتجنيد لاحق من عوامل النسخ القاعدية لتشكيل التمهيد للبدء مستقر مجمع. يتم اتباع هذه الأحداث سواء صعودا التنظيم أو أسفل تنظيم النسخ الجيني الهدف (40).
هرمون النووي coactivators مستقبلات تمثل فئة متزايدة من البروتينات التي تتفاعل مع مستقبلات بطريقة يجند محددة، وتعمل على تعزيز أنشطة النسخي الخاصة بهم (33). قبل التعرف عليهم، وتوقع coactivators في الوجود على أساس التجارب التي أظهرت أن مستقبلات مختلفة تتنافس على بركة الحد من العوامل المطلوبة لنسخ الأمثل. أدى تحفيز مستقبلات احدة في transrepression من مستقبلات أخرى، مما يدل على استنزاف بركة coactivator المشترك (6، 10، 31، 39). بين coactivators المستنسخة حتى الآن هي الستيرويد مستقبلات coactivator 1 (SRC-1) (33)، TIF2 (GRIP1) (17، 51)، ص / CIP (ACTR / RAC3 / AIB1 / الترام-1) (2، 28 ، 46، 48)، وARA70 (54). وتصور Coactivators أصلا لخدمة دورا سد، وربط مستقبل لآلية النسخ القاعدية (36، 45). في الآونة الأخيرة، واتضح أنها تمتلك أنشطة الأنزيمية التي تسهم في قدرتها على تعزيز بوساطة مستقبلات النسخ؛ SRC-1، P300 / الجمارك وحماية الحدود، وRAC3 / ACTR / AIB1 تمتلك النشاط هيستون أسيتيل (HAT) (2، 28، 32، 41). ويعتقد أن مستقبلات تنشيط يجند لتحقيق هذه التي تحتوي على النشاط coactivators HAT إلى لونين المحيطة مستقبلات، وتعطيل هيكل لونين القمعي المحلي acetylating الهستونات والعوامل المرتبطة لونين ربما غيرها (41). بسبب قدرتها على تعزيز بوساطة مستقبلات التعبير الجيني، ويعتقد coactivators أن تلعب دورا هاما في تنظيم حجم الاستجابة البيولوجية إلى المنشطات، وفيتامين D، والرتينوئيدات في الأنسجة أو الأفراد المختلفين. مستوى coactivator التعبير يمكن أن تسهم في الاختلافات في الاستجابة هرمون ينظر في عدد السكان، واضطراب في coactivator التعبير يمكن أن يؤدي إلى فرط المرضية أو نقص التحسس للهرمونات الستيرويد. مؤخرا، تبين أن أدى خلل في موضع SRC-1 في الفئران في رد الموهنة للهرمونات الستيرويد، وهي نتيجة تتفق مع هذه الفرضية (53).
في هذا التقرير، وصفنا الاستنساخ وتوصيف البروتين E6 المصاحب (E6-AP) (21)، وهو بروتين يرتبط متلازمة أنجلمان (AS) (26، 30، 42)، ومستقبلات هرمون البروجسترون (PR) -interacting البروتين. وE6-AP التي سبق تحديدها باعتبارها بروتين 100 كيلو دالتون والحاضر في كل من السيتوبلازم والنواة (14). E6-AP تتوسط تفاعل من نوع الورم الحليمي البشري 16 و 18 E6 البروتينات مع البروتين p53، وهو بروتين النمو القمعية وورم القمعية (14، 22). واقترح الأولية في الدراسات المختبرية أن المجمع E6-E6-AP يتفاعل على وجه التحديد مع البروتين p53 ويعزز تدهور البروتين p53 عبر بتحول-proteasome وتدهور المسار، ولكن مؤخرا الدراسات المجراة تبين أن E6-AP يمكن أن تتفاعل مباشرة مع البروتين p53 وتعزيز تدهورها حتى في حالة عدم وجود فيروس الورم الحليمي E6 البروتين (11، 20، 38). E6-AP هو عضو في عائلة من البروتينات، المعروفة باسم E3 ligases بتحول والبروتين، والتي تم اقتراحها للعب دور في تحديد خصوصية الركيزة لنظام تدهور بتحول-proteasome و. ينطوي ubiquitination البروتين أيضا اثنين من فئات أخرى من الإنزيمات، وهي E1 الانزيمات تفعيل بتحول وE2 الانزيمات التصريف اليوبيكويتين، التي تنشط الأنصاف بتحول ونقلها إلى استهداف البروتينات وE3، على التوالي (19). الأحماض الأمينية 350-الكربوكسيل محطة (أأ) من E6-AP تشكل وكان الحاخام هيشت (مثلي لE6-AP كربوكسي محطة) النطاقات التي يتم حفظها من بين العديد من E3 ligases بتحول والبروتين والبروتينات ذات الصلة AP-E6 (19). يحتوي هذا الجزء 100-AA-الكربوكسيل محطة المدقع في المنطقة المحفزة للE6-AP، الذي ينقل بتحول إلى البروتين المستهدفة لتدهور (19). يتكون المجال E6 ملزم من منطقة 18-أأ تقع ضمن الجزء المركزي من البروتين E6-AP (22).
مؤخرا، تبين أن اضطراب وراثي، AS، سببه عدم وجود نسخة الأمهات وظيفية من الجينات E6-AP (26، 30، 42). وكما هو اضطراب عصبي يتميز التخلف العقلي الشديد، والمضبوطات، وضعف التعبير، وأعراض أخرى (5). ومع ذلك، فإن الآلية الدقيقة التي يسبب خلل E6-AP الجينات AS لا تزال مجهولة. لدينا تحليل متحولة البروتينات E6-AP من AS كشف المرضى أن وظيفة يغاز بتحول والبروتين من E6-AP كانت معيبة، في حين أن وظيفة coactivator سليمة، في معظم AS فحص المرضى. في هذا التقرير، وتبين لنا أيضا أن النشاط يغاز بتحول من E6-AP غير مطلوب لوظيفة coactivation من E6-AP. وعلاوة على ذلك، البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن وظيفة تحفيزية تقع ضمن المجال كان الحاخام هيشت من E6-AP ليست ضرورية لقدرة E6-AP للتفاعل مع وcoactivate الستيرويد وظيفة مستقبلات الهرمونات. وتشير هذه النتائج إلى أن E6-AP تمتلك اثنين من وظائف مستقلة، على حد سواء coactivator ويغاز بتحول والبروتين.
المواد والأساليب

بناء البلازميد. البلازميد الطعم لالخميرة نظام هجين اثنين (pAS1-PRLBD) (33)، البلازميدات التعبير الثدييات لPR-B (1)، مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) (7)، ومستقبلات الاندروجين (AR) (44 )، E2F مراسل البلازميد UAS4-TATA لوك (لوك يدل luciferase المراسل) (41)، وE2F-، Sp1-، وصحفيين، CREB استجابة (33) وقد وصفت سابقا. لبناء مستقبل جلايكورتيكود (GR) ناقلات التعبير، وهضم ناقلات pSTCGR مع بام مرحبا ثم تم استنساخ جزء بام مرحبا تحتوي على GR كدنا] في المواقع المقابلة البلازميد pCR3.1 (إينفيتروجن). شيدت pPRE / GRE.E1b.LUC وpERE.E1b.LUC عن طريق إدخال شظايا PVU II- سما الأول من pPRE / GRE.E1b.CAT وpERE.E1b.CAT في موقع سما الأول من pGL3-الأساسية (PROMEGA). لبناء البلازميدات التعبير الثدييات لمن النوع البري E6-AP (أأ 1-851)، 76 كيلو دالتون E6-AP (أأ 170-851)، وC833S (تغيير السيستين 833 إلى سيرين) متحولة E6-AP (أأ 1 إلى 851)، تم استنساخ شظايا بام مرحبا هين dIII من pGEM E6-AP (100 كيلو دالتون)، pGEM-E6-AP (76 كيلو دالتون)، وpGEM E6-AP (C833-S) في المواقع المقابلة البلازميد PBK. RSV (Stratagene). جزء-C النهائي للE6-AP (أأ 680-851)، متحولة اقتطاع E6-AP (أأ 1-449)، وكيلو دالتون 98 (أأ 1-834) شكل E6-AP، وجدت في AS ( 25، 29، 41)، وكيلو دالتون 99 (أأ 1-845)، و 86 كيلو دالتون (أأ 1-714)، 47 كيلو دالتون (أأ 450-851)، و 28 كيلو دالتون (أأ 1-240) أشكال من E6-AP تم تضخيمها من قبل PCR مع أزواج التمهيدي التالية: 5'-GCGGATCCACCATGAGGAATTCGGCACGAGATCTAAAGGAA-3 "(حبلا العلوي) و5'-CGGAATTCAAGCTTGTTTTACAGCATGCCAAATCC-3" (أقل حبلا)؛ 5'-GCGGATCCACCATGGAAGCCTGCACGAATGAGTTTTGTGCT-3 "(حبلا العلوي) و5'-CCCAAGCTTGTTTTATGTTTCTACTTTGAAAAAAGTATA-3" (أقل حبلا)؛ 5'-GCGGATCCACCATGAGGAATTCGGCACGAGATCTAAAGGAA-3 "(حبلا العلوي) و5'-CCCAAGCTTGTTTTAAAGTTTTTCTTTGCTTGAGTATTC-3" (أقل حبلا)؛ 5'-GCGGATCCACCATGAGGAATTCGGCACGAGATCTAAAGGAA-3 "(حبلا العلوي) و5'-CCCAAGCTTGTTTTAGGCATACGTGATGGCCTTCAACAA-3" (أقل حبلا)؛ 5'-GCGGATCCACCATGAGGAATTCGGCACGAGATCTAAAGGAA-3 "(حبلا العلوي) و5'-CCCAAGCTTGTTTTACATATGAAAACCTCTCCGAAAAGC (أقل حبلا)؛ 5'-GCGGATCCACCATGTACAGTGAACGAAGAATCACTGTT-3 "(حبلا العلوي) و5'-CGGAATTCGCGGCCGCGTTTTACAGCATGCCAAATCC-3" (أقل حبلا)؛ و5'-GCGGATCCACCATGGAAGCCTGCACGAATGAGTTTTGTGCT-3 "(حبلا العلوي) و5'-GAATTCAAGCTTGTTTTACAAATATACAAGTGCATTGAG-3" (أقل حبلا). تم استيعاب المنتج PCR مع بام مرحبا هين dIII واستنسخ في مواقع المقابلة البلازميد pBK.RSV. ثم بام مرحبا غير I كان subcloned شظايا البلازميد pBK.RSV-E6-AP في مواقع المقابلة البلازميد pCR3.1 (إينفيتروجن). لبناء I804K وF782Δ أشكال متحولة من E6-AP، استخدمنا الطفرات موقع الموجه لخلق طفرات في pCR3.1 E6-AP. لإعادة الطفرة 1-885Δstop 104 كيلو دالتون في E6-AP، تم تضخيم جزء بسه AI- هين dIII من E6-AP بواسطة PCR مع الاشعال 5'-GTTGAAGGCCATCACGTATGCCAAAGG-3 "(أقل حبلا) و5'-GAATTCAAGCTTGTTTTAGTACTGGGACACTATCACCACCA- 3 '(أقل حبلا)، وذلك باستخدام الحمض النووي AS المريض كنموذج. ثم تم استنساخ هذه القطعة بسه AI- هين dIII في مواقع المقابلة من pGEM E6-AP. لإعادة هذه الطفرة في التعبير البلازميد الثدييات، تم استنساخ جزء بام مرحبا هين dIII من E6-AP في مواقع المقابلة البلازميد pBK.RSV. وsubcloned على Bam مرحبا غير أنني جزء من pBK.RSV-E6-AP في بام مرحبا غير المواقع الأول من pCR3.1. لإعادة تشكيل كامل طول E6-AP الجين في الخميرة البلازميد هجين اثنين، هين dIII هضم (وشغل) pGEM E6-AP (100 كيلو دالتون) وredigested مع بام مرحبا. تم إدراج الناتجة بام مرحبا هين dIII (شغل) جزء في بام مرحبا ايكو RI (شغل) مواقع pGAD10 (Clontech). لإعادة تشكيل PR-A الجين في pAS1 الخميرة البلازميد، كان ligated وضابط صف I- سال أنا جزء من PR-A في المواقع المقابلة للناقلات. لدمج E6-AP مع المجال تفعيل VP16 ومجال GAL DNA ملزم (DBD) (بقايا 1-147)، وsubcloned جزء بام مرحبا هين dIII من كامل طول E6-AP وعدة شظايا حذف E6-AP في إطار في البلازميدات pABVP16 وpABGAL (3، 4). لدمج E6-AP مع الجلوتاثيون S -transferase (GST)، وبام مرحبا غير شظايا الأول من كامل طول E6-AP ومختلف أشكال متحولة من E6-AP تم subcloned في الإطار مع GST إلى pGEX4T البلازميد (فارماسيا).

في المقايسات التفاعل الجسم الحي. وأجريت الخميرة اثنين الهجين والثدييات المقايسات التفاعل يومين الهجينة كما هو موضح سابقا (12، 41).

في المختبر فحص التفاعل. وبالنسبة للفي المختبر التفاعل الفحص، وأعرب عن PR-B كما بروتين صاحب الموسومة في نظام التعبير الفيروسة العصوية في وجود أو عدم وجود البروجسترون وتنقيتها باستخدام عمود النيكل تقارب (فارماسيا). وأعرب E6-AP-الموسومة GST في القولونية وتنقيته على حبات الجلوتاثيون سيفاروز. وقد حضنت النقي ومحددة الجلوتاثيون E6-AP مع PR النقاء في NETN العازلة (50 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 20 ملي تريس [الرقم الهيدروجيني 8.0]، 0.5٪ Nonidet P-40) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، وبعد ذلك تم غسلها حبات خمس مرات مع العازلة NETN. ومزال PR متجهة الى E6-AP وفصلها على دوديسيل كبريتات الصوديوم 7.5٪ بولي أكريلاميد هلام ومن ثم تحليلها من قبل الغرب النشاف باستخدام الأجسام المضادة التي تعترف تحديدا PR.

Transfections. واستمرت خلايا هيلا في Dulbecco التعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني. قبل ترنسفكأيشن أربع وعشرين ساعة، ومطلي 3 × 10 5 خلايا لكل بئر في فالكون أطباق ستة جيدا في DMEM تحتوي على 5٪ المغلفة ديكستران جردت الفحم المصل. و transfected الخلايا مع السلطات الوطنية المعينة المشار إليها باستخدام Superfect كاشف (QIAGEN) أو Lipofectamine (GIBCO BRL) وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة. تم غسلها الخلايا، التي تتغذى على DMEM تحتوي على 5٪ مصل تجريد، وتعامل مع هرمونات مختلفة، وتحصد بعد 24 ساعة. ويعاير مقتطفات خلية لluciferase النشاط، وذلك باستخدام نظام luciferase الفحص PROMEGA، وصححت قيم إما تركيز البروتين أو النشاط β غالاكتوزيداز. وتعرض البيانات كوسيلة لقيم ثلاث نسخ حصل عليها من التجارب التمثيلية.

اليوبيكويتين البروتين النشاط يغاز. لدراسة النشاط يغاز بتحول والبروتين من النوع البري E6-AP ومختلف أشكال متحولة من E6-AP، من النوع البري E6-AP ومختلف أشكال متحولة من E6-AP (الجدول 1 وأعرب عن) وتنقيته من E. القولونية كما GST البروتينات الانصهار. تم قياس الأنشطة بتحول البروتين يغاز من هذه البروتينات باستخدام HHR23A كما بروتين الهدف كما هو موضح سابقا (27، 49).

الجدول 1.
Coactivation وبتحول البروتين الأنشطة يغاز من النوع البري وأشكال متحولة من E6-AP ل

النتائج

عزل وتوصيف E6-AP باعتباره البروتين التفاعل PR. لتحديد البروتينات الرواية التي تعدل بشكل انتقائي وظائف transactivation أعضاء مستقبلات الفصيلة النووية، ونحن فحص مكتبة هيلا كدنا] باستخدام المجال ملزم يجند العلاقات العامة كطعم في الخميرة اثنين الهجين الفحص الفحص. نحن عزل 13 المستعمرات التي تفاعلت بقوة مع هذا مجال العلاقات العامة. وتضمنت هذه المستعمرات cDNAs مع تسلسل متطابقة. وكشف البحث تشابه تسلسل في قاعدة بيانات بنك الجينات أن جميع المستعمرات المشفرة للكربوكسي محطة أأ 680-851 من E6-AP (انظر الشكل 2 A).
يتفاعل كامل طول E6-AP مع النموذج liganded العلاقات العامة سواء في المجراة في المختبر. كما هو مبين في الشكل. 1 A، في الخميرة اثنين الهجين الفحص، يتفاعل E6-AP مع PR بطريقة تعتمد على هرمون البروجسترون. في غياب يجند أو في وجود RU486 مركب مضاد الهرمون، لاحظنا لا قدر كبير من التفاعل النسبي إلى السيطرة بين E6-AP والعلاقات العامة. لتوثيق أيضا أن التفاعل تعتمد على هرمون البروجسترون لوحظ في الخميرة هو فحص هجين اثنين يرجع إلى جمعية المادية المباشرة لE6-AP والعلاقات العامة، ونحن تنقيته الفيروسة العصوية-أعرب صاحب الموسومة PR على عمود النيكل تقارب ثم حضنت مع GST-E6-AP التي تم تنقيتها، وبعد ذلك ملزمة لحبات الجلوتاثيون سيفاروز في غياب أو وجود هرمون البروجسترون. كما تحكم، وقد حضنت GST تنقيته مع PR. بعد غسل واسعة النطاق، تم تحليل PR متجهة الى E6-AP التي كتبها immunoblotting باستخدام الأجسام المضادة PR-محددة (الشكل 1 B). ولوحظ وجود قدر كبير من التفاعل E6-AP مع PR في وجود هرمون البروجسترون ولكن ليس في غيابها.

تين. 1.
(A) تفاعل مع PR-النوع البري E6-AP في الخميرة فحص هجين اثنين. وتنصهر تسلسل الترميز كامل PR-A في الإطار مع الخميرة GAL4 DBD، وGAL الناتجة DBD-PR-A بناء وcoexpressed إما مكافحة ناقلات الأمراض أو GAL4-AD-E6-AP بناء (GAL4 مجال تفعيل تنصهر في الإطار مع من النوع البري E6-AP) جنبا إلى جنب مع البلازميد مراسل في سلالة الخميرة BJ2186. وقد نشر في transformants، وتم تحديد الأنشطة β غالاكتوزيداز من ثلاث مستعمرات مستقلة. تم علاج خلايا الخميرة مع أي مركبة وحدها (-H)، 10 -6 M البروجسترون (+ P)، أو 10 -6 M RU486 (+ RU). يصور كل شريط بمعدل ثلاثة فحوصات. (B) في تفاعل المختبر من E6-AP مع PR. أعرب الفيروسة العصوية-تنقيته وحضنت PR مع تنقيته GST-E6-AP البروتين الانصهار أو مع GST وحدها (مراقبة) منضمة إلى الخرز الجلوتاثيون سيفاروز إما في غياب أو في وجود 10 -6 M البروجسترون. تم تحليل PR متجهة الى E6-AP التي كتبها دوديسيل الصوديوم وكبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام على هلام 7.5٪ يليه تحليل لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة التي تعترف تحديدا PR.

مناطق E6-AP المطلوبة للتفاعل مع PR منذ E6-AP يتفاعل مع PR بطريقة تعتمد على هرمون، حددنا بجوار مناطق E6-AP هامة للتفاعل مع PR. لهذا الغرض، استخدمنا في الجسم الحي الثدييات يومين الهجين نظام التفاعل فحص (41). في هذا الاختبار، وتنصهر كامل طول E6-AP ومختلف شظايا حذف E6-AP إلى المجال تفعيل VP16 (الشكل 2 A)، وقدرة كل من البروتينات الهجين VP16-E6-AP للتفاعل مع PR وقد تقرر في غياب أو وجود هرمون البروجسترون. كما هو مبين في الشكل. 2 B، من النوع البري E6-AP، شظايا الحذف N-محطة (أأ 170-851 و680-851)، وشظايا الحذف C-محطة (أأ 1-714 و1-449) من E6- كانت AP قادرة على التفاعل مع PR، في حين أن ناقلات تحكم تفتقر E6-AP كدنا] وN-المحطة جزء (أأ 1-240) من E6-AP لم تتفاعل، مما يشير إلى أن اثنين على الأقل من مواقع التفاعل PR تقع ضمن E6 -AP البروتين. يقع موقع واحد داخل جزء-C محطة (أأ 680-851؛ 21 كيلو دالتون) من E6-AP، جزء معزول أصلا في الخميرة شاشة يومين الهجينة. يقع ثاني موقع التفاعل PR داخل أأ 240-449 ويتداخل الموقع E6 ملزم. كل من هذه المناطق من E6-AP يتفاعل مع كل من تفعيل عامل النسخي 1 وعامل تفعيل النسخي 2 من العلاقات العامة.

تين. 2.
(A) تمثيل تخطيطي للE6-AP تظهر مواقف من المنطقة الحفازة (مربع الصلبة)، وكان الحاخام هيشت مجال، مجال transactivation، والمجالات PR-ملزمة. من النوع البري E6-AP هو 100 كيلو دالتون (أأ 1-851) البروتين. 76 كيلو دالتون (أأ 170-851) و 47 كيلو دالتون (أأ 450-851) تمثل E6-AP مع الحذف في N محطة. 21 كيلو دالتون (أأ 680-851) شكل يمثل محطة الكربوكسيل من E6-AP المحددة في الخميرة شاشة يومين الهجينة. 99 كيلو دالتون (أأ 1-845)، و 98 كيلو دالتون (أأ 1-834)، و 86 كيلو دالتون (أأ 1-714)، 53 كيلو دالتون (أأ 1-449)، و 28 كيلو دالتون (أأ 1-240) تمثل E6-AP C طفرات الحذف -terminal. C833S يمثل النموذج متحولة من E6-AP السيستين 833 إلى سيرين. يتم تمثيل المسوخ المرض AS 98 كيلو دالتون (حذف 17 أأ من محطة C) و 53 كيلو دالتون (C-عضال اقتطاع E6-AP) (أأ 1-449)؛ شكل I804K من E6-AP يحتوي يسين في موقف 804 بدلا من آيسولوسين، F782Δ يحتوي على حذف الفينيل ألانين في موقف 782، و104 كيلو دالتون 1-885Δstop شكل E6-AP هو متحولة readthrough. (B) توطين موقع التفاعل PR في E6-AP. لتحديد موقع PR التفاعل على E6-AP، كامل طول E6-AP ومختلف شظايا حذف E6-AP هو مبين في لوحة وكانت تنصهر في إطار مع تفعيل مجال VP16، وقدرة E6-AP للتفاعل مع PR وقد تقرر في الثدييات فحص اثنين من الهجين. تم cotransfected خلايا هيلا مع 0.3 ميكروغرام من PR التعبير البلازميد و 0.3 ميكروغرام من pPRE / GRE.E1b.LUC في غياب (السيطرة) أو وجود التعبير البلازميد pABVP16-E6-AP (0.9 ميكروغرام) (أأ 1-851 [wild- نوع]، 170-851، أأ 680-851، 1-714، أأ 1-449، وأأ 1-240). تم علاج الخلايا مع أي سيارة فقط (□) أو 10 -7 M البروجسترون (■). وتعرض البيانات وحدات الخفيفة النسبية في ميكروجرام من البروتين، ويصور كل شريط متوسط ​​لا يقل عن ثلاثة آبار.

E6-AP باعتباره coactivator لالنووية مستقبلات هرمون الفصيلة. وللتحقق ما إذا كان E6-AP قد تلعب دورا في تنشيط تعتمد على مستقبلات في التعبير الجيني الهدف، أجرينا فحوصات cotransfection عابرة للخلايا هيلا. و transfected خلايا هيلا مع ناقلات التعبير عن العلاقات العامة والبلازميد مراسل تحتوي على عنصر استجابة البروجستيرون مع أو بدون ناقلات التعبير عن E6-AP. في غياب يجند، كان PR تأثير ضئيل على التعبير مراسل الجين إما في غياب أو في وجود E6-AP (الشكل 3 A). إضافة هرمون حققت زيادة بنسبة 8 أضعاف في نشاط العلاقات العامة في غياب E6-AP. عندما coexpressed E6-AP مع العلاقات العامة، وحفز نشاط العلاقات العامة مزيدا من ~5 أضعاف، أي ما مجموعه 40 أضعاف خلال المستوى القاعدي. في المقابل، كان coexpression من E6-AP مع PR أي تأثير كبير على نسخ من الجين مراسل عندما مستقبلات كانت متجهة إلى RU486 مركب مضاد الهرمون (الشكل 3 A). هذه البيانات متسقة مع البيانات المنشورة سابقا والتي تشير إلى أن RU486 يؤدي الى تغيير متعلق بتكوين متميز في جزيء مستقبلات التي قللت تقارب لcoactivators (1، 33، 50، 52). منذ يتم اشتقاق الخلايا (ط) هيلا من نوع الورم الحليمي 18 إيجابي عنق الرحم المريض سرطان، وبالتالي التعبير عن بروتين E6 و (ب) تم استنساخ E6-AP أصلا باعتبارها بروتين E6-التفاعل، كان من الضروري استبعاد احتمال أن البروتين E6 يؤثر على وظيفة coactivation من E6-AP. كان E6-AP قادرة على تحفيز النشاط النسخي التي تعتمد على هرمون مستقبلات هرمون الستيرويد في HepG2 E6 سلبية وSK-N-SH خطوط الخلايا (لا تظهر البيانات)، مما يدل على أن coactivation لوحظ في خلايا هيلا لا تعتمد على البروتين E6.

تين. 3.
(A) E6-AP coactivates النشاط النسخي من PR-B. و transfected خلايا هيلا عابر مع 0.2 ميكروغرام من طاعون المجترات الصغيرة-B التعبير البلازميد و1 ميكروغرام من pPRE / GRE.E1b.LUC في غياب أو وجود E6-AP التعبير البلازميد pBK.RSV-E6-AP (0.250 ميكروغرام). تم علاج الخلايا مع أي سيارة فقط (-H)، 10 -7 M البروجسترون (+ P)، أو 10 -7 M RU486 (+ RU). يصور كل شريط متوسط ​​لا يقل عن ثلاثة آبار. وحدد النشاط في وجود هرمون وفي غياب coactivator خارجي إلى 100٪، وتم تحجيمها بيانات الأشرطة الأخرى وفقا لذلك. (B) E6-AP coactivates النشاط النسخي التي تعتمد على هرمون مستقبلات هرمون النووية. و transfected خلايا هيلا مع البلازميدات مستقبلات التعبير عن العلاقات العامة، ER، AR، وGR والخاصة وما شابه ذلك البلازميدات مراسل هرمون استجابة في غياب وجود E6-AP (0.250 ميكروغرام). تم علاج الخلايا مع الهرمونات المناسبة على النحو التالي: PR والبروجسترون (10 -7 M)؛ ER، استراديول (10 -9 M)؛ AR، R1881 (2.5 × 10 -10 M)؛ وGR، ديكساميثازون (10 -7 M). مدى coactivation التي كتبها E6-AP على الأنشطة التي تعتمد على هرمون النسخي من مختلف مستقبلات يتراوح من أربعة إلى ثمانية أضعاف. مستوى coactivation التي كتبها E6-AP يعتمد على كل نوع من الخلايا وعدد مرور الخلية (لا تظهر البيانات). يصور كل شريط متوسط ​​لا يقل عن ثلاثة آبار. وحدد النشاط في وجود هرمون وفي غياب coactivator خارجي إلى 100٪، وتم تحجيمها بيانات الأشرطة الأخرى وفقا لذلك. (C) تأثير E6-AP التعبير عن الأنشطة النسخي من عوامل النسخ المتنوعة. و transfected خلايا هيلا مع البلازميد التعبير E2F (0.05 ميكروغرام) جنبا إلى جنب مع 2.5 ميكروغرام من مراسل البلازميد E2F المراعية أو SP1 استجابة. لاختبار تأثير E6-AP على النشاط النسخي من عامل النسخ CREB، LMTK - و transfected الخلايا مع مراسل البلازميد-CREB استجابة (2.5 ميكروغرام) في غياب أو وجود E6-AP (0.25 ميكروغرام). تم تفعيل عامل CREB النسخ عن طريق علاج الخلايا مع 10 ميكرومتر forskolin (FSK). يصور كل شريط متوسط ​​لا يقل عن ثلاثة آبار.

وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن E6-AP يحفز النشاط النسخي التي تعتمد على هرمون العلاقات العامة من خلال العمل باعتباره coactivator. لتحديد ما إذا كان ظائف E6-AP باعتباره coactivator لأعضاء مستقبلات الفصيلة النووية، درسنا تأثير E6-AP التعبير عن أنشطة النسخي التي تعتمد على يجند من مختلف مستقبلات هرمون النووي وعلى عدة عوامل النسخ الأخرى (الشكل 3 B وC). E6-AP تعزز إلى حد كبير على النشاط النسخي التي تعتمد على هرمون PR، ER، AR، ومستقبلات جلايكورتيكود (GR). كما أنه يعزز النشاط النسخي من حمض الريتينويك (مستقبلات ألفا وهرمون الغدة الدرقية مستقبلات (لا تظهر البيانات). كان E6-AP الحد الأدنى أو لم يكن لها تأثير على النشاط النسخي من E2F وCREB. Coexpression من E6-AP سوى تأثير معتدل على وظيفة تفعيل SP1 (الشكل 3 C). وتشير هذه البيانات إلى أن E6-AP coactivates تفضيلي النشاط النسخي التي تعتمد على هرمون مستقبلات هرمون النووية ولكنها ليست محددة لهم فريد كما هو الحال بالنسبة لcoactivators أخرى مثل SRC-1 (33).

E6-AP يخفف إسكات بين ER والعلاقات العامة. ولقد ثبت أن ER وحصة PR بعض coactivators منذ محددة هرمون ER يمكن عزل حمامات محدودة من coactivators من العلاقات العامة، وهي ظاهرة تعرف باسم إسكات (10، 31، 39). درسنا ما إذا كان coexpression من E6-AP قادرا على عكس هذه الظاهرة إسكات. تم تخفيض النشاط النسخي التي يسببها هرمون بوساطة PR بنسبة 91٪ عند coexpression من منضم استراديول ER (الشكل 4 A؛ مقارنة الممرات 2 و 3). إضافة E6-AP عكس هذا إسكات من قبل بقدر 9.6 أضعاف (الشكل 4 A؛ مقارنة الممرات 3 و 6) بطريقة تعتمد على الجرعة. على أعلى تركيز E6-AP المستخدمة في هذا الاتجاه المعاكس إسكات التجربة، تم تعزيز النشاط PR فقط 2.6 أضعاف (مقارنة الممرات 2 و 7). ومع ذلك، التحكم في الخلايا التي لا تعبر عن ER، وتعزيز E6-AP النشاط النسخي العلاقات العامة من أربعة إلى خمسة أضعاف (مقارنة الممرات 2 و 8). وتشير هذه البيانات إلى أن E6-AP هو العامل المحدد وهو أمر ضروري لPR كفاءة وER transactivation. وcoactivation أضعاف بحلول E6-AP أقل في هذه التجربة من في هو موضح في الشكل 3 B، بسبب الاختلافات في الظروف التجريبية. في الشكل 4 A (حارة 7)، لوحظ تأثير coactivation من E6-AP على النشاط النسخي العلاقات العامة في وجود ER التعبير البلازميد، بينما في الشكل 3 B، وtransfected فقط مستقبلات احد. وكما كان متوقعا، لم يلاحظ أي إسكات عكسي كبير (الشكل 4 باء؛ مقارنة الممرات 3 و 6) مع جزء C-محطة من E6-AP (أأ 680-851) (الشكل 2 A)، والتي تتفاعل بشكل ضعيف مع ER ( لا تظهر البيانات) وليس لديها وظيفة التنشيط (الشكل 5). ومع ذلك، فإن هذا جزء لا تمتلك النشاط السلبي السائد في ظل الظروف التجريبية لدينا. وأكد تحليل لطخة غربية أن جزء C-محطة من E6-AP (أأ 680-851) وكامل طول E6-AP يتم التعبير على حد سواء (لا تظهر البيانات).

تين. 4.
(A) E6-AP ولكنها ليست متحولة-C محطة تفتقر إلى مجال التنشيط عكس إسكات النسخي بين العلاقات العامة وER. و transfected خلايا هيلا مع 0.2 ميكروغرام من PR التعبير البلازميد، 0.3 ميكروغرام من ER التعبير البلازميد، 1.0 ميكروغرام من pPRE / GRE.E1b.LUC، وزيادة تركيزات (0، 0.1، 0.5، و 1.0 ميكروغرام) من النوع البري E6- AP. وبعد ذلك تعامل الخلايا مع هرمون البروجسترون (البرنامج) أو البروجسترون واستراديول (E2) معا (كل في 10 -8 M). لين 8 يمثل خلايا السيطرة التي كانت مع transfected فقط العلاقات العامة وE6-AP البلازميدات التعبير. يصور كل شريط متوسط ​​لا يقل عن ثلاثة آبار. وحدد النشاط في وجود هرمون وفي غياب coactivator خارجي إلى 100٪، وتم تحجيمها بيانات الأشرطة الأخرى وفقا لذلك. كان (B) وجزء-C النهائي للE6-AP (أأ 680-851) قادر على عكس التدخل النسخي بين العلاقات العامة وER. و transfected خلايا هيلا مع 0.2 ميكروغرام من PR التعبير البلازميد، 0.3 ميكروغرام من ER التعبير البلازميد، 1.0 ميكروغرام من pPRE / GRE.E1b.LUC، وزيادة تركيزات (0، 0.1، 0.5، و 1.0 ميكروغرام) من جزء C-المحطة من E6-AP. وبعد ذلك تعامل الخلايا مع هرمون البروجسترون (البرنامج) أو البروجسترون واستراديول (E2) معا (10 -8 M). يصور كل شريط متوسط ​​لا يقل عن ثلاثة آبار. وحدد النشاط في وجود هرمون وفي غياب coactivator خارجي إلى 100٪، وتم تحجيمها بيانات الأشرطة الأخرى وفقا لذلك.


تين. 5.
النشاط النسخي من البروتين الانصهار GAL4-E6-AP. الأشكال المشار إليها من E6-AP (الشكل 1 وتنصهر A) إلى DBD الخميرة GAL4. خلايا هيلا ثم تم مع transfected 0.5 ميكروغرام من UAS4-TATA-luciferase المراسل DNA مراسل وGAL4 DBD أو GAL4-E6-AP التعبير البلازميد (1.0 ميكروغرام). يصور كل شريط متوسط ​​لا يقل عن ثلاثة آبار. وتفعيل GAL4 DBD تحديد إلى 100٪، وتعديل نشاط كل GAL4-E6-AP البروتين الانصهار وفقا لذلك.

E6-AP يحتوي على مجال تفعيل الذاتية. لتأكد مما إذا كان E6-AP تمتلك تم تعيين وجوهري، مجال التنشيط للتحويل، من النوع البري وشظايا حذف E6-AP إلى الحمض النووي عن طريق ربطها GAL4 DBD. من النوع البري E6-AP (أأ 1-851) وN-محطة (أأ 170-851، 76 كيلو دالتون) وC-محطة (أأ 1-714، 86 كيلو دالتون) شظايا الحذف حفز النشاط النسخي من الجين مراسل مقارنة لذلك من ناقلات تحكم يحتوي فقط GAL4 DBD (الشكل 5)، في حين أن جزء 21 كيلو دالتون (أأ 680-851) لم يفعل ذلك. وتشير هذه النتيجة إلى أن E6-AP حد ذاته يحتوي على مجال تفعيل النسخي تقع بين أأ 170 و 680.

E6-AP يحتوي على اثنين، وظائف للانفصال مستقلة، coactivation والنشاط بتحول يغاز منذ E6-AP هو يغاز بتحول والبروتين، درسنا ما إذا كانت وظيفة coactivation من E6-AP تعتمد على هذه الوظيفة الأنزيمية. وقد تبين أن بقايا C833 المحفوظة في E6-AP تشكل السندات ثيو إستر مع بتحول وضرورية لنقل بتحول إلى البروتين المستهدفة لubiquitination. وقد تبين أن تحور C833 إلى A أو S للقضاء على النشاط يغاز بتحول والبروتين من E6-AP (19). في التجارب cotransfection، وهو E6-AP تحمل طفرة C-إلى-S في هذا الموقع الحرج كان لا يزال قادرا على coactivate PR (الجدول 1) وER (لا تظهر البيانات) إلى ما يقرب من نفس القدر من النوع البري E6-AP. وعلاوة على ذلك، شكل متحولة C833S من E6-AP أيضا يمكن عكس سحق النشاط النسخي التي تعتمد على هرمون PR إلى حد مماثل من النوع البري E6-AP (لا تظهر البيانات). وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن النشاط يغاز بتحول والبروتين من E6-AP غير مطلوب لوظيفة coactivation من E6-AP. لمزيد من تأكيد أن مسار بتحول-proteasome ولم يشارك في وظيفة coactivation من E6-AP، قمنا بتحليل متحولة حذف E6-AP (أأ 1-845) الذي يفتقر 6 أأ في محطة كربوكسي ولقد ثبت أن تكون معيب للنشاط بتحول البروتين يغاز (19). مثل متحولة C833S، يحتفظ هذا المسخ أيضا القدرة على coactivate النشاط تعتمد على هرمون النسخي العلاقات العامة (الجدول 1)، مما يؤكد أن النشاط يغاز بتحول والبروتين من E6-AP ليس من الضروري لE6-AP لتكون بمثابة coactivator. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن E6-AP تمتلك اثنين من المستقلين، فصل وظائف، coactivation وبتحول البروتين النشاط يغاز.

نتائج النمط الظاهري AS من العيوب في النشاط يغاز بتحول والبروتين من E6-AP. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن مجموعة فرعية من AS المرضى التعبير عن أشكال متحولة من E6-AP، بدلا من امتلاك والحذف على نطاق واسع أكثر شيوعا من المنطقة 15q11-Q13 الذي يحتوي E6-AP (26، 30، 42). لتحديد ما إذا كانت وظيفة coactivator من E6-AP ضرورية لتطوير AS النمط الظاهري، ولدت لنا عدة متحولة البروتينات E6-AP المقابلة لتلك التي وجدت في هذه AS المرضى (الجدول 1). أولا، نحن اختبار تأثير على متحولة E6-AP مع حذف الإجمالي الذي النصف-C محطة من البروتين قد تم حذفه بسبب طفرة هراء في كودون 417 (R417X). قدرة هذا البروتين AS متحولة إلى coactivate PR أقل بكثير من النوع البري E6-AP، ولكنها لا تزال تتفاعل مع PR (الشكل 2 B)، مما يدل على أن فقدان coactivation ومن المقرر أن تعطل تفعيل مجال تقع في أأ 170 إلى 680. وعلاوة على ذلك، وفقدان coactivation من قبل متحولة R417X لا يرجع إلى فقدان التعبير من البروتين الطافر، لأن هذا المسخ قادرة على التفاعل مع PR إلى نفس القدر من النوع البري E6-AP في خلايا الثدييات المستخدمة لتقييم coactivation (الشكل 2 B). كان متحولة R417X من E6-AP أيضا غير قادر على coactivate ER وAR (لا تظهر البيانات).
ثم اختبرنا شكل متحولة آخر من E6-AP الذي يحتوي على حذف صغير في المجال وكان الحاخام هيشت بسبب طفرة انزياح الإطار الذي ينتج اقتطاع 17 أأ الأخير من البروتين (أأ 1-834) واستبدال أربعة الأمينية مختلفة الأحماض من إطار القراءة الجديدة. كان هذا المسخ E6-AP قادرة على coactivate PR إلى نفس القدر من النوع البري E6-AP (الجدول 1). وبالمثل، كان متحولة الاصطناعي الذي يفتقر إلى 6 أأ على C محطة القصوى من E6-AP (أأ 1-845) قادرة على أن تكون بمثابة coactivator النشاط PR (الجدول أيضا 1). اختبرنا ثلاث طفرات أخرى لديها القدرة على coactivate PR النسخ: مغلطة طفرة I804K، الذي تم تحور آيسولوسين 804 ليسين. F782Δ، وهو الحذف الداخلي في إطار الفينيل ألانين 782؛ و1-885 Δstop، طفرة readthrough الذي ينتج في شكل يعد متحولة من E6-AP. كل ثلاثة من هذه الأشكال متحولة من E6-AP كانوا قادرين على coactivate النشاط PR، مما يدل على أن وظيفة coactivator من E6-AP لم يشارك في النمط الظاهري الجهاز العصبي المركزي من AS (الجدول 1).
لربط النشاط يغاز بتحول والبروتين من E6-AP مع AS، اختبرنا الوظائف بتحول يغاز من النوع البري وأشكال AS متحولة من E6-AP. بعض أشكال AS متحولة من E6-AP، مثل جزء تضم أأ 1-834، R417X، وF782Δ، لم يتمكن ubiquitinate بروتين (HHR23A) تورط كهدف من E6-AP بتحول البروتين النشاط يغاز في في المختبر فحص بتحول (27، 49)؛ وتشير النتائج إلى أن فقدان بتحول البروتين النشاط يغاز تساهم في AS النمط الظاهري في هؤلاء المرضى. ومع ذلك، كان 804K AS متحولة مغلطة قادرة على ubiquitinate وHHR23A البروتين المستهدف إلى حد ما مقارنة إلى أن من النوع البري E6-AP (الجدول 1).

مناقشة

مستقبلات هرمون النووية هي عوامل النسخ التي يسببها يجند. لتفعيل النسخ من الجينات المستهدفة، هذه المستقبلات الخضوع لعملية التنشيط متعددة الخطوات المعقدة (18، 34، 40، 47). هذه الخطوات، على الرغم المطلوبة لوظيفة المستقبل، ليست كافية لتحقيق أفضل وظيفة مستقبلات. في الآونة الأخيرة، فقد تبين أن البروتينات coactivator ضرورية لتنشيط الجينات الاقصى في المستقبلات (40). Coactivators تعزيز وظيفة مستقبلات التي تعمل كجسر بين مستقبلات محددة DNA وعوامل النسخ القاعدية للمجمع التمهيد للبدء أو من خلال توفير النشاط HAT الذي يعطل هيكل لونين القمعي المحلي، والمساهمة في زيادة النشاط النسخي من الجين المستهدف (2، 28 ، 36، 41، 45).
في هذا التقرير، علينا أن نبرهن على البروتين E6-AP يتفاعل فقط مع النموذج liganded العلاقات العامة، سواء في والمجراة في المختبر، وأنه coactivates النشاط النسخي من مستقبلات هرمون ملزمة. ومع ذلك، فشل E6-AP للتفاعل مع PR بحضور RU486، بما يتفق مع البيانات المتوفرة لدينا المنشورة سابقا مشيرا إلى أن coactivators لا تتفاعل بكفاءة مع المستقبلات في وجود مضاد الهرمون سواء في التجارب المختبرية والحية (1، 33، 50، 52 ). مثل coactivators المستنسخة أخرى، E6-AP يحتوي على زخارف LXXLL، والتي يعتقد أنها مهمة للتفاعل مستقبلات (15، 16). وتقع اثنين من هذه الزخارف داخل محطة الأمينية من E6-AP في حين أن ثلث يقع داخل محطة كربوكسي، التي تدعم النتائج التي توصلنا إليها أن E6-AP تمتلك مناطق التفاعل مستقبلات في كل الأمينية وتيرميني كربوكسي.
ويدعم وجود coactivators في مسار نقل الإشارة من مستقبلات هرمون النووية النتيجة أن النشاط نسخ من مستقبل واحد يمكن باحباط من قبل overexpression من مستقبلات أخرى، مشيرا إلى أن كل من مستقبلات تتنافس على العوامل المشتركة. هذه الملاحظة أدت بنا إلى تحديد ما إذا كان E6-AP هو واحد من هذه العوامل التي تحد يمكن أن تلغي هذه الظاهرة إسكات (6، 10، 31، 39). وتظهر دراستنا أن overexpression من E6-AP في خلايا الثدييات عكس تأثير إسكات من ER على PR transactivation بطريقة تعتمد على الجرعة. هذه النتائج مزيد من الدعم ملاحظة أن E6-AP هو coactivator حقيقي لمستقبلات هرمون النووية.
حتى الآن، عدة coactivators، على سبيل المثال، SRC-1 (33)، TIF2 (GRIP1) (17، 51)، وص / CIP (ACTR / RAC3 / AIB1 / الترام-1) (2، 28، 46، 48 )، وقد المستنسخة. هذه coactivators تحتوي على مجالات تنشيط الجوهرية وتعزز transactivation من هرمون النووي مستقبلات الفصيلة. معظم coactivators يحمل أي خصوصية مستقبلات وقادرون على coactivate مجموعة واسعة من مستقبلات هرمون النووية (33). مثل هذه coactivators أخرى، E6-AP ديه مجال تفعيل جوهري وcoactivates جميع مستقبلات هرمون النووي اختبارها.
E6-AP يمثل فئة فريدة من coactivators لأنه يسلك بتحول البروتين النشاط يغاز. ومع ذلك، فإن هذا النشاط يغاز بتحول والبروتين ليست جزءا من وظيفة coactivator من E6-AP. البيانات الواردة في هذا التقرير تشير إلى أن E6-AP تمتلك اثنين من المستقلين، فصل وظائف، coactivation وبتحول البروتين النشاط يغاز. من ناحية أخرى، coactivators المستنسخة سابقا مثل SRC-1، P300 / الجمارك وحماية الحدود، وRAC3 / ACTR / AIB1 تمتلك النشاط HAT وجزء واضح من المفترض بهم في الجسم الحي coactivation وظيفة من خلال هذا النشاط الأنزيمي (2، 28، 32، 41). E6-AP تمتلك بتحول البروتين النشاط يغاز، بدلا من النشاط HAT، وهي ليست شرطا مسبقا لcoactivation. وتشير هذه النتيجة إلى أن E6-AP يعمل رواية البروتين المزدوجة وظيفة، وتنظم كل من هرمون الستيرويد عمل مستقبلات وتدهور بوساطة بتحول-proteasome و-من البروتين p53. coactivator آخر، TRIP230، فقد تبين أيضا أن تشارك في السيطرة دورة الخلية عن طريق عزل شكل hypophosphorylated من البروتين الشبكية (8).
آخر coactivator المحتملة التي تم تحديدها في الخميرة وخلايا الثدييات (RSP5 / hRPF1) وقد تورط باعتباره coactivator من مستقبلات هرمون الستيرويد التي تمتلك نطاق وكان الحاخام هيشت مع٪ 37 الهوية إلى أن من E6-AP (24). UREB1، وهو بروتين ملزمة الحمض النووي الذي يحتوي أيضا على نطاق وكان الحاخام هيشت (32)، هو الأمينية عضال اقتطاع (حوالي 300 أأ) مقارنة E6-AP وليس له أي تأثير على وظيفة transactivation من مستقبلات هرمون النووية (لا تظهر البيانات)، مرة أخرى مما يدل على أن المجال كان الحاخام هيشت وحده ليس كافيا لcoactivation.
النتائج المعروضة هنا لمتحولة البروتينات E6-AP المحددة في AS المرضى تشير إلى أن لا ترتبط وظيفة coactivation من E6-AP مع مظهر المظهري من AS. ومع ذلك، نتائجنا لا تشير إلى أن النتائج AS النمط الظاهري من خلل في النشاط يغاز بتحول والبروتين من E6-AP. عادة، يتم التعبير فقط نسخة الأمهات من E6-AP في مناطق معينة من المخ، في حين أن الأب نسخة صامتة بسبب يطبع (37). ومع ذلك، فإنه لا يزال من الممكن أن الحذف الجسيمة أو كاملة E6-AP (مثل R417X متحولة) يمكن أن يؤدي إلى خلل coactivation مستقبلات الستيرويد في هذه المناطق من الدماغ أو الأنسجة الأخرى حيث يتم التعبير عن E6-AP بطريقة مطبوع. تحليل أكثر تفصيلا للعلاقات بين AS، E6-AP، وعمليات تنظيم مستقبلات هرمون النووي أخرى ينتظر إجراء مزيد من التحقيقات. ومن المثير للاهتمام، haploinsufficiency من النووي مستقبلات هرمون coactivator، بروتين ملزمة CREB آخر، ويرتبط مع متلازمة روبنشتاين-تيبي، وهو مرض وراثي يتميز أيضا عن عيوب عصبية متنوعة (35).
في الختام، تظهر نتائجنا أن E6-AP، وهو بروتين يرتبط وراثيا لمرض وراثي البشري (AS)، هو coactivator الحقيقيين من مستقبلات هرمون النووية. على الرغم من بتحول-proteasome وبوساطة مسار تدهور عوامل النسخ وقد تبين مؤخرا أنها مهمة لتنظيم النسخي (25، 29، 43)، وتشير تجاربنا التي بتحول البروتين النشاط يغاز E6-AP ليست كافية للتوسط في قدرة E6 -AP إلى coactivate مستقبلات هرمون النووية. ومع ذلك، فمن الممكن أن تدهور مسار بوساطة بتحول (ق) يسهم في بعض جوانب النووية وظيفة مستقبلات الهرمونات في الجسم الحي. E6-AP قد تعدل النشاط النسخي من مستقبلات هرمون النووية من خلال تعزيز تدهور المنظمين السلبية من النسخ مثل corepressors. وتمشيا مع هذه الفرضية، فقد تبين أن واحدا من corepressors مستقبلات النووي، وN-مجلس النواب، ويمكن أن تتحلل من خلال مسار تدهور proteasome و(55). ومن الممكن أيضا أنه بعد تنشيط مستقبلات من النسخ، لا بد من آلية لفصل مجمع التمهيد للبدء السماح باستعادة النسخ واستطالة وبالتالي للتوسط تدهور إما مستقبلات أو عوامل النسخ العامة لممارسة رقابة أشد من النسخ. وقد اقترح مزيدا من الأدلة على وجود صلة بين مسار بتحول والنسخ الجيني عن طريق التقرير أن RSP5 / RPF1 ubiquitinates المجال-C محطة من RNA بوليميريز الثاني (23). يمثل تقريرنا مثال آخر على مجموعة من coactivators لمستقبلات النووية التي تحتوي coactivation متميزة والأنشطة الإنزيمية أعضاء.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس