عرض مشاركة واحدة
  #16  
قديم 11-22-2015, 11:24 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي A الجينوم على نطاق إصلاح الحمض النووي رني الشاشة يحدد spg48 بوصفها رواية جين المصاحبة راثي مشلول الشلل النصفي

 

http://journals.plos.org/plosbiology...l.pbio.1000408




ملخص

إصلاح الحمض النووي أمر ضروري للحفاظ على سلامة الجينوم، وكثيرا ما تحور الجينات مع أدوار في إصلاح الحمض النووي في مجموعة متنوعة من الأمراض التي تصيب الإنسان. إصلاح عبر إعادة التركيب مثلي عادة يعيد تسلسل الحمض النووي الأصلي دون طفرات إدخال، وعدد من الجينات التي مطلوبة من أجل DNA إعادة التركيب مثلي مزدوج الجديلة إصلاح انقطاع (HR-DSBR) تم تحديدها. ومع ذلك، لم يتم الإبلاغ عن تحليل منهجي لهذا المسار المهم إصلاح الحمض النووي في خلايا الثدييات. هنا، نحن تصف باختصار التدخل RNA (esiRNA) الشاشة عن الجينات المسؤولة في الحمض النووي حبلا مزدوجة إصلاح كسر الجينوم على نطاق إعداد endoribonuclease. نفيدكم 61 الجينات التي تتأثر وتيرة HR-DSBR وتميز في التفاصيل واحدة من الجينات التي انخفضت وتيرة HR-DSBR. وتبين لنا أن KIAA0415 الجين يشفر helicase المفترض أن يتفاعل مع SPG11 وSPG15، اثنين من البروتينات المتحورة في الشلل النصفي التشنجي وراثي (HSP). نحن تحديد الطفرات في المرضى الذين يعانون HSP، واكتشاف KIAA0415 / SPG48 باسم الجينات رواية HSP المصاحب، وتبين أن KIAA0415 / SPG48 خط خلية متحولة هو أكثر حساسية لDNA إتلاف المخدرات. نقدم مسح الجينوم على نطاق والعشرين من HR-DSBR في خلايا الثدييات توفير مجموعة البيانات التي يجب الإسراع في اكتشاف جينات جديدة مع أدوار في إصلاح الحمض النووي والظروف الطبية المرتبطة بها. يطلب من اكتشاف أن البروتينات تشكيل مجمع البروتين رواية لكفاءة HR-DSBR وتحور في المرضى الذين يعانون من HSP يشير إلى وجود صلة بين HSP وإصلاح الحمض النووي.

الكاتب موجز

جميع الخلايا في أجسامنا لديها للتعامل مع آفات عديدة لالحمض النووي. الخلايا تستخدم بطارية من الجينات لإصلاح الحمض النووي والحفاظ على سلامة الجينوم. ونظرا لأهمية وجود الجينوم سليمة، فإنه ليس من المستغرب أن الجينات مع أدوار في إصلاح الحمض النووي وتحور في كثير من الأمراض التي تصيب الإنسان. هنا، فإننا نقدم نتائج شاشة إصلاح الحمض النووي الجينوم النطاق في الخلايا البشرية واكتشاف 61 الجينات التي لها دور محتمل في هذه العملية. درسنا بالتفصيل جين لم يسبق توصيفها (KIAA0415 / SPG48) وأثبتت أهميتها لDNA كفاءة حبلا مزدوجة إصلاح كسر. وكشفت التحليلات المزيد من الطفرات في الجين SPG48 في بعض المرضى الذين يعانون من الشلل النصفي التشنجي وراثي (HSP). أظهرنا أن SPG48 يتفاعل جسديا مع البروتينات HSP الأخرى وأن خلايا المرضى حساسون لDNA إتلاف المخدرات. وتشير البيانات المتوفرة لدينا وجود صلة بين HSP وإصلاح الحمض النووي ونقترح أن المرضى HSP يجب فحص للطفرات KIAA0415 / SPG48 في المستقبل.

الأرقام




























الاقتباس: Słabicki M، ثيس M، كراستيف DB، سامسونوف S، Mundwiller E، خوانكويرا M، وآخرون. (2010) A الجينوم على نطاق إصلاح الحمض النووي رني الشاشة يحدد SPG48 بوصفها رواية جين المصاحبة راثي مشلول الشلل النصفي. بلوس بيول 8 (6): e1000408. دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408
محرر الأكاديمية: نيكولاس هاستي، وحدة مجلس البحوث الطبية علم الوراثة البشرية، المملكة المتحدة
وردت: 12 مارس 2010؛ المقبولة: 19 مايو، 2010؛ تاريخ النشر: 29 يونيو 2010
حقوق النشر: © 2010 Słabicki وآخرون. هذا هو مقال الوصول المفتوح زعت بموجب شروط رخصة المشاع الإبداعي العزو، الذي يسمح بالاستخدام غير المقيد، والتوزيع، والاستنساخ في أي وسيط، بشرط تقيد المؤلف الأصلي والمصدر.
التمويل: تم تمويل هذه الدراسة من قبل جمعية ماكس بلانك (لFB، AS)؛ من قبل الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث يمنح الذهاب الحيوية [0315105] (لFB)، NGFN زائد [01GS0859] (لFB)؛ من قبل كلاوس Tschira ستيفتونغ المحدودة (لJT، SS، والخطة المتوسطة الأجل)؛ من قبل المعاهد الوطنية للصحة NIGMS منح 1R01GM070986-01A1 (لAS)؛ من المنحة EUROSPA كونسورتيوم الاتحاد الأوروبي (لAB)؛ من قبل الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث يمنح ANR-SPG11 (لGS) وANR-SPAX (إلى AD)؛ وقبل عقدي الأساس (لAB). كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة.
تضارب المصالح: قد أعلن المؤلفان أن لا المصالح المتنافسة موجودة.
الاختصارات: BAC، كروموسوم اصطناعي البكتيرية. BER، قاعدة إصلاح الختان. PDB، بروكهافن بروتين بنك المعلومات. جهاز تسوية المنازعات، وضعف كسر حبلا؛ HSP، الشلل النصفي التشنجي راثي؛ الأشعة تحت الحمراء، الأشعة المؤينة. LOH، وفقدان تغاير؛ MMC، ميتوميسين C؛ NER، النوكليوتيدات إصلاح الختان. NHEJ، نهاية امتماثلان الانضمام. PFA، لامتصاص العرق. Rluc، renilla luciferase المراسل. TCC، الإحضار رقيقة الثفني

مقدمة

ترتبط طفرات في الجينات DNA إصلاح يعانون من أمراض واضطرابات مختلفة بما في ذلك السرطان [1]، تسارع الشيخوخة [2]، وتنكس الخلايا العصبية [3]. تظهر الخلايا العصبية لتكون عرضة للطفرات في الجينات إصلاح الحمض النووي، وربما يعود ذلك إلى عدم الانتشار والاكسدة العالية داخل هذه الخلايا. ونتيجة لذلك، وقد تم ربط العديد من الأمراض العصبية عيوب في إصلاح الحمض النووي مثل رنح توسع الشعيرات [4]، وترنح توسع الشعيرات مثل اضطراب [5]، ومتلازمة سيكيل [6]، ومتلازمة الكسر نيميجن [7]، وCharcot- متلازمة ماري توث [8].
A الآفة DNA خطيرة ولا سيما بالنسبة للخلية هو كسر حبلا مزدوجة (DSB)، التي يتم فيها كسر نوعين من الحمض النووي على مقربة من بعضها البعض [9]، [10]. يتم إصلاح DSBs أساسا عن طريق مسارين متوازيين: إعادة التركيب مثلي ونهاية امتماثلان الانضمام (NHEJ). إصلاح عبر إعادة التركيب مثلي يعيد عادة المعلومات الجينية، في حين إصلاح عبر NHEJ غالبا ما يؤدي إلى حدوث طفرات [10]، [11].
في الآونة الأخيرة، وقد تناولت عدة شاشات رني مختلف جوانب إصلاح الحمض النووي الثدييات، مثل زيادة الحساسية تجاه PARP تثبيط [12]، وزيادة الحساسية تجاه سيسبلاتين [13]، وتراكم 53BP1 بؤر [14]، [15]، أو الفسفرة غيرت من هيستون البديل H2AX [8]. هذه الشاشات قد تتعزز بشكل كبير من فهمنا للعمليات إصلاح الحمض النووي الإنسان وتسليم عدد من جينات جديدة متورطة في مختلف جوانب إصلاح الحمض النووي. هنا، ونحن التقرير شاشة رني الجينوم على نطاق وللجينات المتورطين في مثلي بوساطة إعادة التركيب إصلاح جهاز تسوية المنازعات، كشف مجموعة متنوعة من الجينات المعروفة وذلك uncharacterized الآن المتورطين في هذه العملية. في هذا العمل، ونحن تلغيم هذه الشاشة تستخدم نهج المعلوماتية الحيوية الهيكلية وتحديد KIAA0415 / SPG48 باعتباره helicase المفترض أن يرتبط الشلل النصفي التشنجي وراثي (HSP).

النتائج

الجينوم على نطاق رني الشاشة

للبحث شامل من الجينات المرتبطة مع DNA DSB إصلاح، أجرينا شاشة رني الجينوم على نطاق، وذلك باستخدام وباختصار التدخل RNA (esiRNA) مكتبة أعد endoribonuclease [16] وتوظيف راسخة DR-GFP فحص [17]. أولا، تم إنشاء خط ثابت الخلية هيلا مع اثنين من الأليلات GFP غير وظيفية، التي يتم تفعيلها GFP التعبير بكفاءة إلا بعد HR-DSBR (الشكل 1A). ثم اختبرنا متانة فحص من قبل المشارك ترنسفكأيشن هذه الخلايا مع I-SCEI التعبير البلازميد وesiRNA استهداف Rad51، وهو عامل أساسي لتنفيذ المراحل الأولى من الاقتران مثلي وتبادل حبلا [18]. أدى استنزاف Rad51 إلى انخفاض ملحوظ للخلايا إيجابية GFP، واقترحت مقارنات لمراقبة الخلايا السلبية transfected مجموعة ديناميكية عالية للعوامل المؤثرة مرشح HR-DSBR (1B الشكل ورسوم بيانية الشكل 1C).

تحميل:
الشكل 1. الجينوم على نطاق الشاشة HR-DSBR esiRNA.

(A) تمثيل تخطيطي للمقايسة DR-GFP. وتظهر أليلين GFP غير وظيفية وموقع قطع I-SCEI. ويرد البلازميد transfected ترميز نوكلياز داخلية I-SCEI كدائرة حمراء. يظهر الجين GFP الوظيفي الذي تم إنشاؤه بعد نجاح HR-DSBR باللون الأخضر. (ب) تحليل المناعي من خط الخلية DR-GFP هيلا بعد ترنسفكأيشن مع أو بدون نوكلياز داخلية البلازميد I-SCEI وأشار esiRNAs. الحانات النطاق تمثل 10 ميكرومتر. (C) تحليل لوحة سبيل المثال من الشاشة. الآبار رمادي تشير knockdowns التي لم تتغير بشكل ملحوظ في النسبة المئوية للخلايا إيجابية GFP لاحظ، والآبار حمراء وخضراء دلالة knockdowns إنخفاضا أو زيادة النسب المئوية للخلايا إيجابية GFP لاحظ، على التوالي. يتم وضع علامة آبار المراقبة مع إطارات سوداء. على كل لوحة كانت هناك أربع الضوابط الإيجابية (esiRNA استهداف Rad51) وثمانية ضوابط السلبية (esiRNA ضد Rluc - renilla luciferase المراسل). وتعرض رسوم بيانية سبيل المثال FACS لtransfections السيطرة. (D) نقطة مؤامرة من الشاشة الرئيسية. يتم عرض النتائج على هيئة متوسط ​​عشرات من ض المستمدة من اثنين مكررات مستقلة. وترد Knockdowns مع ض عشرات أدناه -2 أو أعلى 2 باللون الأحمر أو الأخضر، على التوالي. (E) نتائج تحليل الأنطولوجيا الجينات التخصيب لالأساسي (أسود) والتحقق من صحتها (الرمادي) يضرب.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.g001

وقد أجريت الشاشة رني من نسختين في لوحات 384 بشكل جيد من قبل المشارك ترنسفكأيشن من الترميز البلازميد I-SCEI مع esiRNAs الفردي يستهدف أكثر من 16،000 الجينات البشرية [16]. تم تحديد النسبة المئوية للخلايا إيجابية GFP بواسطة FACS إنتاجية عالية، وتوفير قراءات حساسة للesiRNAs التأثير على وتيرة HR-DSBR (الشكل 1C). ضربة قاضية من 228 و 141 محاضر انخفضت بشكل ملحوظ أو زيادة النسبة المئوية للخلايا إيجابية GFP، على التوالي (الشكل 1D، الجدول S1). من بين أقوى knockdowns تؤثر HR-DSBR كانت الجينات مع الأدوار تتميز جيدا في إصلاح الحمض النووي مثل Rad51، BRCA1، وSHFM1. وكشف تحليل الجينات تخصيب الأنطولوجيا من المرشحين لتخصيب 5 أضعاف عن الجينات ذكرت أن المتورطين في إصلاح الحمض النووي (الشكل 1E)، مؤكدا أن الشاشة كانت فعالة.
ضرب التحقق

للتحقق من صحة يضرب مرشح درسنا التعبير عنها في خلايا هيلا وresynthesized جميع esiRNAs عن الجينات التي تم التعبير عنها. نحن أيضا ولدت esiRNA الثانية، مستقلة، وغير متداخلة لهذه الجينات واختبار جميع esiRNAs مرة أخرى في مقايسة DR-GFP في مكررات متعددة. باستخدام معايير اختيار صارمة (انظر طرق أون لاين)، انخفضت 45 الجينات وتيرة إعادة التركيب مثلي، في حين زادت عليه 17 الجينات مع اثنين من المشغلات إسكات المستقلة (الجدول 1). لمزيد من تضييق قائمة من هؤلاء المرشحين 62، اختبرنا esiRNAs لتأثيرها على مستويات GFP الخلايا. EsiRNAs التي تؤثر على مستويات GFP، على سبيل المثال من خلال استهداف المنشط النسخي لGFP التعبير، يمكن أن يسجل في مقايسة DR-GFP وتلوث قائمة الاغتيالات. وبالتالي فإننا transfected في esiRNAs إلى GFP معربا عن الخلايا هيلا ويعاير مستويات GFP بواسطة FACS. انخفاض EsiRNAs استهداف MKNK2 مستويات GFP في هذه الخلايا. لذلك، تم استبعاد هذا الجين من مزيد من التحليل، والحد من القائمة النهائية لضرب 61 الجينات (الجدول 1). تم رصد فعالية هذا التحقق صرامة مرة أخرى عن طريق تحليل تخصيب الأنطولوجيا الجينات، مع إثراء الآن 20 ضعفا عن الجينات المشروح في إصلاح الحمض النووي فئة (الشكل 1E).

تحميل:
الجدول 1. ملخص البيانات المظهرية من الجينات المرشحة المتورطين في HR-DSBR.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.t001
Knockdowns أن زيادة تواتر HR-DSBR

إسكات 17 الجينات زيادة كبيرة في عدد الخلايا إيجابية GFP في مقايسة DR-GFP. وبالتالي، فإن ضربة قاضية من هذه الجينات روجت HR-DSBR، والتي قد تكون ذات فائدة لعدة تطبيقات بيولوجية مثل زيادة كفاءة استهداف الجينات إعادة التركيب مثلي [19]. قد يفسر أسباب مختلفة لزيادة عدد الخلايا إيجابية GFP الملاحظة. أحد الاحتمالات هو أن ضربة قاضية أدت إلى تثبيط مسار NHEJ، وبالتالي تحويل نسبة من اثنين من المسارات الممكنة نحو الإصلاح عبر HR. الدعم لهذا المنطق يأتي من التجارب في الخميرة والذباب، حيث خروج المغلوب من يغاز DNA IV، وهو الجين الذي هو مطلوب لNHEJ [20]، زيادة كبيرة استهداف الجينات بإتحاد مثلي [21]، [22]. ومن المثير للاهتمام، أسفرت ضربة قاضية من Lig4 الإنسان في زيادة مذهلة في الخلايا إيجابية GFP في مقايسة DR-GFP (الجدول 1)، مما يدل على أن تثبيط مسار NHEJ يمكن أن تزيد من وتيرة HR-DSBR أيضا في خلايا الثدييات. ويدعم هذه الفكرة أيضا عن طريق التفتيش وغيرها من البروتينات NHEJ المعروفة، بما في ذلك XRCC4، XRCC5، XRCC6، PRKDC، وDCLRE1C [23]، [24]. ضربة قاضية من كل من هذه البروتينات زادت وتيرة إعادة التركيب مثلي في مقايسة DR-GFP (الجدول S1). وبالتالي، فإننا نفترض أن جينات أخرى أن زيادة عدد الخلايا إيجابية GFP قد تكون متورطة في مسار NHEJ وأن ضربة قاضية من هذه الجينات يمكن أن يعزز استهداف الجينات بإتحاد مثلي في خلايا الثدييات.
Knockdowns إنخفاضا تواتر HR-DSBR

وقد أثرى قائمة من الجينات التي انخفضت وتيرة HR-DSBR للبروتينات مع أدوار محددة جيدا في HR-DSBR، مثل Rad51 وBRCA1. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحديد الجينات، مثل E2F1، التي تؤثر بصورة غير مباشرة HR-DSBR أيضا في الشاشة. وتشارك E2F1 في دورة الخلية وتنظيم موت الخلايا المبرمج بعد التلف في الحمض النووي [25] ولقد تم مؤخرا تورط في تنظيم النسخي من Rad51 وBRCA1 [26] ربما يفسر لماذا سجل، وضربة قاضية من E2F1 في الشاشة لدينا. ومن المثير للاهتمام، كشف الفحص أيضا عددا من الجينات التي لها دور في عمليات إصلاح الحمض النووي غير HR-DSBR، مثل XPC، التي لها دور في إصلاح الختان النوكليوتيدات (NER) [27]، وإصلاح قاعدة الختان (BER) الحمض النووي helicase RECQL4 [28]. ومع ذلك، فقد تم مؤخرا أظهرت تعدد الأشكال في الجين XPC لربط مع الانحرافات الكروموسومية التي يسببها بليوميسين [29]، وقد ذكرت RECQL4 ليتزامن مع البؤر التي شكلتها Rad51 بعد تحريض DSBs [30]، مما يشير إلى احتمال وجود صلة بين مختلف مسارات إصلاح الحمض النووي. وأخيرا، وأثرى قائمة الجينات لمفارز proteasome و، بما في ذلك PSMD4، PSMD1، PSMD14، وSHFM1. وقد أظهرت المعاملة مع مثبطات proteasome وقمع تحديدا HR-DSBR ربما بسبب عدم وجود تدهور بوساطة proteasome والكروماتين ملزمة البروتينات عرقلة الوصول إلى الآفة [31]، [32]. وعلاوة على ذلك، وقد تبين SHFM1 لازما لRad51 تشكيل بؤر على الحمض النووي من التلف [33]، تورط دورا أكثر مباشرة من هذا proteasome وحدة فرعية في HR-DSBR وربما تقديم تفسير لماذا كان SHFM1 واحدة من أقوى الضربات في الشاشة لدينا. وبناء على هذه النتائج التي تم تشجيعهم على مواصلة التحقيق في knockdowns إنخفاضا في عدد الخلايا إيجابية GFP في مقايسة DR-GFP.
لوصف بالتفصيل 44 knockdowns إنخفاضا وتيرة HR-DSBR، أجرينا عدة فحوصات إضافية. أولا، نحن اختبار تأثير على بقاء الخلية من هذه esiRNAs في خلايا هيلا. انخفض ثلاثة عشر esiRNAs كبير أعداد الخلايا واستبعدت من إجراء المزيد من التحليلات (الجدول 1). ثانيا، أجرينا ميتوميسين C (MMC)، سيسبلاتين، والإشعاع المؤين (IR) فحوصات الحساسية. MMC يؤدي في الغالب interstrand عبر وصلات، والتي تؤدي، من بين أمور أخرى، في DSBs بسبب كتلة من تكرار الشوك [34]. الأضرار سيسبلاتين DNA بطريقة مختلفة ويولد في الغالب intrastrand وصلات عبر [35]، في حين IR يؤدي إلى مجموعة متنوعة من آفات الحمض النووي [36]. الخلايا مع ضعف مسارات إصلاح الحمض النووي قد تكون أكثر حساسية لهذه العلاجات، والتي ينبغي أن تظهر في انخفاض بقاء الخلية. أربع وعشرين ساعة بعد ترنسفكأيشن من esiRNAs، تم علاج الخلايا لمدة 1 ساعة مع MMC، سيسبلاتين، أو تعرض لIR واحصي الخلايا بعد الحضانة إضافية لمدة 48 ساعة. زاد عدد من knockdowns حساسية تجاه العلاجات واحد أو أكثر، تثبت دور هذه الجينات في إصلاح الحمض النووي، مع بعض knockdowns يظهر له أثر واحد، ولكن ليس العلاج الأخرى (الشكل 2A، الجدول 1). على سبيل المثال، ضربة قاضية لRBBP8 (المعروف أيضا باسم CtIP)، الذي يعزز نهاية DNA استئصال [37]، لم يسبب زيادة الحساسية تجاه سيسبلاتين. ومع ذلك، احصي الخلايا أقل بكثير بعد العلاج MMC، مشيرا إلى أن نضوب RBBP8 توعية في المقام الأول الخلايا ضد هذا الدواء. ثالثا، قمنا بتوظيف غاما H2AX إزالة الفحص. وفسفرته في H2AX هيستون على سيرين 139 في الغالب عن طريق الصراف الآلي / ATR [38]، [39] في مواقع DSBs حتى يتم إصلاح الآفة. بعد إصلاح الحمض النووي الناجح هو عاد هذا الفسفرة من قبل PP2A الفوسفاتيز [40]. أسفرت عدة knockdowns في فترة طويلة قبل إزالة غاما H2AX من الخلايا المشع (الشكل 2B، الجدول 1)، مما يشير إلى التأخير في DSBR، وربما يفسر الانخفاض الملحوظ للخلايا إيجابية GFP في مقايسة DR-GFP. والمثير للدهشة، أظهرت بضع knockdowns خفضت بشكل عام عدد الخلايا إيجابية غاما H2AX، أو تسارع إزالة غاما H2AX بعد التشعيع. على سبيل المثال، أدى استنزاف ARHGEF1 في انخفاض عدد خلايا إيجابية غاما H2AX 1 ساعة بعد التشعيع (الشكل 2B). يحتمل، وهذا رو تبادل جوانين النوكليوتيدات عامل [41] مطلوب للتجنيد كفاءة من عوامل الفسفرة H2AX، الذي يترجم في النهاية إلى أقل كفاءة HR-DSBR. في المقابل، فإن ضربة قاضية من FIZ1، وهو Flt3 التفاعل الزنك البروتين إصبع [42]، أسفرت عن أعداد مماثلة من أشعة غاما H2AX خلايا إيجابية 1 ساعة بعد التشعيع بالمقارنة مع الخلايا السيطرة transfected. ومع ذلك، تم إزالة غاما H2AX بسرعة أكبر في هذه الخلايا (الشكل 2B)، ويحتمل المساومة DSBR فعال. معا، وهذه النتائج تعد تصديقا فعالية الشاشة لدينا وتكون بمثابة تصنيف الأولي من المسارات الجزيئية لعدد من الجينات التي يمكن استكشافها في الدراسات المستقبلية.

تحميل:
الشكل 2. فحوصات الثانوية للجينات التي تقلل من تكرار HR-DSBR.

(A) تأثير على بقاء الخلية بعد ترنسفكأيشن من esiRNAs أشار (أسود) بالاشتراك مع سيسبلاتين (رمادي غامق)، MMC (رمادي فاتح)، والأشعة تحت الحمراء (أبيض) معاملة ترد. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. وتم تطبيع كل النتائج إلى esiRNA ضد transfections Rluc. (B) تأثير على المئة من gammaH2AX خلايا إيجابية بعد ترنسفكأيشن من esiRNAs أشار دون التشعيع (أسود)، 1 ساعة بعد التشعيع (رمادي غامق)، و 6 ساعة بعد التشعيع (رمادي فاتح). أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.g002
KIAA0415 هل لالمزعومين Helicase المطلوبة لكفاءة HR-DSBR

لهذا العمل، ونحن الملغومة الشاشة عن طريق إجراء تحاليل المعلوماتية الحيوية على تسلسل uncharacterized في محاولة للكشف عن وظائف الجزيئية الممكنة. ظهرت KIAA0415 بوصفها ملحوظا بوجه خاص. من خلال تطبيق تقنيات خيوط (انظر طرق على الانترنت لمزيد من التفاصيل)، حددنا homologies الهيكلية المحتملة للKIAA0415 مع البروتينات التي تنتمي إلى عائلة أضعاف "P-حلقة تحتوي على hydrolases ثلاثي الفوسفات نوكليوزيد" (SCOP c.37؛ الجدول S2).تحتوي هذه العائلة أضعاف ما يسمى ب "helicase C نطاق" (PF00271) التي شكلتها تكرار جنبا إلى جنب اثنين من المجالات RECA مثل (جنبا إلى جنب AAA-أتباز الفصيلة). وقد تم الحصول على أعلى الدرجات تسلسل إلى بنية التحالفات مع تسلسل KIAA0415 وهيكل المجالات helicase C من helicases SF2 التي تشارك في إصلاح الحمض النووي مثل UvrB، Hel308، RecG، وTRCF (الشكل 3). الفحص البصري للنموذج 3D ولدت (انظر طرق أون لاين) أكد وجود المحتملة الزخارف helicase SF2 في KIAA0415 (الشكل S1). واستخدمت الديناميات الجزيئية محاكاة لصقل نموذج KIAA0415 وأيد استقراره وADP من المفترض والمغنيسيوم 2+ الاعتراف (S1 فيديو، طرق أون لاين). هذه النتائج زيادة دعم التنبؤ مجال مثل helicase داخل KIAA0415 والدليل على الحفظ في 3D من بقايا هامة لوظيفتها باعتبارها SF2 helicase المفترضة.

تحميل:
الشكل 3. القائم على بنية تسلسل المحاذاة من المجالات helicase C من SF2 helicases UvrB (2D7D)، Hel308 (2P6R)، RecG (1GM5)، وTRCF (2EYQ).

وتظهر على إجماع عناصر هيكل الثانوي الخوار كما اللوالب الحمراء (α-اللوالب) والسهام الزرقاء (β-فروع). محاذاة تسلسل KIAA0415 تم الحصول عليها من خيوط وتستخدم لبناء نموذج 3D من helicase المفترضة C مثل المجال الخاص به فقا لهذه النماذج الهيكلية هو مبين في الأعلى. يتم تمييز حفظ تسلسل KIAA0415 فيما يتعلق هياكل قالب باللون الرمادي (المحافظ) والأصفر (شبه المحافظ). يتم تمثيل الحذف الفجوة والملاحق من قبل الخطوط المتقطعة ورموز U مقلوب، على التوالي. وصفت الإدراج مع N- المقابلة وC-إنهاء الترقيم بقايا (أسود للKIAA0415 والأخضر لUvrB، والأزرق للHel208). المناطق I، IA، II، III، IV وأكد، وV التوافق الزخارف SF2 helicase. بقايا تشارك في ADP- والمغنيسيوم 2+ ملزمة الملونة باللون الأزرق والأحمر، على التوالي.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.g003

وبناء على هذه النتائج، قررنا زيادة توضيح وظائف الجزيئية الممكنة من KIAA0415. نحن أول اختبار للقوة من KIAA0415 esiRNAs العاملين في مزيد من التفاصيل. كلا esiRNAs المنضب النصوص KIAA0415 مرنا (بكفاءة الشكل 4A) والبروتين (الشكل 4B). نحن ثم كرر فحص DR-GFP في خط الخلية مراسل هيلا ووجدت 3.4 (esiRNA1) و 4.3 (esiRNA2) أضعاف انخفاض في خلايا إيجابية GFP بالمقارنة مع الضوابط، مما يشير إلى انخفاض الترددات إعادة التركيب مثلي (الشكل 4C). درسنا مستويات التعبير عن I-SCEI بعد knockdowns لاستبعاد احتمال أن DSBs لدت I-SCEI-هي خطر (الشكل S2). لاستبعاد احتمال تأثير معين من نوع الخلية، ونحن أيضا اختبار knockdowns في خط خلايا مختلفة. وأظهرت الخلايا U2OS يحمل الموقع الإدراج واحد من بناء DR-GFP انخفاض مماثل للخلايا إيجابية GFP على KIAA0415 ضربة قاضية (الشكل 4D)، مشيرا إلى أن هذا التأثير لم يكن خط خلية معينة. وأخيرا، استبعدنا الممكنة بعيدا عن الهدف الآثار عن طريق أداء عبر الأنواع التجارب رني الانقاذ [43]. التعبير مستقر من الماوس KIAA0415 في DR-GFP خط الخلية البشرية الصادر هذا الخط الخلية مقاومة للesiRNAs الإنسان، توثيق لدور KIAA0415 في HR-DSBR (الشكل 4E). باختصار، تشير هذه النتائج إلى أن KIAA0415 هو رواية المفترض helicase SF2 اللازمة لكفاءة HR-DSBR.

تحميل:
الرقم 4. التحليل الوظيفي للKIAA0415.

(A) كفاءة KIAA0415 مرنا ضربة قاضية مع اثنين من esiRNAs مستقل في خلايا هيلا. وتظهر المستويات النسبية للمرنا 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن من esiRNAs المشار إليها. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري، ** ع <0.01. (B) كفاءة البروتين KIAA0415 ضربة قاضية مع اثنين من esiRNAs مستقل في خلايا هيلا. KIAA0415-LAP تحليل لطخة غربية من خلايا هيلا مقتطفات يتم عرض 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن من أشار esiRNAs. وصمة عار ضد تويولين بمثابة سيطرة التحميل. (C) اثنين esiRNAs KIAA0415 مستقلة تؤثر على وتيرة إصلاح إعادة التركيب مثلي تقاس باستخدام الفحص DR-GFP. النسبة المئوية النسبية للGFP خلايا هيلا إيجابية، تطبيع للخلايا Rluc transfected، يظهر لesiRNAs المشار إليها. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. ** ف <0.01. (D) والنمط الظاهري ضربة قاضية KIAA0415 ليس خط الخلية التابعة. النسبة المئوية النسبية للGFP الخلايا U2OS إيجابية، تطبيع للخلايا Rluc transfected، يظهر لesiRNAs المشار إليها. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري، ** ع <0.01. (E) التعبير عن orthologue الماوس KIAA0415 ينقذ النمط الظاهري KIAA0415 رني. وتظهر النسبة المئوية النسبية للGFP إيجابية في الخلايا DR-GFP هيلا التعبير عن ثابت وKIAA0415 الفار من BAC مع transfected esiRNAs المشار إليه. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري، ** ع <0.01. تم العثور على (F) إيسفورمس KIAA0415 مختلفة في النواة والسيتوبلازم. ويرد صمة عار KIAA0415 الغربية مقتطفات الخلية هيلا بعد تجزئة الخلية. خدم البقع ضد تويولين وهيستون H3 والضوابط.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.g004
KIAA0415 أشكال معقدة مع البروتينات المصاحبة للشلل سفلي تشنجي

لمزيد من تميز KIAA0415، ونحن الموسومة الجينات على الكروموسوم الاصطناعي البكتيري (BAC) تطبيق نهج TransgeneOmics [44]. هذا الأسلوب يسمح التعبير عن البروتينات الموسومة من المروج لها الأصلي في سياقها الجيني، وبالتالي، يتم التعبير عن هذا البروتين قرب المستويات الفسيولوجية [44]، [45]. تم استنساخ بنجاح C- وN-عضال الموسومة KIAA0415 وأعرب في خلايا هيلا. أظهر البروتين الانصهار تفريق، حشوية، وتوطين النووية، التي لم تتغير كثيرا على تحريض الحمض النووي من التلف (بيانات غير منشورة). Immunoblotting مقتطفات خلية كشف شريطين البروتين الكبرى، وربما يعكس اثنين إيسفورمس KIAA0415 (الشكل 4B). وأظهرت fractionations الخلية التي الإسوي أقصر كان في الغالب النووي، في حين تم العثور على شكل أطول معظمها في السيتوبلازم (الشكل 4F). تجارب مناعي تليها تحديد الطيفي للبروتينات معزولة شارك كشفت تفاعلات KIAA0415-LAP مع SPG11، SPG15، C20orf29، وDKFZp761E198 (الشكل 5A، B والجدول S3). من أجل التحقق من صحة هذه التفاعلات ولدت لنا خطوط الخلايا معربا عن C-عضال SPG11 معلم، SPG15، وDKFZp761E198 مرة أخرى باستخدام نهج TransgeneOmics. تجارب مناعي متبادلة تليها مطياف الكتلة تحليلات في جل ويساعد على هضم أكدت في حل وجود بروتين معقد، والذي يتألف من خمسة أشخاص على الأقل البروتينات الأساسية: KIAA0415، SPG11، SPG15، C20orf29، وDKFZp761E198 (الشكل 5B والجدول S3 ). من أجل اختبار ما إذا كان شركاء التفاعل البروتين من KIAA0415 من شأنه أن يؤثر أيضا HR-DSBR، اختبرنا esiRNAs تستهدف هذه الجينات في مقايسة DR-GFP. ومن المثير للاهتمام، لوحظ انخفاض كبير في خلايا إيجابية GFP على إسكات من C20orf29 وSPG15 مع اثنين من esiRNAs المستقلة (الشكل 6)، مما يشير إلى أن هناك حاجة أيضا هذه البروتينات لكفاءة HR-DSBR. ضربة قاضية من SPG11 وDKFZp761E198، ومع ذلك، لم لا يكون لها تأثير على النسبة المئوية للخلايا إيجابية GFP. معا، وهذه التجارب تكشف عن وجود بروتين معقد الرواية، والتي على الأقل في جزء مطلوب لكفاءة HR-DSBR.

تحميل:
الرقم 5. يتفاعل مع KIAA0415 SPG11، SPG15، DKFZp761E198 وC20orf29.

المواد الهلامية (A) SDS-PAGE تم الحصول عليها من مناعي من KIAA0415-LAP وSPG11-LAP. وقد تم تحديد الطعم (ملحوظ في الخضراء) والفريسة (باللون الأسود) عن طريق الهضم في جل وتحليل nanoLC-MS / MS (انظر الشكل S3). العصابات التي لم يتم وضع علامة تمثل البروتينات الخلفية غير محددة أو بروتينات معينة الطعم (انظر الجدول S3، وطرق أون لاين). (ب) تكوين KIAA0415 بروتين معقد تحليلها على النحو الذي حددته بندقية-LC-MS / MS (انظر الجدول S3). يظهر عدد من يقابل الببتيدات الكشف عن وتغطية تسلسل البروتين. يتم وضع علامة على النتائج للبروتينات الطعم في جريئة.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.g005


تحميل:
يطلب الرقم 6. interactors KIAA0415 لكفاءة HR-DSBR.

النسبة المئوية النسبية للGFP خلايا هيلا إيجابية، تطبيع للخلايا Rluc transfected، يظهر لesiRNAs المشار إليها. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري، * p <0.05، ** p <0.01.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.g006
KIAA0415 يتحور في المرضى الذين يعانون من الشلل النصفي التشنجي

وSPG11 شركاء التفاعل KIAA0415 وSPG15، المعروف أيضا باسم spatacsin وspastizin، يتم ترميز من قبل اثنين من الجينات التي ارتبطت مع الشلل النصفي التشنجي وراثي مع رقيقة الجسم الثفني (HSP-TCC) [46]، [47]. HSP-TCC هي مجموعة فرعية من وراثي الشلل النصفي التشنجي (HSP)، التي ورثتها الاضطرابات العصبية الناجمة عن انحطاط مساحات-القشرة في العمود الفقري مما يؤدي إلى الطرف السفلي التشنج. HSP هو شرط غير متجانسة إلى حد كبير مع ما لا يقل عن 46 مواضع تم تحديدها حتى الآن [48]. وقد اقترح التفاعل المحتمل للSPG11 وSPG15 على أساس أعراض عصبية مماثلة [49]، ولكن التفاعل المادي للSPG11 ولم يتم الإبلاغ عن SPG15 حتى الآن. بسبب التفاعل المادي للKIAA0415 مع هذه البروتينات اثنين المشفرة بواسطة الجينات المرتبطة HSP، قررنا أن التحقيق إذا يمكن ربط أي حالات HSP غير المبررة إلى حدوث طفرات في KIAA0415. التسلسل المباشر لKIAA0415 في 166 مريضا HSP لا علاقة لها، بما في ذلك 38 و 64 حالة مع نمط الوراثة المتنحية أو المهيمن و 64 حالات متفرقة (انظر طرق أون لاين)، حدد 7 معروفة و15 متغيرات جديدة، على التوالي. لم تعتبر معظم هذه المتغيرات المسبب للمرض، لأنها لم تؤثر على تسلسل البروتين، لم يتوقع أن تغيير الربط الصحيح، أو عثر عليها أيضا في كثير من الأحيان في عينات التحكم (الجدول S4). ومع ذلك، واحدة من هذه المتغيرات المحددة أدى إلى كودون وقف سابق لأوانه في موقف 527 (c.1413_1426del14 / p.L471LfsX56، الجدول S4) وكان غائبا في 158 القوقاز و84 الكروموسومات السيطرة شمال أفريقيا. وكانت الطفرة متخالف وجدت أية طفرة أو البديل أخرى في تسلسل ترميز KIAA0415 أو في المناطق التنظيمية في هذا المريض يبدو متقطعا (FSP-70-1). لم تكن هناك موضوعات أخرى من عائلة المتاحة لأخذ العينات وتم الكشف عن أية نسخة الاختلافات على الصبغي رقم 7 في المريض المصاب (بيانات غير منشورة)، ولكن إعادة ترتيب متخالف صغيرة أو طفرات في المناطق المكشوفة (الإكسونات غير معروفة أو إنترونات) قد نجا الكشف.
أكثر من المثير للاهتمام، وجدنا أيضا طفرة متماثل في شقيقان الفرنسية (FSP-083)، والذي لم يتم الكشف في 156 قوقازي و 242 الكروموسومات السيطرة شمال أفريقيا. في هؤلاء المرضى، وINDEL معقدة في اكسون 2 (ج [80_83del4؛ 79_84ins22].، الشكل 7C) يولد انزياح الإطار ووقف كودون التالية الأحماض الأمينية 29 (p.R27LfsX3، الشكل 7A). ومن المثير للاهتمام، والإدراج هو أربعة أمثال ناقص من CTGTAA تسلسل (A)، مما يدل على الحمض النووي بوليميريز انزلاق خلال توليف الحمض النووي باعتباره آلية لإدخال الطفرة. كل من المرضى المصابين قدم مع الشلل النصفي التشنجي التدريجي المرتبطة سلس البول منذ سن 50 و 49 على التوالي. كان الشلل MRI طبيعي ولكن لوحظت hyperintensities الشوكي في C3-C4 وC7 في واحدة. توفي كلا الوالدين في سن 72 و 77 على التوالي، لأسباب غير عصبية. أنها نشأت من قريتين المجاورة، ولكن لم يكن هناك زواج الأقارب المعروفة. ومع ذلك، أكد تحليل ثلاث علامات ثيقة الصغرية (D7S531، D7S517، وD7S1492) وفقدان تغاير (LOH) البحث باستخدام CYTO_12 المجهرية (بيانات غير منشورة) أن المنطقة متماثل في كل من المرضى المتضررين (7B الشكل).

تحميل:
الرقم 7. طفرة KIAA0415 في المرضى الذين يعانون HSP.

(A) تمثيل تخطيطي للهيكل KIAA0415 اكسون. وأشار موقع طفرة متماثل وأضعاف helicase المفترضة توقع (باللون الأخضر). (B) النسب من KIAA0415 طفرة في الأسرة FSP-083. تمثل رموز مربع الرجال. تمثل الدوائر النساء. وعبرت رموز المواد الميتة. رموز شغل تشير إلى الأفراد المتضررين. الأرقام أدناه الأفراد هي المرجعية الداخلية لكل فرد العينة. نجوم تشير موضوعات عينات. ويبين الفصل بين الطفرة و3 الصغرية علامات على الصبغي 7P المقبل لنسب، نسبة إلى وضعهم في Mbases. ونظرا لالأليلات من المكروية في أزواج قاعدة. M، طفرة. (C) Electropherograms من الطفرات KIAA0415. وأكد الانحراف متواليات من تسلسل بالوزن.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.g007

لمزيد من إثبات دور KIAA0415 في إصلاح الحمض النووي، قارنا حساسية العقاقير في خطوط الخلايا lymphoblast أنشئت من المريض يحمل طفرة KIAA0415 (FSP-083-4) والمريض يحمل طفرة في SPG15 (FSP-708-22 [50 ]) للسيطرة على خطوط الخلايا lymphoblast. لافت للنظر، كانت خلايا متحولة KIAA0415 معنويا (P <0.05) أكثر حساسية للعلاجات MMC وبليوميسين بالمقارنة مع أي من خطوط الخلايا التحكم (الشكل 8). بالإضافة إلى ذلك، كما أظهرت خط الخلية SPG15 حساسية خفيفة لهذه الأدوية، phenocopying النتائج الملاحظة في خلايا هيلا وU2OS.

تحميل:
الرقم 8. الحساسية من خطوط الخلايا lymphoblast لعوامل ضارة DNA.

(A) منحنيات النمو لسيطرة خلية lymphoblast خط MHU-2619 (خط الصلبة)، خط خلية تحمل KIAA0415 طفرة FSP-083-4 (الخط المنقط) من دون علاج المخدرات (خط أسود) أو العلاج MMC (رمادي فاتح )، يتم عرض. (B و C) خطوط الخلايا المشتقة من المرضى الذين يعانون من طفرة في KIAA0415 وSPG15 هي أكثر حساسية لDNA إتلاف المخدرات. ويظهر انخفاض خلايا قابلة للحياة (يوديد propidium وAnnexin V السلبي) في المئة (شريط رمادي) للخطوط الخلايا المشار إليها بعد العلاج MMC (B) والعلاج بليوميسين (C). * P <0.05.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.g008

مجتمعة، هذه التجارب التعرف KIAA0415 باسم الجينات الرواية، والذي تحور في المرضى الذين يعانون من HSP، وتوريط وجود صلة بين HSP وإصلاح الحمض النووي.

نقاش

باستخدام مكتبة esiRNA جيدا اتسم [16] أجرينا شاشة رني الجينوم على نطاق وحددت 61 الجينات التي بتكاثر انخفاض أو زيادة وتيرة إصلاح الحمض النووي في مقايسة لإعادة التركيب مثلي [17]. فحوصات ثانوية للعمليات ذات الصلة لإصلاح الحمض النووي ثم جاءت العديد من النتائج الأولية. ومن هنا، ونحن نقدم مجموعة البيانات التي يجب الإسراع في اكتشاف جينات جديدة مع أدوار في إصلاح الحمض النووي والظروف الطبية المرتبطة بها. وقد وصفت ثمانية عشر من 61 الجينات المرشحة في غيرها من الدراسات إصلاح الحمض النووي الثدييات على نطاق واسع [8]، [13]، [15]، [51]، مما يدل على فعالية الشاشة لدينا، ولكن تسليط الضوء أيضا أن استخدام مختلفة يمكن فحوصات كشف اللاعبين الرواية. وبالتالي، فإننا نتوقع أن تطوير DNA البديل المقايسات لتصليح شاشات رني سوف تكشف عن جينات إضافية المتورطين في إصلاح الحمض النووي. لدينا شاشة شاركنا في transfected في "DNA كاشف مدمرا،" I-SCEI، جنبا إلى جنب مع مشغلات إسكات esiRNA. وبالتالي، قد يكون غاب عن البروتينات مع نصف حياة طويلة في هذه الشاشة. المقايسات التي يتم فيها عرض DSB بعد مرور بعض الوقت و transfected الخلايا مع مشغلات إسكات يمكنها الكشف عن جينات إضافية تلعب دورا خلال إصلاح الحمض النووي.
على إعطاء الأولوية لتحقيق الجزيئي للبروتينات uncharacterized المحددة في الشاشة، قمنا بتوظيف النهج المعلوماتية الحيوية الهيكلي. استنادا إلى التنبؤ بأن KIAA0415 يمثل helicase المفترضة رواية نحن التحقيق هذا الجين في مزيد من التفاصيل. وضع علامات على الجينات باستخدام نهج TransgeneOmics كشف توطين النووية وكذلك حشوية والتفاعل الجسدي مع أربعة على الأقل البروتينات. وأظهرت التحقيقات الشركاء التفاعل مطلوبة أيضا اثنين على الأقل من هذه البروتينات لكفاءة HR-DSBR. ربما، هذه البروتينات تشكل مجمعا ما هو مطلوب لكفاءة HR-DSBR. وبالتالي، فإن مجمع تفقد نشاطها عند واحد من البروتينات ثلاثة المنضب.
اثنين من شركاء تفاعل KIAA0415 يتم ترميز الجينات التي ترتبط مع الشلل النصفي التشنجي. هذه النتيجة دفعت بنا إلى دراسة ما إذا كانت الطفرات KIAA0415 يمكن أن يفسر التشنج في عينات من المرضى لا ترتبط مع الطفرات في أي من الجينات الشلل النصفي التشنجي المعروفة. نفيدكم طفرة متماثل في KIAA0415، مسؤولة عن الشلل النصفي التشنجي لوحظ في شقيقان. وبالتالي، فإننا تحديد KIAA0415 باعتباره الشلل النصفي التشنجي الجينات رواية المرتبطة بها. وبناء على هذه الحقائق، فإننا نقترح إعادة تسمية KIAA0415 إلى SPG48 وفقا لتسمية HUGO. حقيقة أن ثلاثة البروتينات التي تشكل نتيجة معقدة البروتين في عواقب المظهري مماثلة تقول أن المجمع كله تبذل وظيفة هامة، وهي بالانزعاج عند واحد من البروتينات مفقود أو غير وظيفية. ولذلك سيكون من المثير للاهتمام أن التحقيق ما تبقى من شركاء التفاعل، C20orf29 وDKFZp761E198، للطفرات محتملة في المرضى الذين يعانون HSP، على الرغم من أنها لا تعين معروف HSP مواضع [49]. على الرغم من أن فقط أظهرت حالة واحدة، وكانت خطوط الخلايا المشتقة من المريض يحمل طفرة SPG48 أكثر حساسية للDNA تضر المخدرات من الخلايا السيطرة، مؤيدة لدور SPG48 في إصلاح الحمض النووي. للأسف، كانت المواد من المرضى الآخرين مع الطفرات SPG48 غير متوفرة. ومع ذلك، فإننا نقترح أن في المرضى HSP في المستقبل سيتم عرضها للطفرات في SPG48 وأن يتم فحص الخلايا من هؤلاء الأفراد لإصلاح العيوب DNA.
وقد ارتبطت الجينات الطافرة في HSP مع العديد من الوظائف البيولوجية، بما في ذلك النقل داخل الخلايا، الاستطلاعية محور عصبي، وظائف الميتوكوندريا، استقلاب الكوليسترول، وتشكيل المايلين / الاستقرار، والنشاط chaperonin [48]. وبناء على النتائج التي توصلنا إليها، نقترح أن HSP قد يكون أيضا نتيجة لإصلاح الحمض النووي ضعف، مضيفا HSP إلى قائمة متزايدة من الأمراض العصبية الناجمة عن القصور إصلاح الحمض النووي [4]، [5]، [7]، [8]. في اتفاق مع هذه الفرضية، وقد تم مؤخرا ذكرت SPG11 أن فسفرته على الحمض النووي من التلف عن طريق الصراف الآلي أو ATR [51]. سواء SPG48 (والبروتينات المرتبطة بها) هو عنصر المباشر لمسار HR-DSBR أو بصورة غير مباشرة مرتبطة إصلاح الحمض النووي يبقى أن المنشأة. يظهر تحليل الكيمياء الحيوية في المجال helicase المفترضة من SPG48 أن تكون نقطة دخول جذابة إلى اكتساب رؤى الآلية في وظيفة إصلاح الحمض النووي (ق) من SPG48.
وقد زاد التقدم التكنولوجي في رني فحص السرعة التي بيانات المظهري يمكن الحصول عليها. ومع ذلك، وتفسير ينجم عن ذلك من علاقات التركيب الوراثي، النمط الظاهري لا يزال تحديا، والنهج التي تساعد على فك مطلوبة بكثرة البيانات الفرز. النهج التي تحليل البيانات المظهرية من شاشات رني لا علاقة لها والتي تجمع بين phenotypic- مع البيانات localization- والبروتين [52]، [53] وقد استخدمت بنجاح لألبس الحذاء تحليلات وظيفة النمط الظاهري ل. هنا، نحن استكشاف إمكانية الجمع بين بيانات فحص رني مع النهج المعلوماتية الحيوية الهيكلية. وتوضح النتائج أن هذا المزيج يولد معلومات قيمة، مما يساعد على إعطاء الأولوية لدراسات المتابعة من الجينات المرشحة uncharacterized. ونحن نتصور أن تصميم خط أنابيب التلقائي لتحليل السمات الهيكلية والوظيفية المحتملة وراء التشابه تسلسل البروتين وزيادة تسريع توصيف الجينات التي تم تحديدها في شاشات رني. في المستقبل، سيكون من المهم للجمع بين مختلف "OMICS" والمعلوماتية الحيوية النهج لفهم إصلاح الحمض النووي على مستوى النظم ومواصلة تسريع اكتشاف الجينات ذات الصلة لعلم الأمراض البشرية.

المواد والأساليب

جيل من هيلا DR-GFP خطوط الخليوي

عشرة ميكروغرام من DR-GFP بناء [17] و transfected إلى 2.5 × 10 6 خلايا هيلا باستخدام 12 ميكرولتر محسن (QIAGEN) و 14 ميكرولتر Effectene (QIAGEN) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. وقد تم اختيار خطوط الخلايا مستقرة مع 3 ميكروغرام / مل بوروميسين (سيغما الدريتش) واستنساخ واحدة تم الحصول عليها عن طريق FACS الفرز على FACSAria (BD العلوم البيولوجية). تم توسيع المستعمرات المستمدة من الحيوانات المستنسخة الفردية واختبار لسلوكهم بعد ترنسفكأيشن مع البلازميد ترميز نوكلياز داخلية I-SCEI. وقد تم اختيار خط الخلية مع الخلايا إيجابية GFP عمليا أي قبل العلاج I-SCEI وعدد كبير من الخلايا إيجابية GFP بعد العلاج I-SCEI للعرض على الشاشة.
التحليل المناعي المجهري

وقد نمت الخلايا على coverslips الزجاج وثابتة مع 3٪ امتصاص العرق (PFA) كما هو موضح سابقا [44]. أجريت stainings المناعي مع الماوس الرئيسي لمكافحة GFP الأضداد (روش تشخيص، 1:4،000 تمييع) وحمار الثانوي الأضداد المضادة للماوس مترافق إلى Alexa488 (المسابر الجزيئية، 1:500 تمييع). كان counterstained الجينوم الحمض النووي مع إطالة الذهب antifade كاشف تحتوي على دابي (إينفيتروجن). تم الحصول على الصور على Axioplan II مجهر (زايس) تعمل من خلال MetaMorph (الأجهزة الجزيئية).
الغربية تحليل وصمة عار

تم إجراء تحليل لطخة غربية كما هو موضح سابقا [52]. في هذه الدراسة تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: الماوس مكافحة GFP (روش تشخيص، 1:4،000 تمييع)، والماوس مكافحة DM1alpha تويولين (MPI-CBG جسم مرفق، 1:50،000 تمييع)، والأرنب مكافحة هيستون H3 (Abcam 1:25،000 تمييع).
الجينوم على نطاق esiRNA الشاشة

وقد وصفت المكتبة esiRNA يعملون في أماكن أخرى [16]، [54].لشاشة I-SCEI التعبير البلازميد [17] وشارك في مع transfected esiRNAs الفردية بطريقة العريض. لفترة وجيزة، كان pipetted 50 نانوغرام لكل esiRNA في 5 ميكرولتر TE العازلة إلى 384 جيدا لوحات زراعة الأنسجة (BD العلوم البيولوجية) وتخزينها في -20 ° C. تحتوي كل لوحة أربعة esiRNAs ضد Rad51 عن السيطرة الايجابية (في المواقف C3، C21، M5، M18) و 12 esiRNAs استهداف renilla luciferase المراسل (Rluc) كما المراقبة السلبية (في المواقف C4، D3، D4، C22، D21، D22، M6، N5، N6، M19، N18، N19 كما هو مبين في الشكل 1C). تم الاستغناء عن استخدام موزع متعددة جيدا (WellMate، الحرارية العلمية) خليط من البلازميد I-SCEI (12.75 نانوغرام / جيد) ومحسن (0.142 ميكرولتر / جيد) في 5 ميكرولتر / جيد EC العازلة (QIAGEN) ونسج لفترة وجيزة في هيراوس Multifuge 4KR (الحرارية الكترون شركة). بعد مرور فترة الحضانة لمدة 5 دقائق، Effectene (0.12 ميكرولتر / جيد) مخففة في 5 ميكرولتر / جيد وأضيف EC العازلة إلى كل بئر وتم نسج لوحات لفترة وجيزة مرة أخرى. وقد حضنت الخليط ترنسفكأيشن لمدة 5 دقائق للسماح تشكيل تعقيدا. في هذه الأثناء كانت تحصد خلايا هيلا تحمل مراسل بناء DR-GFP، عدها، والمخففة لتركيز النهائي من 40 خلية / ميكرولتر في DMEM (إينفيتروجن) التي تحتوي على 12.5٪ الجنين مصل بقري (إينفيتروجن). وأضاف خمسين ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل بئر باستخدام موزع متعددة جيدا (Wellmate، الحرارية العلمية). من أجل منع التبخر، ومختومة لوحات مع لوحة ختم رقائق تنفس (كورنينج) والمحتضنة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. تم استبدال المتوسطة 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. بعد غسلها 72 خلايا ساعة أخرى مع برنامج تلفزيوني وفصل بإضافة 15 ميكرولتر / جيد التربسين / EDTA (إينفيتروجن). بعد تم إصلاح 25 دقيقة الخلايا بإضافة 15 ميكرولتر / جيد 3٪ PFA وتخزينها لا تزيد عن 48 ساعة عند 4 درجات مئوية. ويعاير الخلايا مع FACSCalibur (BD العلوم البيولوجية) مجهزة الإنتاجية عينات العليا (BD العلوم البيولوجية). تم الحصول على البيانات وتحليلها باستخدام CellQuest برو (BD العلوم البيولوجية).
تقييم ضرب

حسبت Z-درجات النسب المئوية للخلايا إيجابية GFP باستخدام المعادلة التالية: Z = (س-μ) σ -1 مع: س - النسبة المئوية للخلايا إيجابية GFP. μ - يعني النسبة المئوية للخلايا إيجابية GFP. σ - الانحراف المعياري من عدد الخلايا إيجابية GFP. في الشاشة الرئيسية يعني وحسبت الانحرافات المعيارية بشكل منفصل لكل لوحة على جميع العينات على لوحة باستثناء الضوابط. تم حساب Z-علامات لكل esiRNA وبلغ متوسط ​​التكرارات. تم استخدام ترنسفكأيشن من esiRNA استهداف Rad51 عن السيطرة الإيجابية وكمرجع لأداء الاختبار. التي كانت esiRNAs متوسط ​​الدرجة المعيارية أدناه -2 أو أكثر من 2 كانت تعتبر الزيارات الأولية (الجدول S1).
في مزيد من التجارب التحقق من صحة، وحسبت ض عشرات على أساس المتوسط ​​والانحراف المعياري للسيطرة سلبية (Rluc ترنسفكأيشن). التي كانت EsiRNAs متوسط ​​الدرجة المعيارية لمدة 4 مكررات أدناه -2 أو أكثر من 2 لأحد esiRNA وتحت -1.5 أو أكثر من 1.5 لesiRNA الثانية تم تصنيفها على أنها يضرب التحقق من صحتها. يتم عرض تسلسل التمهيدي لesiRNAs المستخدمة في الجدول S5.
تم إجراء التحليل الجيني تخصيب باستخدام أدوات التحليل النمر (http://www.pantherdb.org/tools/).
سيسبلاتين / MMC / IR حساسية الفحص

كان pipetted خمسة عشر نانوغرام لكل esiRNA مخففة في 5 ميكرولتر غروب MEM (إينفيتروجن) في 384 جيدا لوحات زراعة الأنسجة (غرينر). تم تخفيفه Oligofectamine 0.2 ميكرولتر (إينفيتروجن) مع 4.8 ميكرولتر غروب MEM، المحتضنة لمدة 5 دقائق وpipetted إلى كل بئر من لوحة. حضنت خلطات لمدة 20 دقيقة للسماح أضيفت تشكيل معقد و 1،000 خلايا في 40 ميكرولتر المتوسطة إلى كل بئر. أربع وعشرين ساعة بعد ترنسفكأيشن سيسبلاتين (100 نانوغرام / مل) أو MMC (100 نانوغرام / مل) وأضيفت لمدة 1 ساعة أو تعرض الخلايا إلى 10 غراي IR. تم غسلها خلايا بعناية مع برنامج تلفزيوني وأضيف الوسيلة الجديدة. بعد الخلايا كانت ثابتة إضافية 48 ساعة مع -20 ° C الميثانول البارد لمدة 20 دقيقة، وغسلها مرتين مع برنامج تلفزيوني، وسدت مع عازلة تمنع (0.2٪ الجيلاتين من الماء البارد جلد السمك (سيغما الدريخ كيمي) في PBS) لمدة 5 دقائق. كانت ملطخة نواة الخلية مع دابي (1 ميكروغرام / مل)، وحفظت الخلايا مع 0.02٪ أزيد الصوديوم في برنامج تلفزيوني. تم الحصول على الصور على مجهر أوليمبوس IX81 (أوليمبوس) وتم تحديد أعداد الخلايا باستخدام برنامج التحليل Scan∧R (أوليمبوس). وتكررت كل ضربة قاضية 3 مرات. وتمت مقارنة أعداد الخلايا مع وبدون وكلاء ضررا DNA لtransfections Rluc.
GammaH2AX الفحص

تم علاج خلايا هيلا مع 10 غراي IR 48 ساعة بعد esiRNA ترنسفكأيشن والثابتة 1 ساعة أو 6 ساعات في وقت لاحق. كانت ملطخة الخلايا مع الأجسام المضادة الفوسفات-H2AX (استنساخ JBW301، شمالي ولاية التكنولوجيا الحيوية، 1:600 ​​تمييع) ومع حمار لمكافحة فأر TxRed الضد مترافق (المسابر الجزيئية، 1:400 تمييع). كانت ملطخة الحمض النووي مع دابي (1 ميكروغرام / مل). حفظت الخلايا مع 0.02٪ أزيد الصوديوم في برنامج تلفزيوني والصور تم الحصول على مجهر أوليمبوس IX81 وتحليلها بواسطة تحليل Scan∧R البرمجيات (أوليمبوس). وتكررت كل ضربة قاضية 3 مرات. وتمت مقارنة النسب المئوية للخلايا إيجابية gammaH2AX إلى transfections Rluc. ص حسبت القيم التي كتبها الطالب ر الاختبار.
الهيكلية المعلوماتية الحيوية طرق

فشل التحليل القائم على التسلسل (انفجار) لتحديد أي تناظر تسلسل ذات دلالة إحصائية بين KIAA0415 وأي بروتين يتميز سابقا. طبقت أضعاف تقنيات الاعتراف للبحث عن homologies الهيكلية المحتملة للKIAA0415 مع هياكل البروتين المعروفة. تم استخدام خوارزمية خيوط ProHit (ProCeryon العلوم البيولوجية) للبحث عن التشابه الهيكلي للتسلسل KIAA0415 uncharacterized مع هياكل البروتين من بروتين بروكهافن بنك المعلومات (PDB). وقد أجريت الحسابات خيوط مع المعلمات وظائف التهديف كما نشرت سابقا [55]. تم استخدام مكتبة أضعاف تتكون من 19.961 سلاسل البروتين يمثل PDB في هوية تسلسل 95٪. تم إنشاؤها ثلاثي الأبعاد (3D) نماذج لKIAA0415 بواسطة خيوط تسلسل من خلال كل حظيرة المكتبة أضعاف. التفتيش على تغطية أضعاف، موقف الثغرات والمحتوى في التحالفات تسلسل إلى بنية الحصول عليها، جنبا إلى جنب مع تحليل بنية التنبؤ الثانوية التي تم الحصول عليها عن طريق KIAA0415 PredictProtein (http://www.predictprotein.org/ استخدمت) لتجاهل ممكن ايجابيات كاذبة في أعلى طيات التهديف. تم بناء نموذج ثلاثي الأبعاد للKIAA0415 على أساس التحالفات الترابط التي تم الحصول عليها بثقة عالية توقع طيات وأربعة مبان قالب (PDBId: 2d7d، 2p6r، 1gm5، و2eyq) باستخدام صانع التماثيل في ستوديو ديسكفري (Accelrys V1.7). الالتحام اليدوي للADP والمغنيسيوم 2+ تم على الناتج نموذج KIAA0415 3D على أساس الهياكل الأشعة السينية 2d7d و1gm5. وقد تم صقل مجمع تم الحصول عليها مع AMBER 10 [56]. وأعقب الخطوة الأولى من الطاقة التقليل من قبل 1000 دورات أشد النسب و 500 دورات المترافقة مع التدرج القيود قوة التوافقي على ذرات البروتين 3000 دورات من أصل أشد ودورات 3000 من المكورات التدرج دون قيود. ثم يسخن النظام من 0 إلى 300K لمدة 10 ملاحظة. وأعقب خطوة موازنة من 30 ملاحظة في 300K قبل 10 نانوثانية MD المدى الإنتاجي. مجال القوة ff03، استخدمت شروط الحدود دورية في الضغط المستمر مع انجيفين درجة الحرارة اقتران وBerendsen ضغط اقتران، TIP3P المذيبات صريح، counterions، 8 Å قطع للتفاعلات غير المقيد، والخوارزمية هزة للهيدروجين.
BAC Transgeneomics

تم تنفيذ BAC recombineering وتوليد خطوط الخلايا BAC المعدلة وراثيا كما هو موضح سابقا [44]، [57]. يتم تقديم قائمة بجميع البكالوريا والاشعال المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول S6.
مناعي وتحليل الطيف الكتلي

وتم استخدام الأجسام المضادة الماعز المضادة للGFP (MPI-CBG جسم مرفق) ثبتوا على بروتين G-sepharose و (GE للرعاية الصحية) أو GFP-فخ (Chromotek) للمناعي [44]، [52]. الجلايسين eluated KIAA0415-LAP وSPG11-LAP المجمعات تم تحليلها على الفضة ملطخة SDS PAGE. وقد شرائح رفعه هضمها في جل وتحليلها بواسطة nanoLC-MS / MS على LTQ (الحرارية فيشر العلمية) كما ذكرت سابقا [58]، [59]. واستخدمت eluates الجلايسين من KIAA0415-LAP، KIAA0415-NFLAP، SPG11-LAP، وimmunopurifications DKFZp761E198-LAP للهضم في حل وتحليلها بواسطة بندقية-LC-MS / MS على LTQ Orbitrap (الحرارية فيشر العلمية) [60]. واعتبرت البروتينات التي تم تحديدها في أكثر من 15٪ من 193 immunoprecipitations مستقلة أجريت في مشاريع التعاون الجارية من الطعوم لا علاقة لها خلفيات المشتركة ومواصلة استبعاد.
تجزئة الخلية

تم تنفيذ تجزئة الخلية مع ProteoExtract عدة المتاحة تجاريا (Novagene، ميرك العلوم البيولوجية) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
المرضى المواد

اخترنا 166 حالة المؤشر غير ذات صلة مع الشلل النصفي التشنجي تشخيص وفقا لمعايير هاردينغ [61]. كان 109 شكل نقي من المرض، وكان 57 شكل معقدة متداخلة جزئيا مع النمط الظاهري نموذجي SPG11. وكان من بينهم 64 مريضا مؤشر من الأسر التي لديها الميراث المهيمن (متوسط ​​العمر عند بداية: 27.0 ± 16.6 ص)، 38 مريضا مؤشر والميراث متوافق مع مقهورة (متوسط ​​العمر عند بداية: 25.6 ± 19.9 ص)، و 64 مريضا مع عدم وجود تاريخ عائلي للمرض (متوسط ​​العمر عند بداية: 31.2 ± 16.9 ص). كان معظم المرضى الفرنسية = 137)، في حين نشأت بقية المرضى من بلدان أخرى في أوروبا = 16)، وشمال أفريقيا = 8)، أو في أي مكان آخر = 5).
وافقت هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات المحلية (موافقة رقم 03-12-07 من COMITE الاستشاري لصب لا حماية قصر Personnes ET LA بحوث Biomédicale باريس نيكر إلى الدكاترة A. الدر وA. بريس). أبلغت وتم توقيع موافقات مكتوبة من قبل جميع الأعضاء المشاركين في الأسر قبل جمعت عينات الدم لاستخراج الحمض النووي. أجريت جميع التقييمات السريرية وفقا للبروتوكول التي وضعتها الشبكة الأوروبية والمتوسطية لالإنحطاط مخيخي شوكي (SPATAX، المنسق: الدكتور A. الدر) التي تضمنت: لمحة تاريخية كاملة الطبي والفحص، تقدير العمر عند بداية من قبل المريض، مراقبة علامات اضافية العصبية، electroneuromyographic (ENMG) دراسات، والتصوير بالرنين المغناطيسي الدماغ، عندما يكون ذلك ممكنا. تم تقييم الإعاقة على مقياس 7 نقاط كما هو موضح سابقا [62]، [63].
الطفرات في SPAST، SPG3، SPG6، وSPG42 استبعدت سابقا في معظم المرضى مؤشر لنقل المهيمن التسلسل المباشر وتعدد تعتمد على ربط التحقيق التضخيم في حالة SPAST وSPG3 [64] وبيانات غير منشورة. بين المرضى المتنحية وراثي متفرقة، تم استبعاد طفرات في CYP7B1 / SPG5 الجينات في معظم المرضى [63] في حين تم استبعاد SPG11 وSPG15 الطفرات في جميع أشكال مقهورة معقدة [50].
الكشف عن الطفرات

بكل exons الترميز من KIAA0415 الجين (المورثة Ensembl ID: ENSG00000164917) تم تضخيمها وتقاطعات لصق عن طريق PCR على Thermocycler 9700 (النظم البيولوجية التطبيقية، فوستر سيتي، كاليفورنيا) باستخدام بادئات محددة (انظر الجدول S7). والتسلسل 3.1 كيلو بايت في 3 "و 1.5 كيلو بايت على-UTRs 5'أيضا في المرضى الذين يعانون من انتقال مقهورة يحمل البديل متغايرة واحد. والتسلسل في amplicons في كلا الاتجاهين باستخدام الكيمياء BIGDYE V3 في التسلسل ABI3730 الآلي (النظم البيولوجية التطبيقية) على النحو الموصى به من قبل المورد. تم استخدام V2.6 seqscape (النظم البيولوجية التطبيقية) برنامج لتسليط الضوء على الاختلافات النوكليوتيدات بالمقارنة مع التسلسل الطبيعي للإجماع على حد سواء الجينات. في FSP70 الأسرة، وأكد طفرة بعد subcloning من المنتجات PCR في pcDNA3.1 / V5-صاحب TOPO TA ناقلات باستخدام البكتيريا TOP10 وفقا لتوصيات الشركة الصانعة (إينفيتروجن) والتسلسل المباشر للا يقل عن 5 استنساخ مستقلة لكل من الأليلات.
بعد تحديد البديل، reamplification وresequencing تم إجراء منهجي. تم التحقق من الفصل بين الطفرات / الأشكال مع المرض عن طريق التسلسل المباشر في أفراد الأسرة الإضافية التي كانت متوفرة عينات من الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك، تم عرض 79 و 121 موضوعات القوقاز وشمال أفريقيا صحية لا علاقة لها تقييم وتيرة التغيرات النوكليوتيدات جديدة. من أجل تقدير الحفظ التطوري، تم تحميلها تسلسل الجيني لأنواع مختلفة من متصفح الجينوم Ensembl (www.ensembl.org) والانحياز باستخدام خوارزمية ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index هتمل). تم اختبار جميع المتغيرات بصورة منهجية من حيث تأثيرها على الربط تم اختبار الآثار المتوقعة للتغيرات مغلطة باستخدام فرزت وPOLYPHEN في http://sift.jcvi.org/www/SIFT_seq_submit2.html وhttp://genetics.bwh.harvard.edu/pph/.
Lymphoblast خطوط الخليوي

وقد تم الحصول على خطوط الخلايا من المرضى عن الإصابة بفيروس ابشتاين بار للفيروسات (الجدول S8). تم مثقف Lymphoblast في RPMI المتوسطة تستكمل مع 1٪ من ركلة جزاء / بكتيريا، 2 مم L-الجلوتامين، 10 ملي HEPES، 1٪ Fungizone، و 20٪ FCS. كانت مطلية 200،000 الخلايا في 6 لوحات جيدا ومثقف بدون أو مع 10 نانوغرام / مل MMC أو تعريضها إلى 10 ميكروغرام / مل بليوميسين لمدة 1 ساعة. تم رصد نمو الخلايا يوميا عن طريق عد الخلايا السلبية الزرقاء التريبان باستخدام عداد الخلية الكونتيسة الآلي (إينفيتروجن). بعد أربعة أيام الحضانة كانت ملطخة 100،000 الخلايا مع FITC Annexin V Appoptosis كيت II (BD العلوم البيولوجية)، يليه FACS (BD العلوم البيولوجية) التحليلات التالية بروتوكول الشركة المصنعة. وقد أجريت تجارب مرتين في مكررة.

دعم المعلومات

الرقم S1.

نموذج 3D المجال KIAA0415 SF2 (أ) و قطعة RMSD على طول محاكاة MD (ب).
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.s001
(3.81 MB EPS)

الرقم S2.

KIAA0415 ضربة قاضية لا تؤثر على مستويات التعبير I-SCEI.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.s002
(0.69 MB EPS)

الرقم S3.

التفاعل البروتينات للبروتين معقد KIAA0415 الأساسية.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.s003
(0.89 MB EPS)

الجدول S1.

بيانات فحص رني الابتدائي. الأحمر، esiRNAs إنخفاضا وتيرة إعادة التركيب مثلي أدناه متوسط ​​ض نتيجة -2. الخضراء، esiRNAs أن زيادة وتيرة إعادة التركيب مثلي فوق متوسط ​​الدرجة المعيارية 2. نا، غير متوفرة.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.s004
(3.90 MB XLS)

الجدول S2.

النتائج خيوط.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.s005
(0.02 MB XLS)

الجدول S3.

البروتينات التي تم تحديدها من قبل nanoLC-MS / MS وبندقية-LC-MS / MS بعد immunoprecipitations. واعتبرت البروتينات يضرب ثقة عندما يتم تحديدها مع ثلاثة على الأقل من الببتيدات مع أيونات التميمة يسجل أكثر من 20.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.s006
(0.06 MB DOC)

الجدول S4.

قائمة المتغيرات والطفرات وجدت في KIAA0415.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.s007
(0.03 MB XLS)

الجدول S5.

تسلسل التمهيدي تستخدم لتوليد esiRNAs الثانوي. AR، راثي مقهور؛ AD، جسمية مهيمنة. مكتب التخطيط الاستراتيجي، وحالات متفرقة. القدرة على الربط ESE، Exonic. غ، لا ينطبق، dbSNP، النووية المنفردة الأشكال قاعدة البيانات في http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.s008
(0.04 MB XLS)

الجدول S6.

استنساخ BAC وتسلسل التمهيدي تستخدم لBAC العلامات.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.s009
(0.02 MB XLS)

الجدول S7.

قائمة الاشعال المستخدمة في الكشف عن الطفرات KIAA0415.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.s010
(0.02 MB XLS)

الجدول S8.

خطوط الخلايا Lymphoblast المستخدمة في التجارب حساسية.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.s011
(0.01 MB DOC)

S1 الفيديو.

الديناميات الجزيئية محاكاة لالمفترضة نطاق helicase C في KIAA0415 (انظر طرق الآن). ويرد البروتين في تمثيل الكرتون. وتظهر المناطق helicase عزر SF2 في الألوان: I باللون الأبيض، IA باللون الأصفر، والثاني باللون البرتقالي، والثالث باللون الأحمر، والرابع في السماوي، وV باللون الأزرق. ADP وثلاثة المخلفات (E379، D481، وE652) تنسيق المغنيسيوم 2+ ترد في العصي والملونة عن طريق نوع ذرة. ملغ 2+ يمثله المجال الأخضر.
دوى: 10.1371 / journal.pbio.1000408.s012
(1.56 MB MPG)

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس