عرض مشاركة واحدة
  #15  
قديم 11-22-2015, 11:12 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي CAG كرر التوسع في مرض وراثي جسمي النقي مشلول الشلل النصفي مرتبط الكروموسوم 2p21-P24

 


CAG كرر التوسع في مرض وراثي جسمي النقي مشلول الشلل النصفي مرتبط الكروموسوم


2p21-P24



وقد تم تحديد CAG تكرار التوسعات كما الطفرات المسببة للأمراض ديناميكية في المناطق ترميز الجينات في العديد من الاضطرابات العصبية يورث، بما في ذلك نخاعي بصلي ضمور العضلات، مرض هنتنغتون،-pallidoluysian مسنني حمراوي ضمور، النخاعي المخيخي نوع ترنح 1 و 2 و 6 و Machado- جوزيف المرض. يتم تحويل CAG تكرار التوسعات لمساحات polyglutamine ممدود وزيادة حجم الجهاز polyglutamine يرتبط بترقب، ميزة أساسية، وينظر في كل هذه الأمراض. وراثي جسمي الشلل النصفي التشنجي النقي (ADPSP) هو اضطراب تنكسي للجهاز الحركي المركزي يتميز سريريا من قبل التشنج ببطء تدريجي ومتواصل في الساقين، فرط المنعكسات وعلامة بابنسكي. مثل تكرار الأمراض CAG أنشأت يتميز ADPSP من قبل كل من الاختلاف بين وداخل الأسرة والترقب. باستخدام كرر التوسع كشف (RED) طريقة، قمنا بتحليل 21 الأفراد المتضررين من ست عائلات الدنماركية مع المرض مرتبط الكروموسوم 2p21-P24. وجدنا أن 20 من 21 أفراد المتضررين أظهر CAG تكرار التوسعات مقابل اثنين من 21 أزواج الأصحاء، مما يدل على وجود ارتباط بقوة ذات دلالة إحصائية بين حدوث توسع تكرار والمرض (اختبار فيشر، P <10 -5) مما يدل على أن تكرار CAG وتشارك التوسع يفترض بمثابة طفرة ديناميكية في ADPSP مرتبطة الكروموسوم 2p21-P24. ويقدر حجم التوسع لتكون ≥60 CAG تكرار نسخة في الأفراد المتضررين. توسيع CAG تكرار ومن المرجح جدا ترجمتها وأعرب كما يتضح من الكشف عن البروتين التي تحتوي على polyglutamine في المريض ADPSP.
مقدمة

الشلل النصفي التشنجي وراثي هو اضطراب تنكسي للجهاز الحركي المركزي يتميز سريريا من قبل التشنج ببطء تدريجي ومتواصل في الساقين، فرط المنعكسات وعلامة بابنسكي. اعتمادا على وجود علامات سريرية أخرى المسيطرة على التعاون اضطراب تقليديا ينقسم إلى مجمع وشكل نقي (1).
وراثي جسمي الشلل النصفي التشنجي النقي (ADPSP) يتميز سريريا في أواخر بداية، والتباين المشترك بين وداخل الأسرة والترقب (2). تم تعيين ثلاثة مواضع مختلفة لADPSP إلى الكروموسومات 14q11.2-q24.3 (موضع SPG3) (3)، 2p21-P24 (موضع SPG4) (4) و15q11.1 (موضع SPG6) (5) ؛ ومع ذلك، فإن المظاهر السريرية تكاد تكون متطابقة في الأسر مع موقع مختلف للجين المرض.
ترتبط CAG تكرار التوسعات مع التقدمية، في وقت متأخر من الأمراض التنكسية بداية الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك نخاعي بصلي ضمور العضلات (SBMA) (6)، مرض هنتنغتون (HD) (7)، النخاعي المخيخي نوع ترنح 1 (SCA1) (8)، وترنح النخاعي المخيخي نوع 2 (SCA2) (9)، النخاعي المخيخي نوع ترنح 6 (SCA6) (10)، ماتشادو يوسف المرض (MJD) (11)، ومسنني حمراوي-pallidoluysian ضمور (DRPLA) (12). تقع يكرر CAG في المنطقة الترميز من الجينات المعنية والتوسعات هي من 36 إلى> 100 تكرار النسخ في الأفراد المتضررين؛ الأليلات عادية تحتوي على ما يصل إلى 40 تكرار النسخ، وترك مجموعة غير محدد من 36-40 حيث قد يحدث انخفاض انتفاذ (13). في SCA6، ومع ذلك، فإن مجموعة من (CAG) n هو 21-27 بينما الأليلات العادية تحتوي على 4-16 وحدة تكرار (10). هناك علاقة عكسية بين طول التوسع CAG والعمر عند بداية وجميع هذه الأمراض تظهر تباين ملحوظ في الأعراض وغالبا الحاضر في وقت متأخر. كما يتميز ADPSP من الاختلاف نفسه، كنا تحرض على دراسة ADPSP فيما يتعلق بحضور CAG تكرار التوسعات. استخدمنا RED (كرر التوسع الكشف) طريقة (14)، الذي يحدد تكرار التوسعات المحتملة المرضية في الجينوم، لتحليل لحدوث CAG تكرار التوسعات في الأفراد المتضررين من ست عائلات الدنماركية مع ADPSP مرتبطة الكروموسوم 2p21-P24.

النتائج

تحليل الربط الجيني تقتصر موضع ADPSP إلى الكروموسوم 2p21-P24 (SPG4) في كل من الأسر الدنماركية ستة (2). تم إجراء تحليل الأحمر على عينات من 21 أفراد المتضررين من ست عائلات مختلفة. والضوابط العادية قمنا بتحليل 21 الزوجين صحي وشمل عينة من مريض يعاني من ضمور الأحداث تأتر العضل كما تحكم إيجابية.
كانت الضوابط العادية كل فرقة من 72 سنة مضت ولكن ثلاثة منهم تحسنت RED المنتجات> 72 نقطة أساس في الحجم. كان اثنان من أفراد منتجات الحمراء من 180 سنة مضت واحد فرد منتج الأحمر من 108 سنة مضت.
أن تكون فوق عتبة المرضية من وحدات تكرار 36 CAG تنطبق على معظم الأمراض العصبية المذكورة (+6 - 11، 12)، ولكن لا يزال في الطرف الأدنى من هذه التوسعات، حددنا المنتجات RED ≥144 بي بي ~48 تكرار نسخ كما توسعت الأليلات. أظهر عشرين مريضا التوسعات كرر مقابل اثنين من 21 الضوابط العادية (10٪)، مما يدل على وجود ارتباط بقوة ذات دلالة إحصائية بين حدوث توسع تكرار والمرض (اختبار فيشر، P <10 -5) الذي يشير إلى أن تكرار توسيع CAG ويشارك في ADPSP مرتبطة الكروموسوم 2p21-P24. المقايسات من فرد واحد المتضررين مع النمط الفرداني المرض فشلت مرارا وتكرارا لإعطاء المنتج الحمراء للكشف وبالتالي فقد تم استبعاده من التحليل الإحصائي. كان جميع الأفراد المتضررين السريري داخل الأسرة نفس النمط الفرداني المرتبطة بهذا المرض (الشكل 1).
لتقدير حجم تكرار المرضية في ADPSP أدرجنا عينات من المريض MJD مع وحدات تكرار 72 CAG في أليل المرض على النحو الذي يحدده تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) التحليل باستخدام الاشعال MJD 25 و 52 MJD (11). وكان المنتج الحمراء للمريض MJD 216 سنة مضت ~72 CAG تكرار نسخ المقابلة لتقصي عن طريق تحليل PCR (الشكل 2، 2 لين). على افتراض أن وجود ارتباط مماثل موجود في ADPSP مرتبطة الكروموسوم 2p21-P24 وقد قدر التوسع تكرار في ADPSP أن يكون لا يقل عن 180 سنة مضت ~60 CAG تكرار النسخ كما كانت هذه الفرقة موجودة في جميع الأفراد المتضررين.
كما هو مبين في الشكل 2، وكان هناك اختلاف في حجم أعلى المنتجات الوزن الجزيئي الكشف داخل كل أسرة. ومع ذلك، لم يكن هناك ارتباط واضح بين حجم المنتج والعمر عند بداية. في الممرات 4 و 5 فرق إضافية> 252 و> 216 نقطة أساس، على التوالي، وكشف ولكن مع شدة انخفاض مقارنة مع أقل العصابات.
التحقيق في ما إذا ترجمت تكرار CAG إلى polyglutamine تحتوي على البروتينات اختبرنا lymphoblastoid خط الخلية (LCL) مقتطفات من البروتين واحد ADPSP المريض، واحد HD المريض واثنين من الضوابط العادية على لطخة غربية. عندما بحث مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة 1C2، الذي يعترف مساحات polyglutamine كبيرة، وهو بروتين ذات وزن جزيئي> تم الكشف عن 350 كيلو دالتون في استخراج ADPSP LCL ولكن ليس في LCL مقتطفات من الضوابط العادية (الشكل 3). شوهد البروتين كيلو دالتون ~240 في جميع العينات الثلاث. استخدمت كيلو دالتون huntingtin 350 مع توسيع 52 glutamines من استخراج البروتين الليفية كعنصر تحكم إيجابية. كان المريض ADPSP الأليلات HD في المعدل الطبيعي (14/16) (لا تظهر البيانات)، وبالتالي دون عتبة الكشف عن mAb1C2.

نقاش

مثل الاضطرابات العصبية الأخرى يورث، كل الناجمة عن التوسع CAG تكرار الديناميكي في الجينات المسببة، ADPSP هو مرض غير متجانس phenotypical تتميز كلا من بداية الراحل، والتباين المشترك بين وداخل الأسرة والترقب (2). ولذلك، درسنا ADPSP فيما يتعلق بحضور CAG تكرار التوسعات. لهذا الغرض طبقنا طريقة الأحمر إلى ست عائلات مع ADPSP مرتبطة بإحكام على كروموسوم 2p21-P24. طريقة الأحمر، الذي يحدد تكرار التوسعات المحتملة المرضية دون معرفة مسبقة من موقع الكروموسومات، وقد تم تطبيقها على الأمراض العصبية الموروثة من مجهول المكان وراثية واظهار الترقب. في الآونة الأخيرة، يندبلاد آخرون تطبيق طريقة الأحمر لثماني عائلات مع النخاعي المخيخي نوع ترنح 7، والعثور على تكرار التوسع CAG من 64 في المتوسط ​​أن يكون السبب الأكثر احتمالا لهذا المرض (15). الجمعيات بين CAG تكرار التوسعات واضطراب عاطفي ثنائي القطب (16) وكذلك مرض انفصام الشخصية (17 تم العثور أيضا) من خلال طريقة الأحمر. ومع ذلك، لم يكن هناك دليل على وجود توسع CAG تكرار المعنية كما طفرة مسببة للمرض لا في مرض عائلي باركنسون (18) ولا في الأسر التي لديها راثي التهاب الشبكية الصباغي السائد (19).
مقارنة مع المنتج الأحمر من مريض MJD مع CAG طول تكرار أحجام المنتج RED-PCR تحديد المترابطة بشكل جيد مع عدد تكرار نسخة الفعلي على النحو الذي يحدده PCR، وجود علاقة وأفيد أيضا يندبلاد وآخرون. (20). تطبيق ارتباط مماثل لأسر ADPSP هنا وأظهر تحليل المنتجات ربط ≥180 بي بي ~60 CAG تكرار النسخ في جميع الأفراد المتضررين. في تكرار غيرها من الأمراض CAG هناك علاقة عكسية بين تكرار CAG التوسع وعمر في البداية. لصالح فرضية أن هذا قد يحدث في ADPSP كذلك يبدو من F الأسرة حيث تم العثور على منتج الأحمر في أعلى الوزن الجزيئي في امرأة تبلغ من العمر 56 سنة مع التقدم في السن في بداية 10 سنة. على العكس من ذلك، تبين عكس ذلك على مدى ثلاثة أجيال من عائلة H حيث سن في بداية ينخفض ​​موازية للانخفاض في عدد من المنتجات الحمراء (الشكل 2). ولذلك، فإنه من غير الممكن من نتائجنا لجعل أي بيان واضح ما إذا كان التوسع CAG تكرار له أهمية لعمر في بداية في ADPSP.
الفرق في شدة الفرقة ينظر في الممرات واحدة مع عصابات من أعلى الوزن الجزيئي التي تظهر أضعف قد يكون راجعا إلى إنشاء عدد محدود من المنتجات من حجم أكبر من القالب المستخدم، على الأرجح بسبب الصلب الثاني من ligated بالفعل جزيئات (14). بدلا من ذلك، والفرق في شدة قد تمثل استعلاء من المنتجات من اثنين من مختلف CAG تكرار تسلسل من أطوال مختلفة (20)، وهي أطول سلسلة يجري لا علاقة للمرض، مثل تلك العصابات من انخفاض كثافة موجودة في بعض الأفراد المتضررين فقط.
وأظهرت ثلاث من 21 الضوابط العادية منتجات الحمراء> 72 نقطة أساس في الحجم. كان اثنان من أفراد التوسعات من 180 سنة مضت واحد فرد منتج الأحمر من 108 سنة مضت. Schalling وآخرون. (14) ويندبلاد وآخرون (16، 20) وصفه التوسعات في ~30٪ من السكان الطبيعي. الفرق في وتيرة التوسع في الضوابط العادية في الدراسات وربما يرجع ذلك إلى عدد صغير نسبيا من الضوابط وبالتأكيد لا تعتمد على الاختلاف البيولوجي الحقيقي في مجموعات.
في HD، DRPLA، SBMA، SCA1، SCA2، SCA6 وMJD، يتم تحويل CAG تكرار التوسعات في مساحات polyglutamine (9، 10، 21)، والتي يعتقد أنها تؤدي إلى تحقيق مكاسب من وظيفة من البروتينات المتحورة. تروتييه وآخرون. (22) ميزت mAb1C2 الأجسام المضادة التي تعترف التوسعات polyglutamine في البروتينات المرضية المتورطين في HD، SCA1، MJD، SCA2 وSCA7 (22، 23). باستخدام هذه الأجسام المضادة وجدنا البروتين ذات وزن جزيئي فوق 350 كيلو دالتون في مقتطفات LCL من مريض واحد ADPSP. تروتييه وآخرون. (22) لم تجد دليلا للتوسعات polyglutamine في المرضى الذين يعانون ADPSP لا في الأسر مع المرض مرتبط كروموسوم 2 ولا في الأسر التي ليست مرتبطة المرض إلى كروموسوم 2. ومع ذلك، فإن mAb1C2 فقط بالكشف عن التوسعات polyglutamine فوق عتبة معينة وحد الكشف يختلف وفقا للبروتين، ويتضح من عتبة تحور HD بروتين يجري 39 glutamines مقارنة مع الحد من الكشف عن البروتين SCA1 من 55 glutamines (22). توسعات Polyglutamine دون عتبة "محددة" في المرضى ADPSP التحقيق قد يكون تفسيرا لماذا تروتييه وآخرون لم تجد دليلا للتوسعات polyglutamine؛ ولكن هناك ما يبرر إجراء مزيد من التحليل للمادة أكبر لتحديد ما إذا كان هناك ارتباط بين> 350 كيلو دالتون البروتين والنمط الظاهري ADPSP.

الشكل 1
الأنساب تظهر أجزاء من الأسر F وH مع ADPSP. أسفل كل النسخ المتنوعة الفردية شيدت من علامات الصبغي 2p21-P24 D2S400، D2S352، D2S2351، D2S2374، وD2S367 ترد. يظهر النمط الفرداني المرتبطة بهذا المرض مع أشرطة سوداء. كان جميع الأفراد المتضررين أحمر المنتج> 144 سنة مضت (باستثناء III-3 من أسرة H، الذي فشل مرارا وتكرارا لإعطاء المنتج الحمراء للكشف وبالتالي تم استبعادها من التحليل الإحصائي). IV-1، IV-2 وIV-3 من العائلة F هم جميع الأطفال دون سن 10 عاما. لم يتم تنفيذ تحليل الأحمر في أولئك الأفراد كما كانت كمية DNA صغيرة جدا للتحاليل.


الرقم 2
صورة الإشعاع الذاتي من المنتجات الأحمر من أجزاء من الأسر ADPSP H وF باستخدام (CTG) 12 النوكليوتيد. تشير الأرقام العمر عند بداية. أدنى الفرقة في كل حارة تمثل ربط منتج واحد = 72 قواعد ~24 CAG تكرار النسخ. كل فرقة إضافية تمثل 36 قواعد إضافية الموافق المشارك ربط واحد إضافي (CTG) 12. حارة 1: تأتر العضل الأحداث ضمور المريض. حارة 2: المريض MJD. (PCR تحديد CAG تكرار حجم = 72.) لين 3: الزوج تتأثر. الممرات 4-6: ثلاثة مرضى ADPSP من H. الأسرة الممرات 7-10: أربعة مرضى ADPSP من عائلة F.


الشكل (3)
اثنين من البقع الغربية من مستخلصات البروتين من أحد ADPSP LCL، وهما LCLs التحكم العادي واستخراج البروتين الليفية من مريض يعانون من مرض هنتنغتون (HD). حارة 1 + 6: استخراج LCL من الضابطة (N1). لين 2 + 5: استخراج LCL من المريض ADPSP. حارة 3: استخراج LCL من الضابطة (N2)، لين 4: الخلايا الليفية استخراج من HD المريض. شوهد البروتين كيلو دالتون ~240 في جميع مقتطفات LCL، ولكن البروتين كيلو دالتون> 350 تم الكشف فقط في LCL مقتطفات من المريض ADPSP. وقد استخدم شكل مرضي من 350 كيلو دالتون HD البروتين مع توسيع 52 glutamines عن السيطرة الإيجابية.

في الختام، أنشأنا علاقة بين التوسع CAG تكرار وADPSP مرتبطة الكروموسوم 2p21-P24. ومن المفترض أن تشارك التوسع في آلية المرض كما طفرة ديناميكية تقع في المنطقة ترميز الجين. كما يدل على ذلك mAb1C2 تحليل تكرار التوسع CAG من المرجح جدا ترجمتها وكنسبة المسالك polyglutamine في البروتين المرضية.

المواد والأساليب

الأسر

تم التشخيص على أساس وجود تاريخ عائلي موثقة جيدا ومعايير التشخيص من هاردينغ (1). وكانت معايير الحد الأدنى للتشخيص التشنج في الأطراف السفلية، عادة أكثر وضوحا من الضعف، وردود الفعل وتر مفرط وعلامة بابنسكي. يتم إعطاء البيانات السريرية وتفاصيل العائلة في مكان آخر (2). تم فحص واحد وعشرين الأفراد المتضررين من ست عائلات الدنماركية مع ADPSP و 21 الزوجين تتأثر.

تحليل الأحمر

تم استخراج DNA الجينومية باستخدام الإجراء التمليح من ميلر وآخرون. (24). وقد أجريت جميع ردود الفعل على نظام بيركن إلمر GeneAmp PCR 2400، وذلك باستخدام الشروط التالية مع بعض التعديلات من Schalling وآخرون. (14) ويندبلاد وآخرون. (20).
قبل رد الفعل ربط ل(CTG) 12 النوكليوتيد (فارماسيا في مجال التكنولوجيا الحيوية) وفسفرته باستخدام dATP وكيناز عديد النوكليوتيد (فارماسيا في مجال التكنولوجيا الحيوية). ردود الفعل ربط (20 ميكرولتر) يحتوي على 4 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني، 50 نانوغرام من 5'ذا الصلة، phosphory (CTG) وحضنت 12 النوكليوتيد و5 U PFU DNA يغاز (Stratagene) مع يغاز العازلة توفيره في البداية في 94 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة. وبعد ذلك تعرضوا ل495 دورات من 80 درجة Cfor 30 ثانية و 94 درجة مئوية لمدة 10 ثانية. تم التشويه والتحريف المنتجات ربط في 50٪ الفورماميد لمدة 5 دقائق قبل الكهربائي على هلام 6٪ بولي أكريلاميد تغيير طبيعة / 6 M اليوريا. وelectrotransferred الحمض النووي في وقت لاحق (شركة CBS العلمي، نظام النشاف شبه الجافة، EBU-6000) على Hybond N + غشاء باستخدام 175 مللي أمبير لمدة 20 ساعة في 1 × TBE. بعد UV-IMMOBIL-سعودة، تم تهجين الأغشية لمدة 20 ساعة عند 65 ° C إلى (CAG) 10 [32 P] -labeled النوكليوتيد التحقيق باستخدام 3 DNA "نهاية نظام الترقيم (PROMEGA). وجرفت المياه الأغشية في 2 × SSC، 0.1٪ SDS لمدة 45 دقيقة في 40 ° C 1 × SSC، 0.1٪ SDS لمدة 45 دقيقة في 63 ° C 0.1 × SSC، 0.1٪ SDS لمدة 45 دقيقة في 63 ° C وautoradiographed ل1 -3 أيام باستخدام شاشة تكثيف. وقد أجريت فحوصات الحمراء مرتين على الأقل لكل عينة DNA.
كانت الظروف النشاف الأساسية لاستنساخ أعلى العصابات الوزن الجزيئي.

تحليل صلة

تم احتساب النتيجة متعددة اللد مع علامات وضعه وفقا لخريطة Généthon بالقرب من مكان 2p21-P24 (SPG4) (25). كانت علامات والمسافات (سم) المستخدمة لتحليل متعددة: D2S400- (0.0) -D2S352- (0.01) -D2S2351- (0.01) -D2S2374- (0.0) -D2S367. تم إجراء التحليل الربط متعددة الأطراف باستخدام برنامج LINKMAP من حزمة FASTLINK (26).

استخراج البروتين وصمة عار الغربية

تم استخراج البروتينات من الابيضاض اللمفاوي والخلايا الليفية صوتنة في 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.8، 10٪ (ت / ت) الجلسرين، 1 ملم EDTA، 5 ملي بوكل، 1 ملم phenylmethylsulfonyl الفلوريد، 10 ميكروغرام / leupeptin مل و 10 ميكروغرام / مل aprotenin. بعد الطرد المركزي في 000 15 جرام لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، وجمعت طاف وتركيز البروتين يحدده الفحص BCA (بيرس). تم فصل عينات البروتين (50 ميكروغرام / حارة) من قبل 5٪ SDS-PAGE (27) والرطب نشف لImmobilon P غشاء (ميليبور) (28). وأغلقت الأغشية في الفوسفات مخزنة المالحة مع 5٪ الحليب المجفف منزوع الدسم وimmunoprobed مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة 1C2 (20). وقد وضعت البقع باستخدام الفجل البيروكسيداز مترافق أمصال مضادة لمكافحة فأر (داكو) وتعزيز لمعان كيميائي (ECL طقم، أمرشام).

التحليل الاحصائي

واستخدمت عصابة من 72 سنة مضت والتي تتطابق مع اثنين ligated (CTG) 12 [أليغنوكليوتيد كعنصر تحكم للمقايسة الأحمر. كما ذكرت من قبل Schalling وآخرون. (14) هذا المنتج على الأرجح يمثل عملية ربط لعدة تكرار قصيرة مواضع في الجينوم، وبالتالي يجب أن تكون موجودة في كل فرد. وقد تم تحديد المنتجات الحمراء من 144 سنة مضت ~48 CAG تكرار نسخ أو multimers العليا من ركائز ربط باعتبارها أليل الموسعة. تم استخدام اختبار فيشر في جدول 2 × 2 لاختبار فرضية وجود علاقة بين تكرار التوسع والمرض.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس