عرض مشاركة واحدة
  #17  
قديم 11-23-2015, 09:26 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome وغيابها في الفئران النتائج في بارديه-بيدل الظواهر متلازمة وتشوهات انتقائية في غشاء الاتجار البروتين

 

http://jcs.biologists.org/content/126/11/2372.full



بارديه-بيدل متلازمة (BBS) هو اضطراب عديد المظاهر ومتخالف وراثيا تسبب بشكل مستقل من قبل العديد من الجينات (BBS1-BBS17). سبعة البروتينات BBS الحفظ جدا (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8 و 9) تشكيل مجمع المعروفة باسم BBSome، التي تعمل في نشوء حيوي الغشاء الهدبي. BBS7 على حد سواء وحدة فرعية فريدة من BBSome ويعرض التفاعل المادي المباشر مع BBS الثاني معقد، مجمع chaperonin BBS. لفحص وظيفة في الجسم الحي من BBS7، ولدت لنا Bbs7 الفئران خروج المغلوب Bbs7 - / - أظهرت الفئران الظواهر مماثلة لغيرها من الجينات BBS فئرانا معدلة وراثيا بما في ذلك تنكس الشبكية، والسمنة، ventriculomegaly والعقم عند الذكور تتميز الشاذ axonemes الحيوانات المنوية سوطي. باستخدام أنسجة من Bbs7 - / - الفئران، وتبين لنا أن BBS7 مطلوب لتشكيل BBSome، وأن BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين. على الرغم من أن BBSome بمثابة مجمع معطف للبروتينات الغشاء الهدبي، غير مطلوب BBS7 لتوطين بروتينات الغشاء الهدبي polycystin-1، مستقبلات polycystin-2، أو الطعم المر، ولكن غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للالدوبامين D1 مستقبلات إلى الغشاء الهدبي، مشيرا إلى أن BBS7 تشارك في توطين محددة بروتين الغشاء لأهداب.
مقدمة

أهداب هي الهياكل القائمة على أنيبيب التي تمتد من سطح الخلية لمعظم خلايا حقيقية النواة. أنها تحتوي على مكونات فريدة غشاء الخلية منفصلة عن الغشاء البلازمي، وتصنف على أنها إما أهداب متحركة أو الأساسي (immotile). أهداب تلعب دورا مهما أثناء التطور وعلم وظائف الأعضاء في أنسجة البالغين. عيوب أهداب تؤدي إلى مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان ciliopathies يطلق التي تشمل dyskinesis الأساسي الهدبي، مرض الكلى المتعدد الكيسات، سحاف الكلية، جوبير syndome، متلازمة العليا-لوكن، متلازمة ميكل-جروبر، ORO-الوجه الرقمية متلازمة، متلازمة Alstrom، وBardet- متلازمة بيدل (BBS).
BBS هو اضطراب وراثي جسمي مقهور تتميز البدانة، اعتلال الشبكية، polydactyly، والتشوهات الكلى، والإعاقة ونقص الأعضاء التناسلية، وكذلك العيوب الثانوية بما في ذلك مرض السكري وارتفاع ضغط الدم التعلم. حتى الآن، تم الإبلاغ عن 17 جينات BBS أن يسبب اضطراب مستقل (عبد الستار وجليسون، 2011). على الرغم من أن الوظائف الخلوية من البروتينات BBS لا تزال غير مفهومة تماما، وقد كشفت الدراسات الوظيفية في الكائنات نموذج التي تشارك البروتينات BBS في وظائف الهدبية والنقل داخل الخلايا. في ايليجانس انواع معينة، يتم التعبير عن BBS الجينات في الخلايا العصبية المهدبة وتوطين للقاعدة الهدبية / المنطقة الانتقالية والمشاركة في IFT على طول الهدبية الخيط المحوري. bbs7 وbbs8 متحولة C. ايليجانس خطوط لها صبغة ملء العيوب، أهداب أقصر، وعيوب في النقل intraflagellar (IFT) (Blacque وآخرون، 2004). ضربة قاضية للتعبير عن BBS الجينات في نتائج الزرد في العيوب الحويصلة كوبفر، وفقدان أهداب سابقة لأوانها، وجسيم ميلانيني الوراء تأخير النقل (الين وآخرون، 2006). BBS فئرانا معدلة وراثيا ألخص انحطاط والسمنة الظواهر الشبكية ينظر في المرضى الذين يعانون BBS. وبالإضافة إلى ذلك، ذكر BBS فئرانا معدلة وراثيا تفتقر سياط الحيوانات المنوية (ديفيس وآخرون، 2007.؛. الفتح وآخرون، 2005؛ Mykytyn وآخرون، 2004.؛. نيشيمورا وآخرون، 2004). وتشير الدراسات البيوكيميائية أن سبعة من البروتينات BBS المعروفة (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8، و 9) تشكيل مجمع مستقرة المعروفة باسم BBSome (Nachury وآخرون، 2007). البروتينات BBS الأخرى بما في ذلك BBS6، BBS10، وBBS12 تشكل المجمع الذي ينظم BBSome التجمع (سيو وآخرون، 2010). واحدة من وظائف BBSome هو تعزيز أهداب نشوء حيوي الغشاء من خلال Rab8 GTPase الصغيرة وبمثابة مجمع معطف للاتجار الهدبية بروتين الغشاء (جين وآخرون، 2010.؛ Nachury وآخرون، 2007.).
على الرغم من BBS فئرانا معدلة وراثيا ألخص معظم الظواهر BBS، ويلاحظ الاختلافات المظهرية بين مختلف طفرات الجينات BBS. على سبيل المثال، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران هي ارتفاع ضغط الدم، في حين Bbs2 - / - الفئران هي سوي ضغط الدم (رحموني وآخرون، 2008. Bbs3) - / - الفئران لها hydocephalus أكثر حدة وأقل بدينة من غيرها من الفئران BBS (تشانغ وآخرون، 2011). بما يتفق مع الدراسات الماوس، عرض المرضى BBS التباين المظهري بين وداخل الأسر على حد سواء. وقد تم توثيق الفروق الفسيولوجية بين المرضى BBS التي تسببها طفرات في الجينات متميزة (Feuillan وآخرون، 2011.؛. Kulaga وآخرون، 2004)، مما يشير إلى أنه على الرغم من تقاسم الظواهر BBS المشتركة، الجينات BBS المختلفة قد تمتلك ظائف فريدة من نوعها. BBS7 هي فريدة من نوعها من حيث أنه هو وحدة فرعية من BBSome ويتفاعل مباشرة مع جسديا مجمع chaperonin BBS. من أجل دراسة دور BBS7 في الجسم الحي، وتحديد ما إذا كان فقدان Bbs7 لديه أي الظواهر الفريدة المرتبطة بها، ولدت لنا Bbs7 بالضربة القاضية الفئران Bbs7 - / - أظهرت الفئران الظواهر مماثلة لتلك التي لوحظت في آخر BBS فئرانا معدلة وراثيا بما في ذلك تنكس الشبكية، وعدم من سياط الحيوانات المنوية، والسمنة، وventriculomegaly. علينا أن نبرهن على BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين وما هو مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome. والجدير بالذكر، وتبين لنا أن BBSome غير مطلوب للعالمي توطين الهدبية بروتين الغشاء. ومع ذلك، غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للD1R إلى الغشاء الهدبي.

النتائج

جيل من الفئران Bbs7 باطل

BBS7 هي فريدة من نوعها بين البروتينات BBS لأنه جزء لا يتجزأ من BBSome ومكون من مجمع chaperonin BBS. للتحقيق في وظيفة في الجسم الحي من الجين Bbs7، ولدت لنا Bbs7 الفئران بالضربة القاضية جين عن طريق استبدال اكسون 5 مع كاسيت بالنيوميسين. هذا يؤدي إلى انزياح الإطار مما أدى إلى Bbs7 أليل فارغة (المواد التكميلية الشكل S1A). تم التحقق من عدم وجود Bbs7 مرنا من خلال تحليل RT-PCR RNA باستخدام معزولة عن Bbs7 - / - الخصيتين الماوس مع الاشعال داخل اكسون 5 (المواد التكميلية الشكل S1B.). وأكد عدم وجود بروتين BBS7 قبل الغرب النشاف (المواد التكميلية الشكل S1C).
أدى التزاوج من الزيجوت Bbs7 +/- 26٪ في Bbs7 + / + الفئران، و 55٪ الفئران Bbs7 +/-، و 19٪ Bbs7 - / - الفئران = 387؛ P <0.05). تردد انخفضت من Bbs7 - / - وقد لوحظ في ذرية أخرى فئرانا معدلة وراثيا BBS وتشير إلى أن بعض Bbs7 - / - الفئران توفي قبل الولادة أو فترة ما حول الولادة.

Bbs7 - / - الفئران تصبح بدينة، تفتقر الخراجات الكلى ولا تتطور polydactyly

Bbs7 - / - الفئران هي الضعفاء عند الولادة، تزن أقل من تتزاحم بهم في 3 أسابيع من العمر، وسمنة على مر الزمن. بعد الفطام، Bbs7 - / - الفئران تبدأ في كسب المزيد من الوزن من النوع البري الفئران بسبب زيادة الاستهلاك الغذائي. قبل 12 أسبوعا من العمر، Bbs7 - / - الفئران (ذكورا وإناثا) تزن أكثر بكثير من تتزاحم سيطرتها، والخلافات أصبحت أكبر في الحيوانات الأكبر سنا. قبل 7 أشهر، من النوع البري الفئران هي 28.7 ± 2.8 جم مقابل Bbs7 - / - 41.1 ± 3.25 غ (P <0.05).
على الرغم من شذوذ الكلوي وpolydactyly هي السمات الأساسية للالظواهر BBS في البشر، ونحن لم نلاحظ الكيسات الكلوية أو polydactyly من الأطراف الأمامية أو hindlimbs في فئرانا معدلة وراثيا Bbs7، مما يشير إلى اختلاف الأنواع أو الاختلافات عتبة بين الماوس والبشرية.

Bbs7 - / - الفئران تبدي تنكس الشبكية وventriculomegaly

التحليل النسيجي للBbs7 العمر 4-8 شهرا - / - تظاهر عيون انحطاط كبير من القطاعات الداخلية والخارجية للخلايا مستقبلة للضوء وطبقة النووية الخارجي (الشكل 1A، B.). وقد لوحظ Ventriculomegaly في البطينات الجانبية والثالث من الدماغ كما رأينا في أقسام الاكليلية من Bbs7 العمر 4-8 شهرا - / - الفئران (الشكل 1C-F.). نحن أيضا لوحظ تخفيف من القشرة المخية وانخفاض في حجم الحصين والجسم المخطط. لم يلاحظ أي تشوهات جسيمة في المخيخ في Bbs7 فئرانا معدلة وراثيا أو غيرها من فئرانا معدلة وراثيا BBS (المواد التكميلية الشكل S2).

تين. 1.
Bbs7 - / -. ملطخة E-عرض الفئران مبصرة فقدان الخلية وventriculomegaly (A، B) H & القديم 4-8 شهرا البرية من نوع (A) وBbs7 - / - (B) عيون تظهر فقدان مبصرة الداخلي وشرائح الخارجي فضلا عن انحطاط الطبقة النووية الخارجي. PC، خلايا مستقبلة للضوء. (C-F) محايد الحمراء الملطخة 60-100 ميكرون سميكة أقسام الدماغ الاكليلية من النوع البري (C، E) وBbs7 - / - الفئران (D، F) تظهر البطينات الجانبية الموسع (*)، والظهرية الموسع البطين الثالث (رأس السهم العلوي والسفلي)، وانخفاض المخطط الإحضار (S) وقرن آمون (H)، وترقق القشرة المخية (CC). أشرطة النطاق: 50 ميكرون (A، B)؛ 1 مم (C-F).

Bbs7 - / - الفئران لديها أهداب متحركة غير طبيعي في طبقة البطانة العصبية في الدماغ

منذ BBS هو مرض له علاقة أهداب، درسنا أهداب متحركة وأهداب الابتدائي في Bbs7 - / - الفئران. درسنا أهداب متحركة من طبقة الخلايا البطانة العصبية المبطنة للالبطينين عن طريق تلطيخ أقسام الاكليلية من العمر 3 اشهر من النوع البري وBbs7 - / - أدمغة فئران مع-α تويولين الضد ومضادة للIFT88 الأجسام المضادة لمكافحة الأسيتيل كعلامات أهداب . مقارنة مع الضوابط، Bbs7 - / - أظهرت الفئران عددا كبيرا من أهداب انخفاض خلية بطانية عصبية وأهداب المتبقية هي أقصر (الشكل 2A، B).

تين. 2.
Bbs7 - / - الفئران لها أهداب متحركة غير طبيعي في طبقة البطانة العصبية في الدماغ (A، B) كشفت تلطيخ مناعي من البطين الدماغ خلايا البطانة العصبية باستخدام المضادة للالأسيتيل α تويولين (الخضراء) ومضادة للIFT88 الأجسام المضادة (أحمر) عدم وجود أهداب وأهداب قصيرة (السهم) في طبقة البطانة العصبية من Bbs7 - / - الفئران (A) مقارنة مع من النوع البري الضوابط (B). (C، D) تحليل TEM من المقطع الطولي للأهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ يظهر القصير وانتفخ أهداب مع حويصلات في Bbs7 من العمر 3 اسابيع - / - الفئران (D) مقارنة مع عمرها 3 أسابيع تحكم من النوع البري (C). (E-G) تحليل TEM من المقطع العرضي للأهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ يظهر هيكل axonemal غير طبيعي في Bbs7 - / - الفئران (F، G) مقارنة مع السيطرة البرية من نوع (E). أشرطة النطاق: 50 ميكرون (A، B)؛ 0.2 ميكرون (C-G).

لمزيد من التحليل أهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ، أجرينا تحليل TEM من العمر 3 اسابيع من النوع البري وBbs7 - أدمغة الفئران - /. أهداب متحركة من Bbs7 - / - الدماغ طبقة البطانة العصبية لديها القصير، انتفخ أهداب مع حويصلات (الشكل 2C، D.) وتلك أهداب متحركة أيضا هياكل axonemal المعيبة (الشكل 2F، G.) بالمقارنة مع النوع البري الضوابط (الشكل. 2E). وتشير هذه الدراسات إلى أن غياب البروتين BBS7 يؤثر هياكل أهداب متحركة.
لدراسة أهداب الأساسي في الجسم الحي، ونحن ملطخة أقسام الأنسجة من الكلى والبنكرياس مع الأسيتيل α تويولين. لم نجد اختلافات في أرقام أهداب الأولية أو طول أهداب بين النوع البري وBbs7 - / - الفئران (المواد التكميلية الشكل S3.). كما شكلت أهداب الابتدائي وتظهر طبيعي في الخلايا المستزرعة الظهارية الكلى والخلايا الليفية الجنينية مثقف (MEF) المستمدة من Bbs7 - / - الفئران (. المواد التكميلية الشكل S3 والبيانات لا تظهر)، على الرغم من أننا لا نستطيع أن نستبعد إمكانية أن يكونوا قد يكون خفية العيوب الهيكلية، مثل التغييرات بعد التعديل في الأنابيب الدقيقة.

Bbs7 - / - الفئران يكون غير طبيعي سياط الحيوانات المنوية

أثبتنا سابقا لعدم وجود الحيوانات المنوية الأسواط في Bbs1 M390R / M390R knockin، Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران (ديفيس وآخرون، 2007.؛. الفتح وآخرون، 2005؛. Mykytyn وآخرون، 2004؛. نيشيمورا وآخرون، 2004). الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ Bbs7 العمر 4-8 شهرا - / - كشفت الخصيتين ندرة الحيوانات المنوية سياط (الشكل 3A، B.). نحن صقلها على هذه الملاحظة عن طريق تلوين المناعي من أنسجة الخصيتين. في حين أن معظم الحيوانات المنوية من Bbs7 - / - الفئران تفتقر إلى ذيل سوطي، وبعض من الحيوانات المنوية لديهم سياط تالف. هذه الأسواط غير طبيعي في كثير من الأحيان تشكيل هيكل حلقة نوع (الشكل 3C-F). لدراسة هذه الآفة تالف في مزيد من التفاصيل، أجزاء من النوع البري وBbs7 - / - تم تحليل الخصيتين بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). الهياكل microtubular والألياف الكثيفة الخارجية المحيطة هيكل microtubular في قطعة الرئيسي غير منظمة إلى حد كبير في المسوخ (الشكل الجيل الثالث 3G، H). في بعض الأحيان لاحظنا العادية 9 + 2 الهياكل axonemal في Bbs7 - / - الفئران (8،8٪ مقابل 100٪ في البرية من نوع، P <0.01). في المقابل، فإن الهياكل axonemal من أهداب متحركة في القصبة الهوائية من Bbs7 - / - الفئران طبيعية إلى حد كبير عن طريق تحليل TEM (المواد التكميلية الشكل S4.).

تين. 3.
Bbs7 - / - الفئران لها غير طبيعي سياط الحيوانات المنوية (A، B) H & E الملون القديم 4-8 شهرا البرية من نوع (A) وBbs7 - / - أظهرت (B) الأنابيب المنوية عدم وجود الحيوانات المنوية سياط. أظهر (C-F) مناعي تلطيخ الخصيتين سياط باستخدام المضادة للالأسيتيل-α تويولين تلطيخ عيوب في Bbs7 - / - الفئران. في كثير من الأحيان ولوحظ وجود نوع من عصابة هيكل أنيبيب في Bbs7 - / - الفئران. C و D الصور وانخفاض القوة، E و F هي صور عالية الطاقة. (G، H) تحليل TEM من المقطع العرضي البرية من نوع (G) وBbs7 - / - (H) الحيوانات المنوية سياط يكشف أن Bbs7 - / - سياط الحيوانات المنوية لا يكون نموذجي 9 + 2 axonemes، ولكن تظهر الهياكل أنيبيب غير منظمة (السهم) والألياف الكثيفة الخارجي (رأس السهم) المحيطة الهياكل microtubular. أشرطة النطاق: 100 ميكرون (A، B)؛ 50 ميكرون (C، D)؛ 20 </ emph> ميكرون (E، F)؛ 0.1 ميكرون (G، H).

مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome

منذ Bbs7 - / - الفئران لها الظواهر مماثلة لغيرها من BBSome الفئران فرعية خروج المغلوب وBBS7 هو وحدة فرعية من BBSome، ونحن التحقيق آثار خسارتها على تشكيل BBSome. والمثير للدهشة، وكانت مستويات البروتين BBS2 بشكل ملحوظ انخفضت في Bbs7 - / - الخصيتين لست] البروتين، ولكن ليس في Bbs4 - / - الخصيتين. وبالمثل، فقد انخفضت مستويات البروتين BBS7 في Bbs2 - / - الخصيتين، ولكن ليس في Bbs4 - / - الخصيتين (الشكل 4A.). لتحديد ما إذا كان هذا يرجع إلى تدهور البروتين أو انخفضت النسخ، كنا نصف الكمية RT-PCR لتقييم Bbs2 وBbs7 مرنا مستويات التعبير. نحن لم تراع الفوارق التعبير عن Bbs2 مرنا في Bbs7 - / - الخصيتين أو الاختلافات Bbs7 مرنا في Bbs2 - / - الخصيتين مقارنة مع الضوابط (الشكل 4B.). معا هذه النتائج تشير إلى أن BBS2 وBBS7 الخلافات مستوى البروتين تنتج عن الاختلافات في استقرار البروتين، والتي BBS2 وBBS7 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار.

تين. 4.
مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome. (A) BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين. أظهرت هي البقع الغربية من إجمالي لست] البروتين من النوع البري (WT)، Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs7 - / - الخصيتين. ويظهر تحليل (B) RT-PCR أي تغييرات واضحة في مستويات Bbs2 مرنا في Bbs7 - / - الفئران ولا تغييرات في مستويات Bbs7 مرنا في Bbs2 - / - الفئران. (C) وBBSome لا تشكل في BBS الخصيتين الماوس خروج المغلوب. أظهرت هي البقع الغربية من البروتينات الخصيتين immunoprecipitated بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة BBS1. تم الكشف عن وجود مفارز BBSome أخرى مع الأجسام المضادة ضد مفارز BBSome الفردية. واستخدمت كميات متساوية من البروتين الأولي من الخصيتين lystaes للمناعي. (D) تحليل الانحدار السكروز من البروتين لست] الخصيتين تثبت أنه لا يوجد أشكال BBSome في غياب BBS7. (E) فقدان تشكيل BBSome في خلايا الكلى مثقف من BBS الفئران خروج المغلوب وBBS2 انقاذ BBSome تشكيل في Bbs2 - خلايا الكلى - /. أظهرت هي خلايا الكلى مثقف من مختلف الفئران خروج المغلوب BBS المصابين اتش معربا عن FLAG-BBS2. وهي lysed الخلايا المصابة وتم سحب البروتينات أعرب بنسبة مكافحة FLAG الأجسام المضادة. تم الكشف عن وجود مفارز BBSome الذاتية لطخة الغربية. (F) FLAG-BBS7 (WT والمسوخ) كانت المشترك مع transfected BBS2 الموسومة MYC إلى خلايا 293T والتفاعل بين BBS7 وBBS2 كان يعاير من قبل المشارك مناعي وكميا بواسطة يماغيج. و transfected (G) FLAG-BBS7 (WT وH323R طفرة) في الخلايا 293T وتم سحب البروتينات transfected أسفل عن طريق الأجسام المضادة لمكافحة FLAG. تم تحديد وجود مفارز BBSome الذاتية من قبل، BBS2، BBS4 وBBS7 الأجسام المضادة BBS1 المضادة. وتم قياس كمية مبالغ BBS1، BBS2، BBS4 وBBS7 التي كتبها يماغيج.

ترابط BBS2 وBBS7 للاستقرار البروتين يتسق مع النتائج تبين أن BBS2 يتفاعل جسديا مع BBS7 ويشكل subcomplex (Nachury وآخرون، 2007). ومن المثير للاهتمام، BBS7 وBBS2 مشاركة ملفوف لفائف تناظر تسلسل المجال في المناطق الوسطى من (المواد التكميلية الشكل S5). لم يكن مطلوبا من BBS7 ملفوف لفائف مجال للربط إلى BBS2. بدلا من ذلك، يطلب من الأحماض الأمينية 200-C النهائي للBBS7 للربط إلى BBS2 (المواد التكميلية الشكل S5A). وبالمثل، المجال ملفوف لفائف من BBS2 غير مطلوب على الاطلاق للتفاعل مع BBS7، ولكن فقدان هذا المجال يقلل من التفاعل مع BBS7 (المواد التكميلية الشكل S5B). وعلاوة على ذلك، فإن حذف المنطقة ملفوف لفائف في BBS7 لا يعطل تفاعلها مع غيرها من الوحدات الفرعية BBSome الذاتية. البروتين BBS2 مع حذف المنطقة ملفوف لفائف يعطل التفاعل مع بعض مفارز BBSome الذاتية (BBS7) مع الحفاظ على القدرة على التفاعل مع مفارز BBSome أخرى (BBS1 وBBS9) (المواد التكميلية الشكل S5C).
لدراسة تشكيل BBSome في غياب BBS7، أجرينا مناعي مع الأجسام المضادة ضد BBS1، واحدة من مفارز من BBSome. وقد انخفض وجود مفارز BBSome أخرى في BBS1 سحب هبوطا أو غير قابلة للكشف في غياب BBS7 أو BBS2 كما يتبين من لطخة غربية. هذا يدل على أن BBSome سليمة غير مشكلة في غياب BBS7 (الشكل 4C). أكدنا أيضا هذه النتائج عن طريق تحليل الانحدار السكروز من إجمالي لست] البروتين من النوع البري وBbs7 - / - الخصيتين (الشكل 4D).
للتحقيق في ما إذا كان شرط من BBS7 لتشكيل BBSome هي فريدة من نوعها لأنسجة الخصيتين، ونحن عزل الكلى الخلايا الظهارية الأولية من كلا من النوع البري وBbs7 - / - الفئران وإصابة الخلايا المستزرعة مع اتش معربا عن FLAG-BBS2. نحن انزلوا العلم BBS2 والكشف عن وجود مفارز BBSome الذاتية باستخدام أجسام مضادة لمكافحة BBS (الشكل 4E). وجدنا أن في غياب البروتين BBS7، ويتم تشكيل أي BBSome كامل (ناقص BBS7)، على الرغم من أن بعض المكونات BBSome لا تزال تشكل subcomplex. إذا كانت هذه subcomplexes تزال تحتفظ ببعض المهام المتبقية هي مسألة الفائدة.
لتقييم تأثير على تشكيل BBSome من متماثل الطفرات BBS7 مغلطة (T211I وH323R) وجدت في المرضى الذين يعانون BBS، نحن اختبار ما إذا كان BBS7 تحتوي على هذه الطفرات يمكن إدراجها في BBSome. ويظهر تحليل النشوء والتطور أن هذه الطفرات تقع في مناطق محمية من البروتين. ونحن إنشاء بنيات BBS7 تحور بواسطة الطفرات موقع الموجه والموسومة لهم FLAG في N-محطة من البروتينات. انخفضت البروتينات BBS7 تحور القدرة على التفاعل مع BBS2 كما يتبين من شارك في مناعي عندما transfected المشارك في الخلايا 293T (الشكل 4F). طفرة مغلطة BBS7 H323R قد تراجع في القدرة على هدم مفارز BBSome الذاتية مقارنة مع من النوع البري BBS7 البروتين (الشكل 4G). تم الحصول على نتيجة مماثلة مع متحولة بروتين T211I (تشانغ وآخرون، 2012b). وتشير هذه النتائج إلى أن الطفرات BBS7 مغلطة تؤثر BBSome تشكيل. وهذا يوفر تفسيرا لماذا هذه الطفرات نقطة متماثل تسبب BBS. في المقابل، لم غياب BBS7 لا تؤثر على مستويات البروتين من مكونات معقدة IFT أو IFT تشكيل معقد (المواد التكميلية الشكل S6A، B). لم فقدان BBS7 لن يؤثر IFT البروتين الهدبية توطين (المواد التكميلية الشكل S6C)، بما يتفق مع الحقائق التي فقدان الجينات BBS ديها الظواهر أكثر اعتدالا من ذلك من فقدان الجينات IFT، على الرغم من أننا لا نعرف إذا كان معدل حركة IFT هو تغييرها.

غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين مستقبلات الذوق، polycystin-1 أو polycystin-2

ومن المعروف أن BBSome تشارك في نشوء حيوي غشاء أهداب من خلال Rab8. بالإضافة إلى ذلك، نهدم من BBS الجينات في النتائج الزرد في عيوب في الحويصلة Kuffer وإلى الوراء تأخير النقل جسيم ميلانيني. وعلاوة على ذلك، فقد BBS البروتينات النتائج في تراكم عنصر الصوتية مسار القنفذ مملس (SMO) داخل أهداب دون تفعيل المسار (تشانغ وآخرون، 2012A). هذه الدراسات تدل على أن البروتينات BBS تعمل في الاتجار محدد الحويصلة. وقد تبين أن البروتينات أهداب الأخرى ذات الصلة مثل AHI1 وتشارك FUZZY في الغشاء العام الاتجار البروتين وليس فقط لأهداب الاتجار بروتين الغشاء (رمادي وآخرون، 2009.؛ هسياو وآخرون، 2009.). لاختبار ما إذا تشارك BBS7 في الغشاء العام الاتجار البروتين، درسنا مسارات الإلتقام-بالكلاذرين مستقلة وتعتمد على بالكلاذرين في مثقف من النوع البري وBbs7 - / - الخلايا الأولية الكلى باستخدام fluorophore المسمى السم الكوليرا وترانسفيرين المستقبلة كعلامات على التوالي. تم الكشف عن عدم وجود اختلافات من السم الكوليرا أو ترانسفيرين مستقبلات الإلتقام بين النوع البري وBbs7 - / - الخلايا (المواد التكميلية التين S7، S8). ويتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام خلايا MEF من النوع البري وBbs7 - / - الفئران. وتشير هذه البيانات إلى أن Bbs7 ليست متورطة في الاتجار حويصلي العام، ولكن بدلا تشارك في أنواع معينة من الاتجار حويصلي مثل جسيم ميلانيني النقل في الزرد و / أو الاتجار إلى وجهات التحت خلوية محددة مثل الأغشية الهدبية.
بعد ذلك، درسنا الهدبية غشاء الاتجار البروتين في الخلايا فارغة Bbs7. وقد تم مؤخرا أظهرت مستقبلات الطعم المر للتوطين لغشاء الهدبية في أهداب متحركة من ظهارة الهوائية والذوق مستقبلات الأشكال ترتبط عدوى الجهاز التنفسي (لي وآخرون، 2012.؛ شاه وآخرون، 2009.). رغم عدم وجود النمط الظاهري واضح في الكلى، وقد تبين وجود ارتباط طعم مستقبلات مرير مع نوع معين من اعتلال الكلية، البلقان المتوطنة إعتلال الكلى، (التغطية بالخشب وآخرون، 2012). لاختبار إذا يتم ترجمة مستقبلات الطعم المر أيضا إلى غشاء أهداب الابتدائي، ونحن ملطخة خلايا الكلى مثقف مع الأجسام المضادة ضد مستقبلات الطعم المر T2R4 وT2R43 جنبا إلى جنب مع أهداب علامة الأسيتيل α تويولين. وأظهرت النتائج أن مستقبلات الطعم المر توطين لغشاء أهداب الكلى الابتدائي (المواد التكميلية الشكل S9A-C). مستقبلات الذوق وظيفية كما يتضح من العلاج مع ديناتونيوم مجمع المر للحصول على 2+ استجابة الكالسيوم (المواد التكميلية الشكل S9I). من المذكرة، لم فقدان Bbs7 لن يؤثر على توطين أهداب من هذه المستقبلات (المواد التكميلية الشكل S9D-F)، ولا يؤثر على الكالسيوم 2+ تعبئة عندما حفز مع مجمع المر ديناتونيوم (المواد التكميلية الشكل S9J)، مشيرا إلى أن BBS7 و غير مطلوب BBSome لتوطين الغشاء الهدبي أو وظيفة مستقبلات الطعم المر.
طفرة من عدة بروتينات الغشاء الهدبية بما في ذلك polycystin-1، polycystin-2، وMecklin (MKS3)، يسبب الأمراض التي تصيب الإنسان مع الظواهر التي تتداخل تلك BBS. ولذلك، فإننا التحقيق في توطين كلا polycystin-1 وpolycystin-2 في تربيتها Bbs7 - / - خلايا الكلى الأولية باستخدام الأجسام المضادة ضد polycystin-1 وpolycystin-2. غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين polycystin-1 وpolycystin 2 (الشكل 5). حقيقة أن Bbs7 - / - الفئران لا تتطور الكيسات الكلوية إلى أن polycystin-1 وpolycystin-2 لا تزال وظيفية، على الرغم من أننا لا نستطيع أن نستبعد إمكانية عيوب وظيفية خفية في غياب BBS7.

تين. 5.
غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين polycystin-1 وpolycystin-2. (A-L) أظهرت هي خلايا الكلى مثقف من النوع البري (A-C، G-I) وBbs7 - / - (D-F، J -L) الفئران ملطخة مكافحة الأسيتيل α تويولين (الخضراء) كعلامة أهداب ومضادة للpolycystin-1 (A-F؛ أحمر) ومضادة للpolycystin 2 (G-L، أحمر) الأجسام المضادة. أشرطة النطاق: 10 ميكرون.

غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للالدوبامين D1 مستقبلات الغشاء الهدبي

وقد أظهرت الدراسات الجينية في الكائنات النموذج الذي فقدان البروتينات BBS تؤدي إلى الوراء جسيم ميلانيني تأخير النقل في الزرد، IFT عيوب تحول في الطرف الهدبية في C. ايليجانس، وتراكم يشير البروتينات داخل الأسواط في كلاميدوموناس، وتراكم مملس داخل أهداب في الفئران (Lechtreck وآخرون، 2009.؛ وي وآخرون، 2012.؛. الين وآخرون، 2006؛ تشانغ وآخرون، 2012A). ولذلك، فإننا التحقيق مستقبلات الذاتية التي قد تتراكم داخل أهداب في Bbs7 - / - الفئران. وقد تبين أن مستقبلات الدوبامين D1 (D1R) تتراكم في أهداب في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران (Domire وآخرون، 2011.). لتحديد ما إذا D1R يتراكم في أهداب في Bbs7 - / - الفئران، ونحن ملطخة أقسام الدماغ من النوع البري وBbs7 - / - الفئران مع العصبية ACIII أهداب علامة والأجسام المضادة ضد D1R. لا يمكننا العثور على أي تلطيخ الهدبية من D1R في البرية من نوع الدماغ (الشكل 6A-C). في المقابل، وجدنا مناطق متعددة بما في ذلك المخطط واللوزة حيث يموضع D1R لأهداب في Bbs7 - / - (الدماغ الشكل 6D-F). وتشير هذه البيانات إلى أن BBSome يمكن أن تنظم النقل إلى الوراء من D1R داخل أهداب الخلايا العصبية وفقدان BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للD1R إلى الغشاء الهدبي.

تين. 6.
فقدان BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للمستقبلات الدوبامين D1 داخل الأهداب. (A-F) أقسام الدماغ من النوع البري (A-C) وBbs7 - / - كانت ملطخة (D-F) الفئران مع مكافحة ACIII الأجسام المضادة ( الأحمر) كعلامة أهداب الخلايا العصبية ومكافحة D1R الأجسام المضادة (الخضراء). D1R يتراكم داخل أهداب في Bbs7 - / - مخ الفأر مقارنة البرية من نوع السيطرة. شريط النطاق: 20 ميكرون.

نقاش

وهدب هو عضية الهامة التي تلعب أدوارا متعددة خلال التنمية وفي التوازن من أنسجة البالغين. أهداب متحركة مهمة لوظائف مثل إزالة المخاط من الرئتين والدورة الدموية من السائل الشوكي الدماغي من خلال البطينين الدماغي، في حين أهداب الأساسي والمهم لchemo- والميكانيكية والإحساس، وكذلك القنفذ وWNT نقل الإشارة. وسلط الضوء على أهمية أهداب التي كتبها النتائج أن أهداب عطل يساهم في مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان المعروفة باسم ciliopathies التي تشمل متلازمة بارديه-بيدل.
BBS هو اضطراب عديد المظاهر التي تنطوي على العديد من أجهزة الجسم. بعض الظواهر BBS مثل السمنة، وتنكس الشبكية، والسكري، وارتفاع ضغط الدم لديها معدلات انتشار عالية في عموم السكان. ولذلك، فإن دراسة BBS يوفر فرصة فريدة من نوعها للكشف عن بعض مسارات الكامنة أو التأثير على هذه الأمراض الشائعة. BBS خروج المغلوب الفئران تحاكي النمط الظاهري البشري، وبالتالي توفير أداة مفيدة لاكتشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا المرض فضلا عن اختبار علاجات جديدة.
على الرغم من BBS فئرانا معدلة وراثيا تشترك الظواهر BBS مشتركة، ويلاحظ الاختلافات المظهرية بين مختلف طفرات الجينات BBS. الأهم من ذلك، عرض المرضى BBS التباين المظهري بين وداخل الأسر (كرمي وآخرون، 1995). وقد تم توثيق الفروق الفسيولوجية بين المرضى BBS التي تسببها طفرات في الجينات متميزة (Feuillan وآخرون، 2011)، مما يشير إلى أنه على الرغم من تقاسم الظواهر BBS المشتركة، قد يكون الجينات BBS مختلفة ظائف فريدة من نوعها. BBS7 هو جزء لا يتجزأ من BBSome ويتفاعل مع مجمع BBS chaperonin، وهي نتيجة فريدة من نوعها لBBS7 بين BBSome البروتينات جسديا. غياب BBS7 يؤثر على استقرار البروتين من BBS2 ويمنع تشكيل BBSome سليمة. ومع ذلك، لا تزال تشكل أهداب الابتدائية في غياب BBS7. على عكس بالضربة القاضية جين IFT، التي أهداب لا تشكل ويؤدي إلى الفتك الجنينية في الفئران، Bbs7 - / - الفئران يمكن البقاء على قيد الحياة إلى سن الرشد وأهداب الابتدائي لا تزال تشكل في الأنسجة بما فيها الكلى والجزر من البنكرياس، والقناة البنكرياسية، في الظهارية الكلوي مثقف الخلايا والخلايا الليفية. وعلى النقيض من أهداب الابتدائي، أهداب متحركة من خلايا البطانة العصبية بطانة البطينات الدماغية والحيوانات المنوية لديهم سياط عيوب خطيرة في Bbs7 - / - الفئران. أهداب متحركة المعيبة ليست بسبب وventriculomegaly المتقدمة في غياب BBS7 منذ أهداب عيب متحركة تطوير في وقت مبكر من 3 أسابيع في ependyma الدماغ. لا تفعل تظهر أهداب متحركة المعيبة أن يكون السبب الرئيسي للventriculomegaly. تطوير غير طبيعي للخلايا العصبية السلف قد تكمن وراء تطوير ventriculomegaly في هذا النموذج الماوس كما هو موضح لنماذج أخرى الماوس BBS لأن كلا BBS7 وBBS1 تعتبر ضرورية لسلامة BBSome (كارتر وآخرون، 2012). غياب BBS7 لا يؤثر على تشكيل المجمعات IFT، على الرغم من أننا لا نعرف ما اذا تأثر الحركة من الجسيمات IFT التي كتبها غياب BBSome. ويبدو أن الجينات BBS والجينات IFT أن تؤثر على جوانب مختلفة من وظيفة الهدبية. نتائجنا في الفئران تتسق مع نتائج كلاميدوموناس، وتسليط الضوء على التفاعل بين BBSome ومجمع IFT (Lechtreck وآخرون، 2009).
أثبتنا أن BBS7 البروتين إيواء الطفرات نقطة وجدت في المرضى الذين يعانون BBS7 (T211I وH323R) لديه قدرة انخفضت إلى تشكيل BBSome مقارنة مع البروتين BBS7 العادي. الأساليب المستخدمة هنا يمكن أن توفر نظام فحص خلية القاعدة فعال لتقييم طبيعة الطفرات مغلطة BBS الإنسان في المختبر.
في الآونة الأخيرة أظهرت الدراسات أن الجينات ذات الصلة أهداب، مثل AHI1 وغامض، وتشارك في الغشاء العام الاتجار البروتين وليس فقط لالهدبية الاتجار بروتين الغشاء (رمادي وآخرون، 2009.؛. هسياو وآخرون، 2009). في المقابل، غياب BBS7 لا يؤثر على مسارات إما مستقلة بالكلاذرين وأو بالكلاذرين الإلتقام يتوقف. وبالمثل، وغياب أو طفرة من البروتينات BBS لا تؤثر على مسار إفرازية العام للبروتينات الغشاء بما في ذلك SST3R وترانسفيرين مستقبلات غشاء البلازما (جين وآخرون، 2010) (لا تظهر البيانات). على الرغم من أن الاتجار حويصلة العامة لا يبدو أن يتطلب BBS7 أو BBSome والاتجار بروتينات معينة أو من غشاء البلازما يمكن أن يثير الشبهة في غياب BBSome. ومن الأمثلة على الاتجار مستقبلات اللبتين، وهو ما ثبت للتفاعل مباشرة مع BBSome (سيو وآخرون، 2009). ومن المثير للاهتمام، في C. ايليجانس، وفقدان BBS الجينات يؤدي إلى زيادة إطلاق سراح الحويصلات كثيفة الأساسية والأنشطة المعززة للأنسولين، نيوروبيبتيدي، وأمين مسارات إشارات الاحيائية (لي وآخرون، 2011). نستنتج أن BBS7 وبالتالي BBSome لا تشارك في الهدبي الاتجار العام بروتين الغشاء بل في محدد الغشاء الهدبي الاتجار البروتين. ويستند هذا الاستنتاج على ملاحظة أن الهدبية بروتينات غشاء مثل polycystin-1، polycystin-2، ومستقبلات الطعم المر لا تزال المترجمة إلى غشاء الهدبية في الغياب التام للبروتين BBS7، وهو مطلوب لBBSome التجمع. بالإضافة إلى ذلك، تشير الدلائل إلى أن polycystin-1، لا تزال polycystin-2، ومستقبلات الطعم المر وظيفية في غياب BBS7. في المقابل، غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم SMO داخل أهداب دون تحفيز SMO يجند (تشانغ وآخرون، 2012A). وقد ثبت الأخرى بروتينات الغشاء الهدبي بما في ذلك SST3R وMCHR1 لتوطين لأهداب الخلايا العصبية في ظل ظروف طبيعية، ولكن ليس في غياب BBS2 أو BBS4 (Berbari آخرون، 2008A.؛ Berbari وآخرون، 2008b.). ومع ذلك، فإن غياب BBS7 لا يؤثر توطين الهدبي إما SST3R أو MCHR1 في الخلايا العصبية في الدماغ أو في الخلايا المستنبتة من Bbs7 - / - الفئران (لا تظهر البيانات). في المقابل، تراكمت D1R داخل أهداب في غياب BBS7، على غرار النتائج في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران (Domire وآخرون، 2011.). تراكم D1R داخل أهداب قد يرجع ذلك إلى النقل إلى الوراء تغير من D1R داخل أهداب في غياب BBS7. ودعما لهذا الاحتمال، وأظهرت الدراسات الجينية في الزرد إلى الوراء جسيم ميلانيني تأخير النقل عند التعبير عن BBS يتم منع الجينات (الين وآخرون، 2006). وعلاوة على ذلك، SMO يتراكم داخل أهداب دون التحفيز يجند في غياب BBSome (تشانغ وآخرون، 2012A). تأخر نقل إلى الوراء يمكن أن تنجم عن النشاط تغير المحرك، خلل في مجمع IFT أو تتغير بنية أهداب axonemal، أو تغيير معين في قدرة بعض الشحنات للخروج من هدب. دراسات في C. ايليجانس تشير إلى أن البروتينات BBS بمثابة linkers بين مجمع IFT B ومجمع IFT A (Blacque وآخرون، 2004). وفقدان البروتينات BBS يؤدي إلى وظيفة غير لائقة المجمعات IFT. ودعما لهذا الاحتمال، المسوخ مضاعفة من Bbs7 وTg737orpk تفتقر تماما أهداب، تشبه مجمع IFT B بالضربة القاضية الحقيقية (تشانغ وآخرون، 2012A). بدلا من ذلك، أهداب الأساسي من المسوخ Bbs7 قد يكون لها أيضا خفية خلل في بنية axonemal التي قد تسهم في تراكم D1R داخل الأهداب. أهمية وظيفية من تراكم D1R داخل أهداب غير معروفة حاليا. وقد تبين أن المرضى BBS وBBS الفئران خروج المغلوب زادت القلق والاكتئاب (بارنيت وآخرون، 2002.؛ Eichers وآخرون، 2006.). ومن المثير للاهتمام، انسداد D1R السرقة مع الأدوية الموهن مكيفة التجمد (اختبار الخوف مشروط) أثناء الاختبار الاستبقاء (Guarraci وآخرون، 1999a... Guarraci وآخرون، 1999b). توطين D1R في مناطق الجسم المخطط واللوزة تشير إلى أن الدوبامين إشارات قد تلعب دورا لعيوب السلوك التي لوحظت في نماذج الماوس BBS والمرضى BBS.

المواد والأساليب

الكواشف والأجسام المضادة

وقد تم الحصول على الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ضد الماوس BBS2 الببتيد DKTARYWRIK والأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ضد الماوس BBS7 الببتيد VLQERENYQQ من توسيع النظم البيولوجية (هانتسفيل، AL). وكانت هذه الأجسام المضادة النقاء تقارب والتحقق منها في الفئران خروج المغلوب. وحيدة النسيلة المضادة للبيتا تويولين، بولكلونل مكافحة β-الأكتين، وحيدة النسيلة المضادة للالأسيتيل تويولين، وحيدة النسيلة المضادة للγ تويولين، بولكلونل الأرنب تم شراؤها مكافحة BBS8 وBBS9 من سيغما (سانت لويس، MO). تم شراء الماعز المضادة للBBS1 (N-20)، الماعز المضادة للBBS2 (C-16) الأجسام المضادة، والفأر مكافحة D1R الضد من سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية (سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، CA). تم شراؤها لمكافحة T2R4 الضد الأرنب بولكلونل والأرنب المضادة للT2R43 الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة من العلم الحرارية (بيتسبرغ، PA). تم شراؤها اليكسا 488 مترافق السم الكوليرا واليكسا 568 البشرية مترافق نقل مستقبلات من إينفيتروجن (كارلسباد، كاليفورنيا). وكان الأرنب بولكلونل المضادة للpolycystin-1 هدية من الدكتور أوكسانا Ibraghimov-Beskrovnaya (شركة جنزايم). كان الأرنب بولكلونل مكافحة polycystin-2 الأجسام المضادة هدية من الدكتور ستيفان Somlo (جامعة ييل)، والدكتور غريغوري Pazour (مدرسة الطب بجامعة ماساتشوستس).

جيل من Bbs7 الفئران خروج المغلوب

تم استخدام PCR لتضخيم 5 'و 3' مناطق Bbs7 الجينات من 129 / SVJ الحمض النووي الجيني والمستنسخة في استهداف pOSDUPDEL ناقلات (هدية من O. سميثيز، جامعة نورث كارولاينا في تشابل هيل، NC). تم خطي ناقلات و electroporated إلى R1 الجذعية الجنينية (ES) خلايا (129 × 1 / SvJ3 129S1 / سيفرت). كما تم عرض G418 واستنساخ مقاومة للganciclovir التي كتبها بعيد المدى PCR لتحديد خطوط الخلايا ES المستهدفة بشكل صحيح. واستخدمت اثنين من خطوط الخلايا ES مستقلة لإنتاج الوهم. استخدمت حيوانات خيالية لتوليد Bbs7 الفئران متخالف على خلفية وراثية مختلطة من قبل التزاوج مع C57BL / 6J الفئران. تم intercrossed الفئران متخالف، وكان التنميط الجيني لسلالة بواسطة PCR. جميع الدراسات انضمت إلى المبادئ التوجيهية الموضوعة لرعاية واستخدام حيوانات التجارب وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان من جامعة ولاية ايوا.

عزل الحمض النووي الريبي وتحليل RT-PCR

تم عزل الحمض النووي الريبي من العمر 2.5 شهرا من النوع البري وBbs7 - / - الخصيتين الماوس باستخدام TRIzol كاشف (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا). وقد أعد كدنا] من 1 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام مرتفع الثالث الناسخ العكسي (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا).

تحليل لطخة غربية

من النوع البري وBbs7 تعطلت الخصيتين متحولة من قبل TISSUEMISER (فيشر العلمية، بيتسبرغ، PA) في تحلل العازلة (1 × PBS، 1٪ تريتون X-100 و مثبط البروتياز من روش، انديانابوليس، IN). تم تجميد الأنسجة تعطلت في النيتروجين السائل وإذابة في حمام الماء درجة حرارة الغرفة. وتكررت هذه الدورة تجميد أذاب ثلاث مرات. ثم تم طرد ولست] في 20000 × ز لمدة 15 دقيقة وتم قياس تركيز supernatants باستخدام بيو راد العاصمة فحص البروتين (هرقل، CA).
تم فصل البروتينات عن طريق الكهربائي باستخدام 4-12٪ المواد الهلامية NuPAGE مكرر تريس (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا)، يليه نقل إلى الأغشية النيتروسليلوز وتم الكشف عنها من قبل SuperSignal دورا مددت الركيزة (بيرس، روكفورد، IL).

التحليل النسيجي للBbs7 - / - الفئران

الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ العينين والخصيتين من العمر 4-8 شهرا Bbs7 أجريت متحولة والعمر كعينة ضابطة من حد وصفه. أقسام الدماغ الاكليلية من 60-100 ميكرون من العمر 4-8 شهرا Bbs7 - - / كانت ملطخة الحيوانات والعمر كعينة ضابطة مع محايد الأحمر وصورت مع stereomicroscope أوليمبوس SZX12 كما هو موضح (ديفيس وآخرون، 2007.).

دراسات الوزن

تناول الطعام في قفص فردي Bbs7 - - / تم مقارنتها مع الحيوانات Bbs7 +/- والحيوانات البرية من نوع السيطرة تتراوح أعمارهم 4-28 أسابيع باستخدام متوسط ​​ستة حيوانات في كل مجموعة. تم تسجيل الوزن بداية الأسبوعية عند الفطام.

نقل الإلكترون المجهري

تم perfused الفئران مع نصف القوة تثبيتي Karnovsky وتم تشريح الأنسجة وإصلاحها في نصف القوة تثبيتي Karnovsky لعدة ساعات قبل الأوسيميوم بعد التثبيت، والجفاف، وتضمينها في الإي بي 812. نقل الميكروسكوب الإلكتروني اتخذت كما هو موضح سابقا (سويديرسكي وآخرون آل.، 2007).

جيل من BBS2 البشري وBBS7 متحولة بنيات الحذف والطفرات نقطة

تم إنشاء BBS7 المسوخ الحذف عن طريق PCR والمستنسخة في التعبير الثدييات ناقلات pCS2 +. وتم التحقق من كل المسوخ الحذف عن طريق التسلسل المباشر. تم إنشاؤها الطفرات نقطة BBS7 بواسطة الطفرات موقع الموجه (Stratagene، لا جولا، كاليفورنيا) باستخدام N-محطة الموسومة FLAG من النوع البري BBS7 كقالب والتحقق من التسلسل.

مناعي

تفاضلي الموسومة الجينات BBS الإنسان و transfected المشارك في الخلايا 293T. بعد ثمانية وأربعين ساعة ترنسفكأيشن، كانت هي lysed الخلايا في تحلل العازلة (1 × PBS، 1٪ تريتون X-100، ومثبط البروتياز، روش، انديانابوليس، IN) ونسج في 20000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. تم مسح supernatants من قبل الحضانة مع حبات بروتين G (بيرس، روكفورد، IL). وحضنت لست] مسح مع الأجسام المضادة ضد علامات المقابلة لمدة 4 ساعات. وبعد ذلك يضاف بروتين G الخرز والمحتضنة لمدة 4 ساعات أخرى. تم غسلها حبات أربع مرات مع العازلة تحلل وتم الكشف عن التفاعلات التي النشاف الغربي.

المناعي المجهري

تم إصلاح الخلايا في 4٪ paraformaldhyde في برنامج تلفزيوني أو ثابتة مع الميثانول البارد لمدة 5 دقائق (ل-γ تويولين صمة عار) وpermeabilized مع 0.2٪ تريتون X-100 في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق. تم غسلها الخلايا 3 × PBS وسدوا مع عازلة تمنع (1٪ BSA في PBS). وكانت مخففة الأجسام المضادة الأولية في عرقلة العازلة وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. تم غسلها الخلايا 3 × PBS، سدت مع عازلة تمنع، ثم حضنت مع فلور اليكسا 488 أو فلور اليكسا 568 المسمى الأجسام المضادة الثانوية (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا). كانت ملطخة النوى مع دابي (سيغما، سانت لويس، MO).

كلية زراعة الخلايا الأولية

الكلى من النوع البري وBbs7 - / - تم تشريح الفئران وتعقيمها قبل التنسيب إلى الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 ثوان، ثم مفروم مع مقص. تم غسلها الأنسجة مرة واحدة مع DMEM الباردة / F-12 دون المصل. 20 مل من pronase (1 ملغ / مل، روش، انديانابوليس، IN) وأضيف إلى الأنسجة والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم تم غسلها الأنسجة مرة واحدة مع DMEM الباردة / F-12 وحضنت مع 20 مل 1-× التربسين EDTA في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. تم مكعبات الأنسجة في 500 غ لمدة 5 دقائق وإعادة علقت في 30 مل DMEM / F-12 مع 10٪ مصل. كانت مطلية الأنسجة إعادة علقت في ثلاثة أطباق 10 سم مغلفة بولي-L-ليسين (سيغما، سانت لويس، MO).

السم الكوليرا وترانسفيرين مستقبلات الإلتقام

أجريت السم الكوليرا وترانسفيرين المستقبلة المقايسات الإلتقام كما وصفها هسياو وآخرون. (هسياو وآخرون 2009).

التصوير الكالسيوم

تم إجراء التصوير الكالسيوم كما هو موضح سابقا (شاه وآخرون، 2009). خلايا الكلى مثقف من النوع البري وBbs7 - / - تم تحميل الفئران مع 1 ميكرومتر Fura2 صباحا، تم تقييم التغييرات تركيز الكالسيوم في ظهائر باستخدام مجهر مقلوب (نيكون الكسوف TE200، نيكون انسترومنتس، ميلفيل، NY)، والبيانات تم تحليلها باستخدام برنامج شيكل، عناصر (نيكون). تم تطبيق ديناتونيوم apically في تركيزات المشار إليها. تم استخدام برنامج تلفزيوني عن السيطرة.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس