عرض مشاركة واحدة
  #34  
قديم 12-06-2015, 08:05 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي نمذجة عامل خطر التوحد لدى الفئران يؤدي إلى التقلبات المناعة دائم

 

http://www.pnas.org/content/109/31/12776.full




أدلة متزايدة يسلط الضوء على دور لجهاز المناعة في التسبب في اضطراب طيف التوحد (ASD)، كما لوحظ ديسريغولاتيون المناعة في الدماغ، المحيط، والجهاز الهضمي الأفراد ASD. وعلاوة على ذلك، إصابة الأم (تفعيل المناعي للأم، MIA) هو أحد عوامل الخطر لASD. نمذجة عامل المخاطرة في الفئران ينتج ذرية مع سلوكية وأعراض عصبية مرضية الكاردينال من ASD البشري. في هذه الدراسة، نجد أن أبناء الأمهات تنشيط مناعة عرض لمحات المناعية المعدلة وظيفة، والتي تتميز عجز النظامية في الخلايا التنظيمية CD4 + TCRβ + Foxp3 + CD25 + T، وزيادة IL-6 و IL-17 الانتاج CD4 + خلايا T، ومستويات مرتفعة من GR-1 + الخلايا الطرفية. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا الجذعية المكونة للدم من MIA ذرية يحمل غيرت إمكانات النسب الدم النخاعي والتمايز. ومن المثير للاهتمام، إعادة إسكانها السيطرة على الفئران المعرضة للإشعاع مع نخاع العظام المستمدة من MIA ذرية لا يمنح العجز المناعية المرتبطة MIA، تورط السياق البيئي الطرفية في البرمجة على المدى الطويل من الخلل المناعي. وعلاوة على ذلك، والشاذ سلوكيا ذرية MIA التي تم المشع وزرعها مع نخاع العظم الطبيعي مناعيا من أي MIA أو السيطرة على نسل لم يعد يحمل العجز في سلوكيات نمطية / التكرار والقلق المتشابهة، مما يوحي بأن شذوذ المناعية في MIA ذرية يمكن أن تسهم في ASD-ذات الصلة السلوكيات. هذه الدراسات تدعم وجود صلة بين التقلبات المناعة الخلوية والعجز السلوكية المتعلقة ASD في نموذج الفأر من عامل خطر التوحد.
التوحد هو اضطراب النمو العصبي المعقدة والاهتمام الطبي الضغط، مما يؤثر على أكثر من 1٪ من الأطفال في الولايات المتحدة (1). على الرغم من أن يتميز اضطراب طيف التوحد (ASD) من خلال السلوكيات النمطية واللغة والعجز الاجتماعي، تشير أدلة متزايدة على دور لجهاز المناعة في ASD المرضية. تم العثور على ملامح خلوى تغيير في الدماغ بعد الوفاة، السائل النخاعي، والبلازما في ASD، ولقد أثبتت العديد من الدراسات على عدد مرتفع وتفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية في الدماغ بعد الوفاة (2). هناك أيضا العديد من التقارير من تشوهات المناعة الطرفية في الأفراد المصابين بالتوحد، بما في ذلك زيادة نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية، التفاضلية ردود الوحيدات إلى التحفيز في المختبر، وتغيير مستويات المصل الإيج (3، 4).
تنشيط غير طبيعي في جهاز المناعة قد يكون أيضا المشاركة في مسببات مرض التوحد. ويرتبط العديد من الدراسات خطر ASD مع بالجينات المرتبطة بالمناعة مثل تلك ترميز MET مستقبلات التيروزين كيناز، PRKCB1، تكمل C4B، والنسخ المتنوعة HLA محددة (3، 4). بالإضافة إلى ذلك، يتم رفع الأجسام المضادة antibrain في بعض الأمصال ASD وفي بعض أمهات الأطفال المصابين بالتوحد (5 - 7). تظهر أفراد الأسرة من الأطفال الذين يعانون من التوحد، وخاصة الأمهات، ارتفاع عدد حالات الحساسية أو أمراض المناعة الذاتية (8، 9). وتمشيا مع مشاركة المناعة هي النتائج أن إصابة الأم هو أحد عوامل الخطر لمرض التوحد (2). بعد وباء الحصبة الألمانية 1964، 8-13٪ من الأطفال الذين ولدوا لأمهات مصابات بالمرض وضعت ملامح التوحد (10). في دراسة حديثة مسح جميع الأطفال الذين ولدوا في الدنمارك 1980-2005، تم العثور على ارتباط كبير جدا بين مرض التوحد والعدوى الفيروسية الأمهات خلال الأشهر الثلاثة الأولى من الحمل (11). وعلاوة على ذلك، يرتبط ارتفاع IFN-γ، IL-4، أو IL-5 في مصل الأم مع خطر متزايد للASD في النسل (12)، كما هو ارتفاع الوحيدات جاذب كيميائي البروتين-1 في السائل الذي يحيط بالجنين (13).
إذا كانت شذوذ المناعية في ASD تسهم فعلا في أعراضه سلوكية أو ما إذا كانت ظاهرة عارضة من الاعتلال العصبي الأساسي هو مسألة معلقة. الجهاز المناعي يعرض التفاعلات المتبادلة مدى الحياة مع النظام العصبي المركزي، وحقيقة أن الوضع المناعي يمكن أن تؤثر الاستجابات السلوكية ويتضح من الدراسات في وقت مبكر مما يدل على أن الردود على العدوى والالتهاب يتم ترحيل إلى الدماغ، مما يؤدي إلى تحريض الحمى والمرض السلوك (14). وعلاوة على ذلك، وإدارة بعض السيتوكينات لمواضيع الإنسان في كثير من الأحيان يسبب تغيرات ملحوظة في الحالة النفسية (15). على العكس من ذلك، يمكن أن الحالة العاطفية والنفسية تؤثر الوظيفة المناعية. ولعل أقوى دليل حتى الآن هو النتيجة أن كلا من المديين القصير والإجهاد تؤدي على المدى الطويل إلى اختلال وظيفة المناعة (16). كما تم المتورطين ديسريغولاتيون المناعة في المسببات مجموعة متنوعة من الاعصاب، النفسية، والاضطرابات العصبية النمائية، بما في ذلك الرعاش، هنتنغتون، وأمراض الزهايمر والتصلب المتعدد، الاكتئاب الشديد، والفصام، وإدمان (17 - 20).
وهنا نسأل ما إذا كان نموذج الفأر واظهار العديد من الميزات التوحد يعرض أيضا الوظيفة المناعية المعدلة. نستخدم تنشيط جهاز المناعة (MIA) نموذج الأمهات، والتي تقوم على إصابة الأم كعامل خطر بيئي رئيسي لمرض التوحد. يتم حقن الفئران الحوامل مع الاصطناعية، RNA المزدوج تقطعت بهم السبل، وبولي (I: C)، لبدء الاستجابة المضادة للفيروسات proinflammatory. هذا النوع من MIA ينتج ذرية مع أعراض سلوكية وعصبية مرضية الأساسية للتوحد، بما في ذلك انخفاض التفاعل الاجتماعي والتواصل غير طبيعي، نمطية / السلوك المتكرر، والعجز المقيد مكانيا في الخلايا العصبية (21، 22).
في هذه الدراسة، ونحن لمحة فرعية هامشية المناعة، وتقييم الأنشطة الفنية الأنساب الكريات البيض الرئيسية وتقييم إمكانية نسب الخلايا الجنينية والكبار للدم الجذعية (HSCs) والأسلاف. لاستكشاف إمكانية برمجة ما قبل الولادة من الخلل المناعي على المدى الطويل، ونحن فحص ما إذا كان نقل HSCs من MIA ذرية في غير MIA ذرية يمكن أن تحفز خلايا مستقلة شذوذ المناعية. للحصول على نظرة ثاقبة سواء شذوذ المناعية في MIA ذرية تسهم في التسبب في السلوكيات المتعلقة ASD، ونحن تقييم سلوكيا بولي (I: C) ذرية إسكانها مع نخاع العظم (BM) من ذرية المالحة. وتوضح النتائج التي توصلنا إليها أن التحدي المناعي خلال حياة ما قبل الولادة ويؤدي إلى تغييرات مناعية مستمرة في ذرية بعد الولادة، والتي يمكن أن تزيد من تأثير على تطوير أو صيانة السلوك الشاذ.
النتائج

MIA العجز النسل عرض في خلايا T التنظيمية ومرتفعة CD4 + T الردود خلية.

العديد من الدراسات من التقلبات المناعي في تقرير ASD البشري انحياز النمط الظاهري proinflammatory (3، 4). وبالتالي فإننا التحقيق الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) كما المكثفات معروفة من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. مقارنة مع الضوابط، والأبناء الراشدين من بولي (I: C) عرض أمهات -injected انخفاض ~50٪ في الطحال CD4 + Foxp3 + CD25 + Tregs (الشكل 1 A.). وينعكس هذا العجز أيضا في انخفاض مستويات بشكل ملحوظ من إجمالي CD4 + Foxp3 + الخلايا والانخفاضات الممكنة (P = 0.0846) في CD4 + Foxp3 + CD25 - خلايا T. ويلاحظ، وFoxp3 + CD25 + الخلايا أيضا في الغدد الليمفاوية المساريقي (MLNs) من بولي الكبار (I: C) - عجز مماثلة في مجموع CD4 + Foxp3 +، Foxp3 + CD25 ذرية (الشكل S1 A.). وعلى الرغم من هذه الاختلافات في مستويات Treg، لا يوجد فرق في قمع CD4 + CD25 - انتشار خلايا T بين Tregs من المياه المالحة مقابل بولي (I: C) ذرية (الشكل S2.). أخذت معا، وهذه النتائج تشير إلى وجود عجز النظامية في وفرة Tregs.

تين. 1.
MIA يؤدي إلى انخفاض مستويات Tregs وفرط الاستجابة في خلايا CD4 + T من الطحال من الأبناء الراشدين. (A) مقارنة مع الضوابط، وبولي الكبار (I: C) انخفض ذرية المعرض مستويات CD4 + Foxp3 + splenocytes وCD4 + Foxp3 + CD25 + Tregs = 5، حيث تمثل كل عينة مجموعة من ثلاثة الطحال). انخفض ذرية المعرض مستويات CD4 الطحال + TCRβ + Foxp3 + CD25 + Tregs، ولكن لا يوجد فرق كبير في CD4 الطحال + TCRβ + IFN-γ + 17 IL + خلايا Th17 + TH1 أو CD4: (B) بولي الكبار (C I) + TCRβ + IFN-γ - IL-17 + خلايا Th17 = 4، حيث تمثل كل عينة مجموعة من ثلاثة الطحال). (C) + CD4 T خلايا من الطحال من الأبناء الراشدين تفرز مستويات مرتفعة من IL-6 و IL-17 في استجابة لسلطة النقد الفلسطينية / التحفيز ionomycin. في المقابل، خلايا CD4 + T من الطحال من بولي الكبار (I: C) وذرية المالحة لا تختلف مستوى TNF-α يفرز = 11-16). * P <0.05، ** P <0.01 *** P <0.001؛ م، لم تكن كبيرة. تظهر جميع لوحات واحد تجربة تمثيلية من اثنين على الأقل محاكمات منفصلة.

اختبرنا كذلك MIA ذرية لمستويات IL-17-إنتاج CD4 + T (Th17) الخلايا، نظرا لطبيعتها proinflammatory وذكرت علاقة متبادلة مع Tregs. في المقايسات القيام به بالتوازي مع تلك الخاصة Tregs، لا نجد فرقا كبيرا من التحكم في مستويات CD4 + TCRβ + IL-17 + (Th17) الخلايا، مع أو من دون التعبير IFN-جاما (الشكل 1 B). لا توجد أيضا أي اختلاف في مستوى CD4 + TCRβ + IL-17 - IFN-γ + (TH1) الخلايا. لمواصلة دراسة خلايا CD4 + T، قمنا بقياس إفراز بهم من IL-6 و IL-17 ردا على التحفيز في المختبر. مقارنة مع الضوابط، CD4 + الخلايا من الطحال من بولي منذ 15 أسبوع (I: C) الإفراج ذرية بشكل ملحوظ أكثر IL-6 و IL-17 بعد التحفيز في المختبر، مع عدم وجود اختلاف في إفراز-TNF ألفا (الشكل 1 C ). وقد لوحظ هذه النتيجة بالمثل مع خلايا CD4 + T الطحال المستمدة من ذرية من العمر 3-فالتر كالين (الشكل S3 A) وذرية 1-Y عمره (الشكل S3 B) مما يدل على أن وقت مبكر من بداية الخلل المناعي المستمر. ومن المثير للاهتمام، وخلايا CD4 + T الطحال من الفئران القديمة 3-أسبوع-تنتج مستويات أقل بكثير من IL-17 من يفعل مثل هذه الخلايا من الأبناء الراشدين (0-10 جزء من الغرام / مل مقارنة مع 50-400 غ / مل)، مما يعكس عدم النضج المناعية ورد في الشباب مقابل الفئران والبشر البالغين (23). خلايا CD4 + T من MLNs بولي (I: C) ذرية أيضا hyperresponsive إلى التحفيز في المختبر، مما يشير إلى أن هذا الشذوذ هو شائع إلى الأجهزة اللمفاوية الثانوية (الشكل S1 C و D.). عموما، MIA يؤدي إلى خفض مستويات Treg والاستجابة T خلايا CD4 + مرتفعة في الطحال وMLNs من MIA ذرية. ويمكن وصف هذه النتيجة بمثابة استمرار، proinflammatory النمط الظاهري T-المساعد خلايا.

MIA النسل عرض زيادة مستويات GR-1 + خلايا ومنحرفة HSC التمايز.

لتحديد ما إذا MIA أثناء التطور الجنيني يغير هوية فرعية مناعية أخرى في النسل، قمنا بتقييم الطبقات الكريات البيض الرئيسية في الطحال من بولي (I: C) وذرية المالحة. مقارنة مع الضوابط، وبولي الكبار (I: C) ذرية يحمل 1.5 أضعاف مستوى أعلى من GR-1 + الخلايا وزيادة تتجه في CD11b + الخلايا (P = 0.1256) (الشكل 2 A.). في المقابل، لا يوجد فرق من التحكم في النسب المئوية من إجمالي B220 + B الخلايا، والخلايا NK1.1 + NK، خلايا CD4 + T، أو خلايا CD8 + T. وعلاوة على ذلك، تم الكشف عن عدم وجود اختلافات كبيرة لأي من أنواع فرعية الكريات البيض الأولية في MLNs (الشكل S1 B).

تين. 2.
MIA يؤدي إلى زيادة مستويات GR-1 + خلايا الطحال في الأبناء الراشدين والتمايز تفضيلية من HSCs في السلائف محببة في ذرية الجنين والكبار. (A) الطحال من بولي الكبار (I: C) ذرية المعرض زيادة مستويات GR-1 + خلايا وجود فروق ذات دلالة في الأنساب الرئيسية الأخرى مقارنة مع الضوابط = 4، حيث تمثل كل عينة مجموعة من ثلاثة الطحال). (B) وبالمقارنة مع BM HSCs من السيطرة ذرية، BM HSCs من بولي الكبار (I: C) عرض ذرية زيادة التمايز في السلائف CFU-G وانخفض التمايز في وقت مبكر السلائف CFU-GM = 4). مقارنة مع الضوابط، HSCs الكبد الجنين من يوم الجنينية (E) 13.5 (C، يسار) وE15.5 (C، يمين) بولي (I: C) ذرية أيضا عرض ازدياد التمايز في CFU-G وانخفض التمايز في CFU-GM ، بالإضافة إلى انخفاض نسب CFU-GEMM مع E13.5 HSCs وزيادة نسب CFU-E مع E15.5 HSCs = 4، حيث تمثل كل عينة مجموعة من الخلايا من ستة كبد الجنين من القمامة واحدة). * P <0.05، ** P <0.01 *** P <0.001؛ م، لم تكن كبيرة. جميع لوحات تمثل واحدة تجربة تمثيلية من اثنين على الأقل محاكمات منفصلة.

GR-1 + خلايا تعكس مجموعة غير متجانسة من أنواع فرعية المناعية التي تضم العدلات وحيدات، وخلايا التهابية، والخلايا القامع، على حد سواء. لتحديد ما إذا كانت مستويات مرتفعة من GR-1 + خلايا لوحظ في بولي (I: C) يمكن أن يعزى الطحال لخاصة GR-1 + فرعية، وتتميز نحن كذلك الطحال GR-1 + السكان الذين يستخدمون CD11b، Ly6C، وعلامات Ly6G . ومن المثير للاهتمام، وبولي (I: C) ذرية تظهر زيادة معتدلة في جميع السكان ثلاثة من GR-1 + خلايا حلها: (ط) GR-1 مرحبا CD11b + Ly6C منتصف Ly6G منتصف SSC مرحبا، (ب) GR-1 منتصف CD11b + Ly6C منتصف Ly6G منتصف SSC منتصف، و (ج) GR-1 منتصف CD11b + Ly6C مرحبا Ly6G- SSC لو (الشكل. S4). GR-1 + فرعية الأول والثاني ويشار إلى العدلات، عن طريق الأنسجة وتمشيا مع التفاصيل العالية، ويتم تحديد النوع الفرعي الثالث كما يبلغ عدد سكانها الوحيدات (24). عموما، أن بولي (I: C) ذرية زيادة العرض في كل حددت GR-1 + السكان تشير إلى أن انحراف في شهادة الثانوية العامة أو مستوى السلف قد تكمن وراء ارتفاع GR-1 النمط الظاهري لوحظ في بولي الكبار (I: C) ذرية مقارنة مع الضوابط .
لتقييم أصل الزيادة في الطحال GR-1 + خلايا، قمنا بتقييم إمكانية النسب وتمايز الخلايا BM من بولي الكبار (I: C) مقابل ذرية المالحة. باستخدام الفحص تشكيل مستعمرة لتقييم شكليا النسب التمايز، نجد أن HSCs والأسلاف من بولي (I: C) زيادة النسل BM معرض التمايز في CFU-G (محببة) السلائف وانخفض التمايز في وقت مبكر CFU-GM (محببة-بلعم ) السلائف (الشكل 2 B). وتطرق إلى الجنين، نجد أن التمايز مماثل لوحظ مع HSCs الكبد الجنين والأسلاف من بولي (I: C) ذرية (الشكل 2 C). وهكذا، MIA يدفع التمايز تفضيلية من الجنين وكذلك HSCs الكبار والأسلاف إلى السلائف محببة، والتي قد تكون مسؤولة عن زيادة مستويات GR-1 + خلايا ناضجة في الطحال من بولي (I: C) ذرية مقارنة مع الضوابط.

شذوذ المناعية لوحظ في MIA النسل لا يتم نقل عبر BM زراعة.

بياناتنا تظهر أن MIA يؤدي إلى الملف الشخصي تغير من الخلايا المناعية الطرفية في النسل، وتتميز انخفاض مستويات Tregs، خلايا CD4 + T hyperresponsive، ومستويات مرتفعة من GR-1 + الخلايا. لاستكشاف ما إذا كانت هذه الشذوذات المناعية (والنمط الظاهري GR-1، على وجه الخصوص) يمكن أن يعزى إلى البرمجة التنموية للHSCs خلايا الجوهرية، قمنا بنقل BM من بولي الشاذة مناعيا (I: C) ذرية في المياه المالحة المشع وبولي (I : C) ذرية وتقييم ما إذا كانت إعادة تأسيس أي شذوذ المناعية MIA المصاحب.
نجد أن المياه المالحة وبولي (I: C) ذرية التي تم المشع وأعيد مع بولي (I: C) BM لا تتطور أو الاحتفاظ بأي من تشوهات المناعة التي أظهرتها unmanipulated MIA ذرية. جميع الفئات المستويات المعرض BM المزروعة من الطحال CD4 + CD25 + + TCRβ Foxp3 + Tregs وGR-1 + الخلايا التي هي مماثلة لتلك التي لوحظت في ذرية المالحة untransplanted (الشكل 3 أ و ب). كما لا يوجد فرق بين المياه المالحة والفئران BM المزروعة في توزيع فرعية السلف بعد في المختبر تمايز BM HSCs (الشكل S5). وعلاوة على ذلك، خلايا CD4 + T معزولة عن الطحال أي من أنواع الفئران BM المزروعة-تفرز مستويات IL-6 و IL-17 ردا على phorbol 12 ميريستيت 13-خلات (PMA) / ionomycin التحفيز التي هي مماثلة لتلك التي التي تنتجها خلايا CD4 + T معزولة عن الطحال من untransplanted ذرية المالحة (الشكل 3 C). الأهم من ذلك، أن الفئران المالحة زرعها مع مستويات الملوحة عرض BM ما يعادل Tregs وGR-1 + خلايا ومماثل CD4 + الاستجابة T-خلية لتلك التي لوحظت في ذرية المالحة unmanipulated تشير إلى أن الإشعاع وBM-زرع الإجراء في حد ذاته لا تحرف ملامح نظام المناعة في ظل هذه الظروف. عموما، هذه التجارب تشير إلى أن MIA المرتبطة الشذوذات المناعية لا يتم نقل عبر زرع بولي (I: C) BM إلى المالحة المشع أو بولي (I: C) ذرية. وتشير هذه النتيجة إما أن المكروية HSC مهمة للحفاظ على تغيير إمكانات شهادة الثانوية العامة في MIA النسل، أو أن لا يتم برمجة MIA المرتبطة شذوذ المناعي بشكل خاص على مستوى الخلايا الجذعية.

تين. 3.
لا يتم نقلها شذوذ المناعية التي لوحظت في MIA ذرية من قبل BM زرع في الفئران المشع. (A) وليس هناك فرق في مستويات الطحال CD4 + CD25 + + TCRβ Foxp3 + Tregs بين المالحة أو بولي (I: C) ذرية المزروعة مع BM من المياه المالحة أو بولي (I: C) ذرية. مستويات Tregs الطحال بين BM الجماعات زرع مماثلة لتلك التي لوحظت في ذرية المالحة untransplanted. بولي untransplanted (I: C) ذرية عرض عجزا كبيرا في نسبة Treg = 4-5). لا تعرض الفئران (B) BM-زرع MIA المرتبطة الزيادات في GR-1 + خلايا الطحال. نسب GR-1 + خلايا قابلة للمقارنة بين الجماعات BM المزروعة وuntransplanted ذرية المالحة = 4-5)، ولكن بولي untransplanted (I: C) ذرية المعرض مستويات مرتفعة بشكل ملحوظ من GR-1 + خلايا الطحال. خلايا (C) + CD4 T من الفئران BM-زرع يحمل إحصائيا مستويات مماثلة من IL-6 (يسار) وIL-17 (يمين) في استجابة لسلطة النقد الفلسطينية / التحفيز ionomycin في المختبر. لا توجد فروق بين تركيزات IL-6 و IL-17 التي يفرزها CD4 + الخلايا من مجموعة BM المزروعة ومن ذرية المالحة untransplanted، على الرغم من فرط الاستجابة كبير من خلايا CD4 + T من بولي (I: C) ذرية [ن ​​= 11 -16 لالمالحة وبولي (I: C) مجموعات، 4-5 للمجموعات زرع BM]. * P <0.05، ** P <0.01. تم الحصول على بيانات زرع BM من تجربة واحدة كبيرة.


تين. 4.
MIA ذرية المشع وزرع بمحلول ملحي BM المعرض انخفض السلوك المتكرر ومثل القلق. (A) التشعيع وزرع المالحة BM إلى MIA ذرية يعيد سلوك دفن الرخام المتكررة إلى مستوى عند أو أقل من تلك التي لوحظت في الضوابط. (B) التشعيع وزرع المالحة BM إلى MIA ذرية يقلل السلوك مثل القلق مقاسا زيادات كبيرة في عدد من مداخل المركز (مركز) ومدته في الساحة المركز (يسار)، مقارنة مع تلك التي لوحظت في الفئران MIA untransplanted. كلا المالحة وبولي (I: C) الفئران BM-زرع أيضا تظهر تزايد النشاط العام في المجال مفتوحا، إذا ما قيست زيادة كبيرة المسافة الإجمالية سافر مقارنة مع الفئران untransplanted (يمين). (C) زرع ذرية المالحة BM في بولي (I: C) ذرية ليس له تأثير كبير على سلوكهم تفضيل الاجتماعي، مقاسا مدة الغرفة (يسار). هناك، ومع ذلك، تحسن تتجه في السلوك الاجتماعي تفضيل مقاسا تردد غرفة في BM-زرع MIA ذرية (يمين). * P <0.05، ** P <0.01؛ م، لم تكن كبيرة. تم الحصول على بيانات BM-زرع من تجربة واحدة كبيرة.

BM زرع في MIA النسل طبيعتها المتكرر والقلق على غرار السلوكية شذوذ.

للتحقيق في ما إذا كان الشذوذ المناعية الموجودة في MIA ذرية هي أمراض مواز مستقل أو إذا كانت تساهم فعليا في تطوير أو صيانة السلوكيات ASD الشبيهة، قمنا بتقييم الأداء السلوكي في بولي (I: C) ذرية المزروعة بمحلول ملحي BM. وأكد: (C I) ذرية لأول مرة لعرض الظواهر السلوكية المتوقعة أمام إجراء بولي. مقارنة مع الضوابط، وبولي (I: C) ذرية عرض عجزا في تثبيط prepulse (PPI) (الشكل S6 A.). يستخدم PPI لقياس الحسية النابضة من رد الفعل جفل، وانخفضت كثيرا ما لوحظ PPI في الأفراد المصابين بالتوحد (25). بولي (I: C) ذرية كما تظهر عليهم أعراض سلوكية أساسية من مرض التوحد، بما في ذلك زيادة تكرار السلوك إذا ما قيست مستويات أعلى من دفن الرخام النمطية وانخفض تفضيل الاجتماعي، وفقا لتقييم تخفيض مدة المستهلك والإدخالات في السكن غرفة ماوس رواية مقابل الماوس مألوفة (الشكل. S6 B و C). وبالإضافة إلى ذلك، ارتفع MIA ذرية المعرض القلق، كما يتضح من انخفاض مدة قضى، والدخول الى، الساحة وسط حقل مفتوح، على الرغم من عدم اختلاف كبير في المسافة الإجمالية سافر (الشكل. S6 D).
بعد هذا الاختبار السلوكي الأولي، تم المشع الفئران وزرعها مع BM المانحة حصادها سواء من الكبار أو المالحة بولي (I: C) ذرية. والجدير بالذكر أن ومحمية رؤساء الماوس أثناء إجراء للحد من الآثار المعروفة للإشعاع على تكوين الخلايا العصبية وتفعيل الدبقية، ويحول دون أي تأثيرات المصب المرتبطة بها على الأداء السلوكي. وعلاوة على ذلك، MIA ذرية لا يحمل التغيرات العالمية في مستويات المنشط أو مجموع الضامة الدماغ / الخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل S7)، مما يوحي بأن تشوهات دبقية لا تساهم في استمرار السلوكيات المتعلقة ASD في هذه الفئران.
بعد التشعيع وزرع بمحلول ملحي BM، MIA ذرية لم تعد تظهر الانحرافات السلوكية في العديد من هذه الاختبارات. التشعيع والمالحة BM زرع في بولي (I: C) ذرية يعيد دفن الرخام المتكررة إلى المستويات التي سجلت في الضوابط المالحة (الشكل 4 A.). بالإضافة إلى ذلك، المشع وBM-زرع MIA ذرية المعرض انخفضت بشكل ملحوظ مثل السلوك والقلق، والتي تقاس مدة مرتفعة من الوقت الذي يقضيه وإدخالات في الساحة وسط الميدان مفتوح (الشكل 4 B). ومن المثير للاهتمام، سواء المالحة وبولي (I: C) BM زرع الفئران المعرض عدد متزايد من إدخالات مركز مقارنة مع ذرية untransplanted. وينعكس هذا الاستنتاج مماثل زيادة ذات دلالة إحصائية في المسافة الإجمالية التي يقطعها ذرية المزروعة مقابل الضوابط untransplanted. قد يكون هذا الاستنتاج نتيجة لآثار الإجراء التشعيع وزرع على السلوك بدلا من التعود على الفئران لاختبار المتكررة، لأننا قادرون على تكرار العجز المجال مفتوح من شدة ما يعادلها في بولي (I: C) ذرية بعد إعادة الاختبار في مختلف الأعمار الكبار (الشكل S8). من ناحية أخرى، وعلاج بولي (I: C) ذرية بمحلول ملحي BM ليس له تأثير كبير على العجز في تفضيل الاجتماعي، مقاسا مدة وعدد الإدخالات في غرفة الاجتماعية (الشكل 4 C.).
على الرغم من أن علاج MIA ذرية مع التشعيع والمالحة BM زرع يعيد إلى حد كبير سلوك طبيعي في العديد من الاختبارات، نجد أن علاج MIA ذرية مع التشعيع وبولي (I: C) BM زرع يحسن أيضا تلك السلوكيات. والجدير بالذكر أن المشع MIA ذرية المزروعة مع بولي (I: C) BM معرض تحسين المجال مفتوحا والأداء ودفن الرخام (الشكل S9.). هذه النتيجة تتفق مع ما توصلت إليه أن زرع بولي (I: C) BM لا تؤدي الى خلية مستقلة تشوهات المناعي (الشكل 3). على هذا النحو، على حد سواء بولي (I: C) ويمكن اعتبار BM والمالحة BM العادي مناعيا في هذه التجارب. معا، وتظهر هذه البيانات التي MIA ذرية التي عرضت سابقا السلوكيات الشاذة تفشل لعرض تكرار السلوك ومثل القلق بعد التعرض للإشعاع وBM زرع.

نقاش

في هذه الدراسة أن نحدد الاختلافات في الاستجابات المناعية الخلوية الحيوية في نموذج الفأر من عامل خطر التوحد. نسل الأمهات تنشيط المناعة تطوير الشخصية المتغيرة المناعي وظيفة في الطحال وMLN، التي تتفق مع النمط الظاهري proinflammatory. وبالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر التمايز النخاعي تفضيلية من HSCs والأسلاف الجنين، وهي موجودة أيضا في HSCs الكبار. هذا الاستنتاج يمكن أن تشكل أساسا لتوزيع المناعية المعدلة في الأجهزة اللمفاوية الثانوية من MIA ذرية. ومع ذلك، زرع BM من HSCs المستمدة من MIA ذرية لا يكفي أن ألخص مستويات مرتفعة من GR-1 + الخلايا التي أظهرتها untransplanted MIA ذرية. هذه النتيجة تسلط الضوء على أهمية العظة البيئية المناسبة للحفاظ على هذا النمط الظاهري، كما هو مبين أدناه. كما استخدمنا نهج زرع التشعيع-BM لاستكشاف دور الخلل المناعي الطرفية على الأداء السلوكي. ومن المثير للاهتمام، هذا الإجراء بتصحيح بعض الأعراض السلوكية ASD تشبه في النسل MIA.
MIA يؤدي إلى دائمة خلايا CD4 + T hyperresponsive، وكذلك انخفضت Tregs في النسل، مما يشير إلى مزمنة، النمط الظاهري proinflammatory. وتتوافق هذه النتيجة مع انخفاض أعداد CD4 + CD25 + والخلايا CD3 + T + GITR لوحظ في الأطفال مع ASD (26، 27). قد يعكس تضاؤل ​​مستويات Treg وما يرتبط بها من النقص في التنظيم المناعي النتيجة أن الأفراد الذين يعانون من التوحد المعرض انخفاض مستويات السيتوكينات التنظيمية، مثل TGF-β1، وزيادة مستويات السيتوكينات proinflammatory في مصل الدم، الدماغ السائل المخي الشوكي وبعد الوفاة (2). وعلاوة على ذلك، بالنظر إلى أن Tregs هي حاسمة للحد من تنشيط جهاز المناعة ومنع التفاعل الذاتي، نقص بهم قد تكمن وراء التقارير على وجود صلة بين ASD وأمراض المناعة الذاتية (8، 28).
اكتشافنا أن خلايا CD4 + T من MIA ذرية هي hyperresponsive لفي المختبر تحفيز مزيد يعكس توازن المناعة تقلص. ولوحظت زيادات في تنشيط خلايا DR + T في التوحد البشري (29، 30). بالإضافة إلى ذلك، توجد مستويات مرتفعة من الخلايا T-TNF ألفا وIFN-γ المنتجة في الدم المحيطي والغشاء المخاطي المعوي من الأفراد التوحديين (31). وقد أفاد عدد من غيرها من الاستجابات المناعية المعدلة في ASD (3، 4)، ونجد أن MIA ذرية أيضا يحمل بعض هذه التغيرات، بما في ذلك مجموعات فرعية الكريات البيض CD4 + تغيير والردود T-الخلية إلى التحفيز. هذا التداخل بين نتائج التقلبات المناعة في ASD والنتائج الحالية لدينا يضفي الدعم لMIA كنموذج الفأر مع بناء وصحة الوجه لهذا الاضطراب.
علينا أن نبرهن أيضا أن MIA أثناء التطور الجنيني يؤدي إلى زيادة كبيرة في مستويات هامشية GR-1 + CD11b + العدلات وخلايا الوحيدات في الأبناء الراشدين. وعادة ما يلاحظ كثرة المحببات بعد التهاب حاد (32، 33) وأيضا سمة من عدد من الأمراض المزمنة (34 - 36). لم تكن هناك تقارير عن مستويات العدلات تغيير في ASD، ولكن. في دراسة واحدة، والأطفال الذين يعانون من التوحد أظهرت زيادة التهم الوحيدات البلازما، ولكن لا تشوهات كبيرة في أنواع فرعية محببة الكبرى (37). في ضوء النتائج الحالية، وسوف تكون ذات فائدة للتمديد هذه الدراسات immunophenotypic إلى القطعان السلوكية أو أعراض الأفراد ASD.
ومن المثير للاهتمام أن نرى أن آثار MIA على HSCs النامية قد تكمن وراء بعض التغيرات المناعية الطرفية استمرار وجود في النسل. نجد أن كلا من البالغين وHSCs والخلايا الاصلية الجنين عرض التمايز التفضيلي إلى مستعمرات CFU-G، الذي يقدم تفسيرا لكيف يمكن الحفاظ على زيادات في مثل هذه الخلايا قصيرة الأجل على مدى عمر MIA ذرية. ومن المعروف الحقن للحث على زيادة كبيرة في السيتوكينات proinflammatory في المشيمة، مكانة شهادة الثانوية العامة الرئيسية خلال midgestation (: بولي الأمهات (C I) 38). لأن HSCs والأسلاف تستجيب لإشارات التهابات، مثل السيتوكينات وبروابط مستقبلات تول مثل، سيكون من المثير للاهتمام أن استكشاف ما إذا كانت التغييرات MIA التي يسببها في البيئة HSC يمكن أن يميل القرارات النسب المكونة للدم ومصير.
على الرغم من أن HSCs والأسلاف عزل من بولي (I: C) ذرية وتميل تنمويا نحو السلائف محببة، زرع BM من بولي (I: C) ذرية في المشع ذرية المالحة أو العودة إلى بولي المشع (I: C) ذرية لا يتم نقل النمط الظاهري GR-1. وتشير هذه النتيجة أن البرمجة التنموية للHSCs إلى الانحراف لا يخضع التمايز النسب في MIA ذرية فقط بعوامل خلايا الجوهرية المشفرة ثابت، مثل تعديل جينية. بدلا من ذلك، فمن المرجح أن بيئة الطرفية MIA التي يسببها ضرورية لتزويد العظة التي توجه التنمية الدم النخاعي تفضيلية. التغييرات في G-CSF، IL-5، وIL-3 مستويات، على سبيل المثال، وتورط في صقل النشاط عامل النسخ الذي يحكم اختيار النسب عن الأسلاف محببة / البلاعم (39). في الواقع، لقد وجدنا أن MIA ذرية تظهر دينامية وتغير مزمن في الدم المحيطي وملامح خلوى الطحال (40). وسوف تكون ذات فائدة لتقييم ما إذا المكروية BM تختلف في بولي (I: C) وذرية المالحة. عموما، فمن المثير للاهتمام أن النمط الظاهري GR-1 لاحظ في MIA ذرية لا ينقل عبر BM زرع، مما يشير إلى عدم وجود ما يكفي من خلايا الجوهرية برمجة جينية ودور رئيسي للعوامل البيئية في الترويج لهذا خيار النسب.
علينا أن نبرهن على إخضاع ذرية MIA التي صادق العجز السلوكية للأشعة وإعادة مع BM العادي مناعيا يغير النمط الظاهري السلوكية. وهي هذه MIA ذرية لم يعد يحمل تشوهات خلال الجلسة السابقة في تكرار دفن الرخام والميدان مفتوح الاستكشاف. هذه النتائج تعني أن تصحيح الوظيفة المناعية يمكن تصحيح بعض الانحرافات السلوكية المرتبطة بالتوحد. ومع ذلك، هذه التجربة وجود قيود كبيرة. في حالة عدم وجود مراقبة إيجابية (MIA ذرية التي تحتفظ العجز السلوكية بعد التشعيع وزرع BM)، ونحن غير قادرين على التمييز بين الآثار التصالحية المحتملة للBM نفسها (وهذا هو، والآثار المترتبة على استعادة النمط الظاهري المناعي) مقابل تأثير العوامل المربكة المرتبطة إجراء عملية زرع. الأكثر وضوحا من هذه هو تأثير الإشعاع على مختلف جوانب التوازن المتلقي، بما في ذلك وظيفة التمثيل الغذائي، وتكوين الجراثيم المعوية، والاكسدة، والتي قد تؤثر بشكل غير مباشر نتيجة سلوكية. نحن، ومع ذلك، مستوحاة من التظاهر الأعمال الأخيرة التي نمطية السلوك الاستمالة في فئرانا معدلة وراثيا Hoxb8 هو، في الواقع، للتحويل عبر BM زراعة (41). وهذا يدل على العثور، على الأقل في هذا النموذج التجريبي، يمكن أن الفئران إعادة تكوين وجود ضعف في السلوك المتوقع عبر BM زرع على الرغم من أشعة مسبق. سيكون من المهم استكشاف نهج تجريبية أخرى لعلاج ضعف المناعة في MIA ذرية ومواصلة تقييم ما إذا كانت هذه النتائج يمكن أن تخفف السلوكية.
ومع ذلك، النتيجة في أن الانحرافات السلوكية في النسل MIA يمكن تصحيحها عن طريق إجراء عملية زرع التشعيع-BM يساهم في عدد متزايد من الدراسات الإبلاغ عن فعالية BM زرع على تخفيف أعراض الاضطرابات العصبية (41 - 43). وعلاوة على ذلك، العديد من التجارب باستخدام RAG1 KO، SCID، والفئران athymic تثبت أن الخلل المناعي الأولي يمكن أن يؤدي إلى ضعف السلوكية (44 - 47). ومن المثير للاهتمام، والعمل مع خالية من الجراثيم الفئران يربط غياب الجراثيم والتعديلات المرتبطة بها في الجهاز المناعي لأداء السلوك الشاذ (48). وقد وصفت بعض التعديلات المناعية في نموذج حمض فالبرويك الأمهات وسلالة الماوس BTBR التي تعرض الميزات السلوكية للتوحد (49، 50). في المقابل، لا يزال هناك الكثير الذي يمكن تعلمه عن التغيرات المناعية المحتملة في نماذج الماوس من ASD الجينات المرشحة. واحدة من هذه الجينات هو جاذبية خاصة في هذا الصدد، MET، الذي يشفر مستقبلات التيروزين كيناز وكما هو معروف أن تلعب دورا في تنظيم جهاز المناعة (51).
وترتبط ملامح المناعة المحيطية المتغيرة والنشاط الخلوي أيضا يعانون من إعاقات سلوكية أساسية في ASD البشري. زيادة مستويات البلازما IL-4 ترتبط مع عجز أكبر في مجال الاتصالات، وزيادة البلازما IL-8، ترتبط IL-12p40، IL-6، وIL-1β إلى الرتابة، وفرط النشاط، وعشرات الخمول من الأطفال ASD (52). مستويات غيرت من العوامل المناعية الأخرى، بما في ذلك TGF، بلعم عامل مثبط للهجرة (MIF)، وCD31، كما تم المرتبطة شدة السلوكيات المتعلقة ASD أو الفيزيولوجيا المرضية (4). وبالإضافة إلى ذلك، ترتبط انخفاض مستويات مفتش البلازما والغلوبولين المناعي مع شدة السلوكية في الأطفال ASD (53).
ومن الملفت للنظر أنه في نموذج الفأر من عامل خطر بيئي التوحد أن يسلك سلوكية وأعراض عصبية مرضية الكاردينال التوحد، وهناك أيضا دائم ديسريغولاتيون المناعة الطرفية. يوفر هذا الاكتشاف فرصة لاستكشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء العلاقة بين اختلال وظيفي في الدماغ ومناعة المتغيرة في مظهر من مظاهر السلوك الشاذ. وعلاوة على ذلك، يوفر هذا الاكتشاف منبرا للتحقق في كيفية وتحديات ما قبل الولادة يمكن أن برنامج طويل الأجل بعد الولادة الحصانة، والصحة، والمرض. الأمهات بوساطة إهانة تعديل جينية في خلايا شهادة الثانوية العامة والسلف هو واحد آلية محتملة لكيفية يجوز إنشاء تأثيرات تغيرات البيئية عابرة حتى الآن لا تزال قائمة بشكل دائم في مرحلة البلوغ. ومع ذلك، تشير نتائج زرع BM أن البيئة المحيطة من نسل MIA أمر بالغ الأهمية أيضا للحفاظ على الدولة المناعية المعدلة بشكل دائم.

طرق

يتم توفير طرق مفصلة في طرق SI.
MIA.

تم حقن الفئران الحوامل C57BL / 6N على E12.5 بمحلول ملحي أو بولي (I: C). للبولي (I: C) الحقن، وبولي (I: C) تم حل ملح البوتاسيوم (سيغما الدريتش) في المياه المالحة في 4 ملغ / مل وتدار البريتونى على 20 ملغ / كلغ [على أساس الوزن للبولي (I: C ) نفسه، وليس بما في ذلك الوزن الكلي للملح البوتاسيوم]. تم حقن الفئران التحكم مع المالحة وحدها في 5 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم.

CD4 + T الخلية في المختبر تحفيز.

10 6 CD4 + كانت خلايا T مثقف في كامل RPMI مع سلطة النقد الفلسطينية (50 نانوغرام / مل) وionomycin (750 نانوغرام / مل) لمدة 3 د عند 37 درجة مئوية مع 5٪ (المجلد / المجلد) CO 2. كل يوم، تم جمع 0.5 مل طاف. ELISA لكشف IL-6، IL-17، وأجريت TNF-α وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (eBioscience).

التدفق الخلوي.

للتصنيف الفرعي من GR-1 + splenocytes، كانت ملطخة الخلايا مع GR-1-APC، CD11b-PE، Ly6G-APC، Ly6C-FITC، وTer119-PerCP-Cy5.5 (Biolegend). للكشف عن خلايا Th17 وTregs، وحفز splenocytes لمدة 4 ساعات مع سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin بحضور GolgiPLUG (BD العلوم البيولوجية). وأغلقت تعليق لمستقبلات التيسير وصفت مع CD4-FITC، TCRb-PerCP-Cy5.5، وCD25-PE قبل وضع العلامات مع IFN-γ-PE وFoxp3-APC (eBioscience). تم تجهيز العينات باستخدام FACSCalibur الكريات (BD العلوم البيولوجية). وقد تم تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo (TreeStar).

ميثيل مستعمرة تشكيل الفحص.

2 × 10 5 أضيفت خلايا الكبد أو BM الجنين إلى 3 مل من ميثيل إذابة تستكمل مع SCF، IL-3، IL-6، وإبو (StemCell). تم احتساب مجموع عدد مستعمرة في يوم 5، وأكد أن يعادل بين المجموعات. كفو-G، -M، -E (محمر)، -GM، والمستعمرات -GEMM وسجل عمياء في يوم 12 وفقا لبروتوكولات القياسية.

BM زرع.

سلوكيا تم حقن اختبار، فئران عمرها 9 فالتر كالين-البريتونى مع جرعة عالية من الكيتامين / زيلازين (5.6 ميكرولتر / 1 غ لكل الماوس) والمشع القاتلة (1000 راد) مع رؤساء محمية من قبل 4 ملم الرصاص. وأكد فعالية الدروع رأسه الشيب انتقائية من اللون الأسود معطف في المنطقة المعرضة للإشعاع. تم تخدير الفئران تعافى مع isofluorane وحقن الرجعية orbitally مع 5 × 10 6 خلايا BM المانحة. تم اختبار الفئران في النماذج السلوكية في 17-19 أسبوع من العمر، وقتل لفحوصات مناعية في 19-20 أسبوع من العمر.

اختبار السلوكية.

في 6-8 أسبوع من العمر، وخضعوا للاختبار الفئران سلوكيا لPPI، التنقيب في حقول مكشوفة، دفن الرخام المتكررة، وتفضيل الاجتماعي (22، 38، 54، 55). بعد ثمانية أسابيع زرع، تم اختبار الفئران على نحو مماثل في جميع النماذج ولكن PPI لPPI أداء حساس للغاية لمعالجة واختبار تجربة السابقة (56).

التحليل الإحصائي.

تم إجراء التحليل الإحصائي مع بريزم البرمجيات (Graphpad). تم تقييم الاختلافات بين مجموعات العلاج اثنين من استخدام الطلاب ر الاختبار، وجرى تقييم الاختلافات بين مجموعات متعددة باستخدام باتجاه واحد ANOVA وBonferroni الاختبار اللاحق. وقد استخدم في اتجاهين ANOVA وBonferroni الاختبار اللاحق للPPI، CD4 + T الخلية التحفيز وبيانات ميثيل الفحص

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس