عرض مشاركة واحدة
  #12  
قديم 11-22-2015, 10:38 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي تكوين الوحدة الفرعية متغير والأنسجة محددة من الميتوكوندريا م -aaa البروتياز مجمعات ترتبط راثي مشلول الشلل النصفي

 

http://mcb.asm.org/content/27/2/758.full

البروتيني م -AAA، مجمع بروتين ATP التي تعتمد في الغشاء الداخلي الميتوكوندريا، يتحكم جودة البروتين وينظم التجمع الريبوسوم، وبالتالي ممارسة مهام التدبير المنزلي الأساسية داخل الميتوكوندريا. الطفرات في م -AAA البروتيني فرعية paraplegin تسبب انحطاط محور عصبي وراثي في الشلل النصفي التشنجي (HSP)، ولكن ليست مفهومة أساس لخصوصية الأنسجة غير متوقعة. Paraplegin يجمع مع مفارز Afg3l2 مثلي في المجمعات مغاير بلازميدة قليلة القسيمات التي يمكن أن تكون بديلا عن البروتياز الخميرة م -AAA، مما يدل على الحفظ وظيفية. وظيفة من paralogue الثالث، أعرب Afg3l1 في الماوس، غير معروف. هنا، نحن نحلل تجميع paraplegin إلى متر المجمعات -AAA ورصد الآثار المترتبة على نقص paraplegin في الخلايا الليفية HSP ونموذج الفأر لHSP. تكشف النتائج التي توصلنا إليها التغير في التجمع البروتياز م -AAA في الميتوكوندريا في الأنسجة المختلفة. يمكن تشكيلها Afg3l1 وAfg3l2 مجمعات للوطي بلازميدة قليلة القسيمات والمجالس-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات كل من البروتينات مع paraplegin. وتبين الدراسات تكامل الخميرة النشاط بروتين من هذه التجمعات. نقص Paraplegin في HSP لا يؤدي إلى فقدان م -AAA نشاط الأنزيم البروتيني في الميتوكوندريا الدماغ. بدلا من ذلك، المجمعات Afg3l2-وطي بلازميدة قليلة القسيمات تتراكم، ويمكن لهذه المجمعات بديلا عن مهام تدبير الشؤون المنزلية م المجمعات -AAA التي تحتوي على paraplegin. لذا فإننا نقترح تشكيل م البروتياز -AAA مع خصوصيات الركيزة تغييرها يؤدي إلى انحطاط محور عصبي في HSP.

الميتوكوندريا هي عضيات الأساسية وتنوعا. وتؤوي تلك المجمعات الجهاز التنفسي المنتجة للطاقة وتمثل المكان الرئيسي لإنتاج الأكسجين التفاعلي المحمول، ولكنها تحمل أيضا ردود فعل الابتنائية حاسمة وظائف مهمة خلال العمليات أفكارك والإشارات الخلوية. كشفت المسوحات البروتين الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة الثدييات المختلفة براعة كبيرة في تكوين البروتين من العضيات، والذي قد يعكس مختلف الاحتياجات الأيضية والمنشطة في خلايا مختلفة (14، 25). ونظرا لأهمية هذه العضيات لالفيزيولوجيا الخلوية، فإنه ليس من المستغرب أن الخلل الميتوكوندريا وقد تم ربط لمختلف الأمراض البشرية السائدة، بما في ذلك اضطرابات الاعصاب (9، 21، 34، 35). وقد تم تحديد الطفرات المسببة للأمراض في كل من البروتينات الميتوكوندريا الميتوكوندريا المشفرة والمشفرة النووية. ميزات مشتركة من اضطرابات الميتوكوندريا هي مجموعة متنوعة هائلة في شدة المرض وخصوصيات الأنسجة ملفتة للنظر. في حين أن هذا يمكن أن تكون على الأقل يفسر جزئيا heteroplasmy في حالة الطفرات الميتوكوندريا، وحاليا غير مفهومة عواقب الأنسجة محددة من الجينات المشفرة النووية المعيبة مع وظائف التدبير المنزلي.
ويتمثل ذلك من خلال استمارة مقهورة من الشلل النصفي التشنجي وراثي (HSP)، والذي كان سببه طفرات في paraplegin، وحدة فرعية من الحفظ ATP التي تعتمد م -AAA البروتيني في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا (29). فقدان النتائج paraplegin في انحطاط محور عصبي من الخلايا العصبية الحركية القشرية، مما أدى إلى جمود وضعف في الأطراف السفلية (8). دراسات مع خميرة الخباز الخميرة المخصصة النشاط المزدوج إلى البروتيني م -AAA لتدهور البروتين وتفعيل (27): أنه تجري مراقبة نوعية البروتين في الغشاء الداخلي ويحط بروتينات الغشاء nonassembled لالببتيدات (4، 22)؛ من ناحية أخرى، فإنه يتوسط معالجة البروتين وبالتالي ينشط بروتينات معينة الميتوكوندريا. وتشمل ركائز التي المشقوق بدلا من التي تدهورت بفعل البروتيني م -AAA السيتوكروم ج الغلوثانيون (12) والوحيدات الريباسي MrpL32 (26). انشقاق MrpL32 من قبل البروتيني م -AAA يضمن تجميع الريباسي وتخليق البروتين داخل الميتوكوندريا وضروري للتنفس (وبالتالي 26).
مثل كل مفارز المعروف البروتياز AAA، paraplegin ينتمي إلى الفصيلة AAA من ATPases ويتميز بوجود وحدة AAA أتباز الحفظ (15). على الرغم من تورطه في أنشطة الخلوية المتنوعة، وهي سمة مشتركة من البروتينات AAA هو أنها تنشط على التجمع هومو أو مغاير بلازميدة قليلة القسيمات فقط. ويفسر هذا من خلال تفعيل النشاط أتباز عن طريق التواصل بين المجالات بين المجالات المجاورة AAA (18، 28). وفقا لذلك، والبروتيني الخميرة م -AAA يشكل مجمع مغاير بلازميدة قليلة القسيمات مبنية من مثلي Yta10 (Afg3) وYta12 (Rca1) مفارز؛ هو المعطل المجمع في غياب فرعية واحدة (4). البروتينات مثلي لYta10 وYta12 موجودة بتواجد مطلق في الخلايا حقيقية النواة متعددة الخلايا (17)، ولكن من المفهوم وظيفة الثدييات البروتياز م -AAA سيئة فقط. وكشفت الدراسات تكامل حفظ الوظيفي للم البروتياز -AAA في الخميرة والثدييات وحددت مجموعة معقدة من paraplegin الثدييات وAfg3l2 (لAFG3 تشبه الجين 2) كما orthologue ظيفية من الخميرة م -AAA البروتيني (5، 26). نموذج الفأر لHSP تفتقر paraplegin يعيد الميزات الهامة من الأمراض التي تصيب البشر ويكشف التدريجي وخلية محددة تنكس محواري في الهابطة طويلة والصعود مساحات في العمود الفقري، في الأعصاب البصرية، والأعصاب الوركي (13). ميزات عصبية مرضية والأدلة التجريبية تشير إلى أن تنكس محور عصبي يرجع في النهاية إلى نقل محور عصبي ضعف. ومع ذلك، واحدة من العلامات الأولى للأمراض هو مظهر من الميتوكوندريا العملاقة وغير طبيعي من الناحية الهيكلية في المناطق البعيدة من المحاور، مما يدل على أن ضعف الميتوكوندريا محددة العصبية يطلق شلال المرضية (13). استنساخ النمط الظاهري الإنسان في نموذج الفأر لافت للنظر باعتبار أن ونديد إضافية من paraplegin، Afg3l1 (لAFG3 تشبه جينات 1)، موجود في الفأرة ولكن المشفرة من قبل جين كاذب في البشر (20).
عواقب الأنسجة محددة من فقدان paraplegin محيرة، وظائف التدبير المنزلي الحاسمة من البروتيني م -AAA، مثل تجهيز الوحيدات الريباسي MrpL32، يتم حفظها من الخميرة للثدييات (27). ومن المتوقع أن يؤدي إلى عيوب في الفسفرة التأكسدية نضوج ضعاف من MrpL32 في الميتوكوندريا الثدييات. ومع ذلك، في حين أن أوجه القصور في التجمع من مجمع لقد تم الإبلاغ عن HSP الليفية المريض (5)، لوحظت فقط العيوب تنفسية خفيفة في الأنسجة الماوس paraplegin ناقصة (13). في الآونة الأخيرة، وقد تم ربط paraplegin لتجهيز بروتين من OPA1 (16)، وهي تشبه dynamin GTPase المحفوظة في الغشاء الداخلي الذي ينظم ديناميات الميتوكوندريا (10). الطفرات في OPA1 سبب وراثي جسمي ضمور العصب البصري المهيمن تتميز خسارة في خلايا الشبكية (1، 11). كما الموسع والميتوكوندريا غير طبيعية تتراكم في المراحل المبكرة في المحاور في Spg7 - / - الفئران (13) ويلاحظ ضمور العصب البصري وأحيانا في أشكال معقدة من HSP وفي نموذج paraplegin الماوس (8، 13)، قد يتم تجهيز OPA1 ضعف من أهمية المسببة للأمراض.
للحصول على مزيد من الإيضاحات بشأن العواقب المترتبة على فقدان paraplegin، في هذه الدراسة، قمنا بتحليل تجميع المفترضة م مفارز -AAA البروتيني في الفئران والإنسان الميتوكوندريا. ونحن لشرح الاختلافات الأنسجة محددة في الوفرة النسبية للم مفارز -AAA البروتيني في الماوس وتقلب غير متوقع في جمعيتهم. وتشكل كل من Afg3l1 وAfg3l2 مجمعات للوطي بلازميدة قليلة القسيمات وكذلك المجالس-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات التي تحتوي على paraplegin. وتشير دراساتنا أن الجمعية تغير من مفارز مثلي بدلا من فقدان كامل للم -AAA نشاط الأنزيم البروتيني ذو أهمية المسببة للأمراض في HSP.
المواد والأساليب

استنساخ الإجراءات على سبيل التعبير في الخميرة، وتنصهر في شكل ناضج من الفئران Afg3l1 (الأحماض الأمينية 25-789) إلى الميتوكوندريا استهداف تسلسل Yta10 (الأحماض الأمينية 1-61). تم استنساخ A جزء HindIII / BamHI DNA التي تحتوي على مروج YTA10 (480 بي بي) وبي بي 1-183 من YTA10 وجزء BamHI / KpnI DNA التي تحتوي على بي بي 73-2367 من Afg3l1 إلى البلازميد YEplac195 multicopy. وعلقت A حاتمة ج. Myc على لمحطة C من Afg3l1 للسماح للمناعي من البروتين الهجين Yta10 (1-61) -Afg3l1 (25-789) -Myc. البلازميدات الخميرة السماح تعبير مغايرة من AFG3L2 البشرية (hAFG3L2) -Myc (في YEplac112 ADH1)، الفئران Afg3l2-هيماغلوتينين (في YEplac112 YTA10)، وparaplegin (في YEplac181 YTA10) والبلازميدات pGEM4-Atp7 وpGEM4-Yme2ΔC لSP6-البلمرة وقد وصفت التعبير -driven في المختبر سابقا (5، 19، 26).
تم المعطل م -AAA مفارز البروتيني من استبدال بقايا الغلوتامات ناشطة تحفيزيا داخل مراكز بروتين مع بقايا الجلوتامين باستخدام QuikChange موقع الموجه عدة الطفرات (Stratagene). وقد تبدل الكودونات منها على النحو التالي: أكاديمية الخليج للطيران إلى الجهاز المركزي للمحاسبات عن hAFG3L2 (الأحماض الأمينية 575) والفئران Afg3l2 (الأحماض الأمينية 574) وGAG لCAG لparaplegin الفئران (الأحماض الأمينية 575) وAfg3l1 (الأحماض الأمينية 567). استخدمت [أليغنوكليوتيد التالية: 5'-GGT CGC CTT CCA TCA GTC TGG CCA TGC C-3 "(التمهيدي إلى الأمام) و5'-GGC ATG دول مجلس التعاون الخليجي AGA CTG ATG غا GGC GAC C-3" (التمهيدي العكسي) لparaplegin الفئران ؛ 5'-CTG TAG CCT ACC ACC AGG CTG GGC ATG CAG-3 "(التمهيدي إلى الأمام) و5'-CTG CAT دول مجلس التعاون الخليجي CAG CCT GGT GGT AGG CTA CAG-3" (التمهيدي العكسي) لالفئران Afg3l1. و5'-CGG TGG CTT ACC ACC AAG CAG دول مجلس التعاون الخليجي ATG CGG-3 "(التمهيدي إلى الأمام) و5'-CCG CAT GGC CTG CTT GGT GGT AAG CCA CCG-3" (التمهيدي العكسي) لالفئران Afg3l2. تم التحقق من الطفرات من تسلسل الحمض النووي.

سلالات الخميرة وظروف النمو. سلالات خميرة الخباز المستخدمة في هذه الدراسة هي مشتقات من W303. تم الحصول على yta10 Δ yta12 Δ (YKO200) سلالة من حذف YTA12 في Δ yta10 (YGS101 [3]) سلالة بواسطة PCR تستهدف إعادة التركيب مثلي باستخدام الحذف كاسيت kanMX6 (23). yta10 Δ yta12 Δ سلالات التعبير عن الإنسان أو تم إنشاء البروتياز الفئران م -AAA (انظر الجدول S1 في المواد التكميلية) من خلال التحول من YKO200 الخلايا مع البلازميدات YEplac112 ADH1 -Yta10 (1-61) -hAFG3L2 (36-798) -Myc، YEplac181 YTA10 -Yta10 (1 -61) -paraplegin (44-781)، YEplac195 YTA10 -Yta10 (1-61) -Afg3l1 (25-789) -Myc، وYEplac112 YTA10 -Yta10 (1-61) -Afg3l2 (36-802) -HA أو البلازميدات ترميز المتغيرات موقع بروتين منها (5، 26).
كانت تزرع خلايا الخميرة وفقا للاجراءات المتبعة عند 30 درجة مئوية في أي من الخميرة، ببتون المتوسط ​​أو الحد الأدنى من المتوسط ​​تستكمل مع auxotrophs المطلوبة. اثنين في المئة (وزن / المجلد) الجلوكوز، أو لعزل الميتوكوندريا، 2٪ (وزن / المجلد) اللبن و 0.5٪ (وزن / المجلد) اللاكتات، أو لفحص نمو الجهاز التنفسي، أضيفت 3٪ (وزن / المجلد) الجلسرين كما مصادر الكربون.

تم تنفيذ BN-PAGE. الأزرق الأصلي الكهربائي هلام بولي أكريلاميد (BN-PAGE) أساسا كما هو موضح سابقا (30). تم solubilized بروتينات الميتوكوندريا (150 ميكروغرام) المعزولة من الخميرة أو الخلايا الليفية الأولية الإنسان بتركيز 5 ملغ / مل في 1٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، 30 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 4 ملي المغنيسيوم خلات، 5 ملي ε-جذر الأمينو ن حمض -caproic، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملم ATP. بعد زيادة ونقصان توضيح لمدة 30 دقيقة في 125،000 × ز، تم تحميل مقتطفات الصعود إلى 3-13٪ (وزن / المجلد) هلام بولي أكريلاميد. تم الكشف عن مفارز الفردية المجمعات البروتيني م -AAA التي كتبها immunoblotting.

تم solubilized تحليل الترشيح هلام مقتطفات الميتوكوندريا. الميتوكوندريا الخميرة المعزولة التي تحتوي على hAFG3L2 أو hAFG3L2 E575Q (البروتين 1 ملغ الميتوكوندريا) بتركيز 5 ملغ / مل في 1٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، 30 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 4 ملي المغنيسيوم خلات، 150 ملي K-خلات، ودرجة الحموضة 7.4، 1 ملم phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF)، 1 ملي ATP. وهي lysed الفئران (1 ملغ الميتوكوندريا البروتين) بتركيز 5 ملغ / مل في 2٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، 50 ملي كلوريد الصوديوم، عازلة 50 ملي K-الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.0، 4 مم - الميتوكوندريا الكبد من Spg7 - / MG-خلات، 10٪ (وزن / المجلد) الجلسرين، 1 ملم EDTA، 1 ملم PMSF. تمت إزالة المواد Nonsolubilized بواسطة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 125،000 × ز، وتعرض طاف لاستبعاد حجم اللوني باستخدام عمود Superose 6. تم جمع البروتينات مزال في الكسور 500 ميكرولتر، حمض ثلاثي كلور أسيتيك (TCA) عجل، وتحليلها بواسطة سلفات الصوديوم دوديسيل (SDS) -PAGE وimmunoblotting. وتم قياس كمية البروتينات الموجودة في الكسور شطافة التي كتبها كثافة الليزر.

تقرير من الوفرة النسبية للم -AAA مفارز البروتيني. لمقارنة كميات النسبية paraplegin، Afg3l1، وAfg3l2 في الكبد والدماغ الميتوكوندريا، وقد تم تحليل المستخلصات الميتوكوندريا التي كتبها SDS-PAGE وimmunoblotting. كانت مجزأة مقتطفات تحتوي على كميات مماثلة من Afg3l1 بواسطة SDS-PAGE وتحليلها بواسطة immunoblotting باستخدام Afg3l1-، paraplegin-، والأجسام المضادة Afg3l2 محددة و، من أجل السيطرة، الأجسام المضادة الموجهة ضد الوحيدات 70 كيلو دالتون من نازعة سكسينات (Sdha). وتم قياس كمية البروتين كميات باستخدام نظام التصوير القائم على مضان (أوديسي؛ LI-COR العلوم البيولوجية). تم تطبيع إشارات لAfg3l2 وparaplegin باستخدام Afg3l1 كعنصر تحكم التحميل. تم احتساب الكمية النسبية للparaplegin وAfg3l2 في الكبد والدماغ الميتوكوندريا كنسبة من إشاراتها في كل التحضيرات الميتوكوندريا.

Coimmunoprecipitation وimmunodepletion على سبيل التجارب مناعي، وهي lysed الميتوكوندريا الفئران (400 ميكروغرام الميتوكوندريا البروتين) بتركيز 1 ملغ / مل في 2٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، عازلة 50 ملي K-الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 4 ملي المغنيسيوم خلات، 10٪ (وزن / المجلد) الجلسرين، 1 ملم PMSF تستكمل مع كوكتيل مثبط البروتياز (روش). بعد زيادة ونقصان توضيح لمدة 15 دقيقة في 125،000 × ز، تم تحميلها مقتطفات على البروتين الخرز-A سيفاروز (2 ملغ) إلى جانب الأجسام المضادة تنقية تقارب أو مصل preimmune والمحتضنة لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية تحت الهز لطيف. وكانت تغسل حبات في وقت لاحق مع 0.5٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، عازلة 50 ملي K-الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 4 ملي المغنيسيوم خلات، 1 ملم PMSF، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4. ومزال المجمعات الضد مستضد من الخرز ومجزأة على أساس للا مائية وذلك باستخدام 1٪ (وزن / المجلد) تريتون-X114 و 1٪ (المجلد / المجلد) حمض الخليك. تم انتشال البروتينات مزال من الكسر المنظفات التي كتبها TCA هطول الأمطار وتحليلها بواسطة SDS-PAGE وimmunoblotting.
وأجريت التجارب Immunodepletion باستخدام كميات تشبع من Afg3l2 أو الأجسام المضادة Afg3l1C بالإضافة إلى البروتين الخرز-A سيفاروز (10 ملغ). وهي lysed الميتوكوندريا (150 ميكروغرام البروتين الميتوكوندريا) بتركيز 0.5 ملغ / مل في 2٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، عازلة 50 ملي K-الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم، عازلة 50 ملي K-الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.0 ، 4 ملي المغنيسيوم خلات، 10٪ (وزن / المجلد) الجلسرين، 1 ملم PMSF تستكمل مع كوكتيل مثبط البروتياز (روش) وتطبيقها على البروتين الخرز جانب الضد-A سيفاروز. أجريت الأمطار خارج كما هو موضح أعلاه. تعرض خمسين في المئة من الكسر طاف من هطول الأمطار (الموافق 75 ميكروغرام الميتوكوندريا البروتين) لهطول الأمطار TCA، SDS-PAGE، وimmunoblotting.

وأثيرت الأجسام المضادة. الأجسام المضادة الموجهة ضد متر -AAA مفارز البروتيني في الأرانب (BioGenes، ألمانيا) باستخدام الببتيدات الموافق الأحماض الأمينية 121-139 من paraplegin الفئران (C-PEDDEEEKRRKEREDQMYR)، إلى الأحماض الأمينية 90-103 من Afg3l2 (C-KEAVGEKKEPQPSG ) والأحماض الأمينية 104-118 (C-NAGPGGDGGNRGGKG) أو الأحماض الأمينية 771-785 (C-WNKGREEGGTERGLQ) من Afg3l1 (Afg3l1 وAfg3l1C، على التوالي) المناعي النوعي غس الدولية المختصة بالسلع وتنقيته من الأمصال التي كتبها immunoabsorption على الببتيد، مترافق SulfoLink مصفوفة (بيرس) واختباره من قبل immunoblotting ومناعي من الميتوكوندريا yta10 Δ Δ yta12 الخميرة التي تحتوي إما paraplegin، Afg3l1 أو Afg3l2. تم التحقق من خصوصية Afg3l1 وAfg3l2 أمصال مضادة أيضا باستخدام شظايا البروتين الذي يحتوي على مناطق المستضدات المقابلة أعرب في القولونية.
تم استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المتاحة تجاريا للمناعي من الوحيدات 39 كيلو دالتون من مجمع I (Ndufa9؛ المسابر الجزيئية)، الوحيدات 70 كيلو دالتون من نازعة سكسينات (Sdha؛ المسابر الجزيئية)، ج. Myc على (9B11؛ خلية اشارة التكنولوجيا )، والحواتم هيماغلوتينين (3F10؛ روش).

. متنوعة تم تنفيذ الإجراءات التالية أساسا كما هو موضح سابقا: عزل الميتوكوندريا من الخميرة، والخلايا الليفية الإنسان، والأنسجة الفئران (6، 24، 33)؛ توليف preproteins الميتوكوندريا رديولبلد. posttranslational استيراد البروتين في الميتوكوندريا المعزولة. والتحلل البروتيني من البروتينات المستوردة حديثا (33).

النتائج

مجمع hAFG3L2-وطي بلازميدة قليلة القسيمات في الميتوكوندريا الإنسان. Paraplegin وhAFG3L2 مفارز تجميع في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا البشري إلى نشطة وظيفيا البروتيني م -AAA التي كون تشكيلها هو ضعف في خلايا المريض HSP تفتقر paraplegin (5). والمثير للدهشة، تم الكشف عن مجمع عالية الجزيئية الكتلة تحتوي على hAFG3L2 عندما تم solubilized الميتوكوندريا المعزولة من-paraplegin نقص الخلايا الليفية HSP في ديجيتونين وتحليلها بواسطة BN-PAGE. وكانت الكتلة الجزيئية لهذا المجمع ~900 كيلو دالتون ومماثلة لتلك التي للمغاير بلازميدة قليلة القسيمات م -AAA البروتيني تحتوي على hAFG3L2 وparaplegin موجودة في البرية من نوع البشري الميتوكوندريا (الشكل 1A).

تين. 1.
hAFG3L2 يشكل م -AAA مجمع البروتيني-وطي بلازميدة قليلة القسيمات مع نشاط بروتين. (A) مجمع hAFG3L2-وطي بلازميدة قليلة القسيمات في الميتوكوندريا المعزولة من الخلايا الليفية HSP. تم solubilized الميتوكوندريا في ديجيتونين وتحليلها بواسطة SDS-PAGE (50 ميكروغرام الميتوكوندريا البروتين، اللوحة العليا) أو BN-PAGE (150 ميكروغرام الميتوكوندريا البروتين، اللوحة السفلى)، تليها immunoblotting باستخدام paraplegin محددة (اللوحة العليا) وhAFG3L2 محددة ( العلوي والسفلي لوحة) أمصال مضادة. من أجل السيطرة، كانت مجزأة الخميرة yta10 Δ Δ yta12 تحتوي على hAFG3L2 الميتوكوندريا التي كتبها BN-PAGE بشكل متواز. واستخدمت ثايروجلوبولين (669 كيلو دالتون) وصميم الفريتين (443 كيلو دالتون) للمعايرة. (B) صيانة نمو الجهاز التنفسي من yta10 Δ Δ yta12 خلايا الخميرة التي كتبها hAFG3L2. البرية من نوع (WT) الخلايا، yta10 Δ yta12 Δ الخلايا، وyta10 Δ yta12 Δ الخلايا معربا عن hAFG3L2 أو البديل غير نشط proteolytically hAFG3L2 E575Q (hAFG3L2 EQ)، وقد نمت على تخمر (خلاصة الخميرة، ببتون-سكر العنب [YPD]) و nonfermentable (وسائل الإعلام التي تحتوي على الجلسرين [YPG]) مصادر الكربون في 30 ° C. (C) المجمعات hAFG3L2-هومو بلازميدة قليلة القسيمات في yta10 Δ الميتوكوندريا yta12 Δ. وأعرب عن hAFG3L2 أو hAFG3L2 E575Q (hAFG3L2 EQ) في الخلايا Δ Δ yta10 yta12، وتم عزل الميتوكوندريا. بعد الإذابة في المخزن التي تحتوي على ديجيتونين، كانت مجزأة مقتطفات الميتوكوندريا (1 ملغ الميتوكوندريا البروتين) من خلال Superose 6 التحجيم اللوني. وكسور شطافة TCA عجل وتحليلها بواسطة SDS-PAGE وimmunoblotting باستخدام الأجسام المضادة hAFG3L2 محددة. وكان كميا hAFG3L2 (المربعات شغل) أو hAFG3L2 E575Q (الدوائر شغل) موجودة في الكسور شطافة التي كتبها كثافة الليزر، ويتم إعطاء النتائج كنسبة مئوية من البروتين منها في شطافة الإجمالية. مجمع أصغر hAFG3L2 التي تحتوي على، وضع علامة مع علامة النجمة، أكثر النتائج المحتملة من التفكك الجزئي للمجمع كبير. تم استخدام البروتينات علامة التالية للمعايرة: 1، Hsp60 (840 كيلو دالتون)؛ 2، صميم الفريتين (443 كيلو دالتون)؛ 3، نازعة الكحول (150 كيلو دالتون)؛ 4 البقري albumine المصل (66 كيلو دالتون). (D و E) تجهيز MrpL32 الخميرة وCCP1 التي كتبها hAFG3L2. تم تحليل معالجة البروتين في البرية من نوع (WT) الخلايا، yta10 Δ Δ yta12 الخلايا، وyta10 Δ Δ yta12 الخلايا معربا إما hAFG3L2 أو hAFG3L2 E575Q (hAFG3L2 EQ) بواسطة SDS-PAGE. تم رصد (D) نضوج MrpL32 (L32) في الميتوكوندريا المعزولة (30 ميكروغرام البروتين الميتوكوندريا) من خلال immunoblotting باستخدام أمصال مضادة بولكلونل موجهة ضد ناضجة وأشكال السلائف من MrpL32 و، ​​كما تحكم التحميل، ضد المترجمة مصفوفة Mge1. تم فحص معالجة (E) CCP1 في مقتطفات الخلية باستخدام أمصال مضادة موجهة ضد CCP1 و، من أجل السيطرة، وبروتين الغشاء الخارجي Tom40. ص، السلائف. م، شكل ناضج. (F) تدهور للبروتينات غشاء nonassembled التي كتبها hAFG3L2 أعرب في الخميرة. تم استيرادها رديولبلد Yme2ΔC (اللوحة العليا) أو Atp7 (اللوحة السفلى) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية في الميتوكوندريا المعزولة من سلالات الخميرة المستخدمة لوحات D و E. استقرار البروتينات المستوردة حديثا في 37 ° C تم تحديدها من قبل SDS- PAGE وتصوير الإشعاع الذاتي. يظهر بمعدل ثلاث تجارب مستقلة (± الخطأ المعياري للمتوسط). الساحات شغلها، النوع البري. مثلثات شغلها، yta10 Δ Δ yta12. مثلثات مفتوحة، yta10 Δ Δ yta12 + hAFG3L2. الساحات المفتوحة، yta10 Δ Δ yta12 + hAFG3L2 E575Q.

لدراسة ما إذا كانت hAFG3L2 يجمع مع AAA البروتيني فرعية أخرى أو يشكل مجمع وطي بلازميدة قليلة القسيمات في الغشاء الداخلي، عبرنا عن البروتين في خلايا الخميرة yta10 Δ Δ yta12 تفتقر إلى أي الوحيدات م -AAA البروتيني. تم عزل الميتوكوندريا من هذه الخلايا وsolubilized في ديجيتونين، وتم تحديد الكتلة الجزيئية الأم من hAFG3L2 بواسطة BN-PAGE (الشكل 1A). تم الكشف عن hAFG3L2 كجزء من مجمع ~900 كيلو دالتون، وبالتالي يشكل مجمع مماثلة في الحجم لأنه في الميتوكوندريا-paraplegin ناقصة الإنسان. وتشير هذه النتائج إلى أن hAFG3L2 يمكن بناء مجمع وطي بلازميدة قليلة القسيمات في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا.
التعبير عن hAFG3L2 استعادة حدها اختصاص الجهاز التنفسي من yta10 Δ خلايا yta12 Δ (الشكل 1B). هذه الملاحظة هي على النقيض من النتائج التي توصلنا إليها السابقة باستخدام م -AAA البروتيني نقص الخميرة سلالة أخرى وعلى الأرجح تعكس الاختلافات سلالة محددة (5). لتقييم اعتماد النمو التنفسي على التحلل البروتيني من قبل hAFG3L2، استبدلنا بقايا الغلوتامات ناشطة تحفيزيا 575 قبل الجلوتامين، وأعرب عن البروتين الطافر في yta10 Δ خلايا yta12 Δ. لم تحور أن تؤثر على تجميع hAFG3L2 إلى مجمع عالية الجزيئية الكتلة كما يتبين من هلام تحليل ترشيح-ديجيتونين solubilized الميتوكوندريا (الشكل 1C). ومع ذلك، كان نمو الخلايا التي تحتوي على الجلسرين المتوسطة يلغى كليا، مما يدل على الاعتماد من التنفس على نشاط بروتين من hAFG3L2 (الشكل 1B).

التحلل البروتيني من قبل المجمعات hAFG3L2-وطي بلازميدة قليلة القسيمات. لمراقبة مباشرة التحلل البروتيني من قبل hAFG3L2، درسنا تجهيز اثنين preproteins الميتوكوندريا المشفرة النووية، وهي intermembrane البروتين الفضاء السيتوكروم ج الغلوثانيون (CCP1) والوحيدات الريباسي MrpL32، وكلاهما معروف ل أن المشقوق من الخميرة م -AAA البروتيني (12، 26). مطلوب نضوج MrpL32 لتجميع الريبوسوم، وبالتالي تخليق البروتين داخل الميتوكوندريا، وهو شرط أساسي لتجميع المجمعات الجهاز التنفسي في الغشاء الداخلي (26). بالاتفاق مع الظواهر وحظ نمو، والتعبير عن hAfg3l2 ولكن ليس hAfg3l2 E575Q في yta10 Δ Δ استعادة خلايا yta12 إلى حد كبير تجهيز MrpL32، كما يتضح من التحليل الغربي لطخة من الميتوكوندريا المعزولة من هذه الخلايا (الشكل 1D). وبالمثل، ناضجة CCP1 المتراكمة في خلايا yta10 Δ Δ yta12 إيواء hAfg3l2 ولكن ليس في وجود hAfg3l2 E575Q (الشكل 1E).
بالإضافة إلى دورها لمعالجة البروتين، والخميرة م جودة البروتين ضوابط -AAA البروتيني في الغشاء الداخلي وتتوسط تدهور كامل للبروتينات الغشاء غير الأصليين (4، 22). لدراسة ما إذا كان مجمع hAFG3L2 يمكن أيضا بديلا لهذا النشاط، تم توليفها اثنين من البروتينات الركيزة معروف من الخميرة م -AAA البروتيني في نظام خالية من الخلايا في وجود [35 S] ميثيونين واستيرادها إلى عزل yta10 Δ Δ yta12 الميتوكوندريا إيواء hAFG3L2 أو hAfg3l2 E575Q. واحدة من هذه الركائز، Yme2ΔC، المترجمة في الغشاء الداخلي ويحتوي على نطاق تتعرض لمصفوفة (22). حذف مجال الفضاء intermembrane-كربوكسي المحطة، موجودة في البرية من نوع Yme2، والنتائج في زعزعة استقرار Yme2ΔC وتدهور لاحق من م -AAA البروتيني (الشكل 1F) (19). حين تتراكم في yta10 Δ Δ yta12 الميتوكوندريا، وقد تدهورت المستوردة حديثا Yme2ΔC بحضور hAFG3L2 (الشكل 1F). في المقابل، بقي Yme2ΔC مستقرة في yta10 Δ Δ yta12 الميتوكوندريا إيواء hAfg3l2 E575Q. وقد لوحظت آثار مماثلة من خلال تحليل استقرار المستوردة حديثا Atp7، وهو الطرفية بروتين الغشاء الداخلي التي تدهورت بفعل م -AAA البروتيني وآخر، كما ولكن في ذات مجهولة الهوية البروتيني الميتوكوندريا (الشكل 1F) (19). في حين hAFG3L2 يسرع تدهور Atp7 في yta10 Δ Δ yta12 الميتوكوندريا، طفرة نقطة في المركز بروتين من hAFG3L2 (hAfg3l2 E575Q) ألغيت تماما هذا النشاط (الشكل 1F).
لذا نستنتج أن مجمع hAFG3L2-وطي بلازميدة قليلة القسيمات يمارس النشاط بروتين في الميتوكوندريا ويمكن أن تكون بديلا عن وظيفة الخميرة م -AAA البروتيني في تصنيع البروتين وتدهور للبروتينات غشاء nonassembled. وهكذا، hAFG3L2 تنشط proteolytically على حد سواء على التجمع مع paraplegin في مجمع مغاير بلازميدة قليلة القسيمات وعلى وطي oligomerization.

البروتياز م -AAA-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات في الميتوكوندريا الفئران. وكشفت هذه التجارب التباين في جمعية الإنسان م -AAA البروتيني فرعية hAFG3L2. آخر المفترضة م -AAA البروتيني الوحيدات، Afg3l1، يتم ترميز من قبل جين كاذب في الإنسان ولكنه أعرب عن الماوس في إشارة إلى تقلب حتى أعلى في الأخير (20). الفئران Afg3l1 وAfg3l2 تبادل الهوية تسلسل 68٪، مما يشير إلى أنشطة مماثلة من كل من البروتينات. ومع ذلك، لم يتم تحليل وظيفة أو تجميع Afg3l1.
من أجل دراسة تركيبة معقدة من الإنزيمات البروتينية م -AAA في الميتوكوندريا الفئران، أجريت التجارب coimmunoprecipitation بها. رفعنا الأجسام المضادة الببتيد محددة موجهة ضد المفترضة مفارز م -AAA البروتيني Afg3l1، Afg3l2، وparaplegin. تم عزل الميتوكوندريا من الكبد الفئران، والنظر في النمط الظاهري الخلايا العصبية محددة من HSP، وأيضا من الدماغ. بعد الإذابة الميتوكوندريا في ديجيتونين، وحضنت مقتطفات مع أمصال مضادة-تنقية تقارب موجهة ضد متر -AAA مفارز البروتيني ثلاثة المفترضة. وقد تم تحليل الرواسب في وقت لاحق من قبل immunoblotting (الشكل 2). تم الكشف عن Paraplegin، Afg3l1، وAfg3l2 في immunoprecipitates بغض النظر عن الأجسام المضادة المستخدمة لهطول الأمطار (الشكل 2A). في المقابل، كان عجلت أيا من هذه البروتينات مع المصل preimmune، مما يدل على خصوصية التفاعل الملاحظة. وتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام الكبد أو الدماغ الميتوكوندريا (الشكل 2B). لذا نستنتج أن Afg3l1 يتفاعل مباشرة مع paraplegin وAfg3l2 في كل من الكبد والدماغ الميتوكوندريا. في اتفاق مع هذه النتائج، تم الكشف عن البروتينات في مجمع عالية الجزيئية الكتلة وcoeluted من العمود على تجزئة مقتطفات الميتوكوندريا التي كتبها التحجيم اللوني (لا تظهر البيانات).

تين. 2.
جمعية paraplegin، Afg3l1، وAfg3l2 في الميتوكوندريا الفئران. الميتوكوندريا (400 ميكروغرام الميتوكوندريا البروتين) تم عزل من (A) الكبد و (B) الدماغ وsolubilized مع ديجيتونين. تمت إزالة عشرة (الكبد) أو 20٪ (المخ) من العينة من أجل السيطرة (المدخلات). أجريت Coimmunoprecipitations من استخدام منقى تقارب paraplegin-، Afg3l1-، والأجسام المضادة Afg3l2 محددة. تم استخدام مصل Preimmune كوسيلة لمراقبة سلبية. وقد تم تحليل Immunoprecipitates (IP) من خلال SDS-PAGE وimmunoblotting.

م التجمع -AAA البروتيني في نموذج الفأر paraplegin ناقصة لHSP لرصد النتائج المترتبة على فقدان paraplegin على تشكيل الفئران المجمعات م -AAA الأنزيم البروتيني، درسنا تجميع Afg3l1 وAfg3l2 في الميتوكوندريا من Spg7 - / - الفئران. تم عزل الميتوكوندريا من الكبد والدماغ، solubilized في ديجيتونين، وتعرض لcoimmunoprecipitation باستخدام Afg3l2 محددة الأجسام المضادة تنقية تقارب والمصل preimmune (الشكل 3). وقد عجلت Afg3l1 مع Afg3l2 ولكن ليس مع المصل preimmune عندما مقتطفات من المنظفات Spg7 - / - تم تحليل الكبد أو الدماغ الميتوكوندريا (الشكل 3A وباء). باستمرار، اكتشفت جل التجارب الترشيح Afg3l1 وAfg3l2 كجزء من مجمع عالية الجزيئية الكتلة في الغشاء الداخلي للSpg7 - / - الميتوكوندريا الكبد (الشكل 3C). وهكذا، فإن فقدان paraplegin لا يمنع الجمعية من Afg3l1 وAfg3l2 في الغشاء الداخلي الميتوكوندريا. وتشير هذه النتائج إلى التقلبات في التجمع من الفئران م البروتياز -AAA التي يبدو أن تعتمد إلى حد كبير على توافر مفارز الفردية.

تين. 3.
مجمع Afg3l1 / Afg3l2-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات في الميتوكوندريا من Spg7 - / - الفئران. مقتطفات ديجيتونين الميتوكوندريا (400 ميكروغرام البروتين الميتوكوندريا) من (A) الكبد و (B) في الدماغ من النوع البري (WT) وparaplegin ناقصة Spg7 - / - تعرض الفئران لcoimmunoprecipitations باستخدام الأجسام المضادة Afg3l2 محددة، تنقية تقارب كما وصفها في وسيلة إيضاح الشكل 2. تم استخدام المصل Preimmune كوسيلة لمراقبة سلبية. وقد تم تحليل الرواسب التي كتبها SDS-PAGE وimmunoblotting باستخدام paraplegin-، Afg3l1-، والأجسام المضادة Afg3l2 محددة. مبالغ Afg3l1 في الرواسب المستمدة من النوع البري وSpg7 - / - الميتوكوندريا تختلف قليلا في تجارب مختلفة. (C) مجمع عالية الجزيئية الكتلة تحتوي على Afg3l1 وAfg3l2 في Spg7 - / - الميتوكوندريا. مقتطفات (1 ملغم بروتين الميتوكوندريا) الميتوكوندريا الكبد معزولة عن Spg7 - / - كانت مجزأة الفئران عن طريق Superose 6 التحجيم اللوني. وكسور شطافة TCA عجل وتحليلها بواسطة SDS-PAGE وimmunoblotting باستخدام Afg3l1- والأجسام المضادة Afg3l2 محددة. وتم قياس كمية Afg3l1 (مثلثات شغل) وAfg3l2 (الدوائر شغل) في شطافة التي كتبها كثافة الليزر وتعطى كنسبة مئوية من البروتين منها في شطافة الإجمالية. علامات نجمية مجمع عالية الجزيئية كتلة من Afg3l1 وAfg3l2 التي coelutes مع prohibitins Phb1 وprohibitins Phb1 وPhb2، مما يدل على تفاعل م -AAA مجمع البروتيني مع prohibitins، كما لوحظ في الميتوكوندريا الخميرة (31). تم استخدام البروتينات علامة التالية للمعايرة: 1، مثنوي ATP سينسيز (1.5 MDA)؛ 2، أحادى ATP سينسيز (750 كيلو دالتون)؛ 3، صميم الفريتين (443 كيلو دالتون)؛ 4، نازعة الكحول (150 كيلو دالتون).

الاختلافات الأنسجة محددة في الوفرة النسبية للم -AAA مفارز البروتيني. وفي سياق هذه التجارب، لاحظنا أن مستويات ثابتة للدولة من م -AAA مفارز البروتيني يبدو أن تختلف في الكبد والدماغ الميتوكوندريا. استبعاد التأثيرات غير المباشرة بسبب الاختلافات في نقاء الاستعدادات organellar من الأنسجة المختلفة، قارنا الوفرة النسبية للAfg3l1، Afg3l2، وparaplegin في الميتوكوندريا المعزولة من الكبد والدماغ.تم تحديد مستويات ثابتة للدولة النسبية Afg3l2 وparaplegin من قبل immunoblotting مقتطفات الميتوكوندريا التي تحتوي على كميات متساوية من Afg3l1 (الشكل 4A). لافت للنظر، Afg3l2 المتراكمة في ~10-أضعاف أعلى المستويات في الدماغ مما كانت عليه في الكبد (الشكل 4A). كان Paraplegin أيضا أكثر وفرة في الدماغ مما كانت عليه في الميتوكوندريا الكبد وكان حاضرا عند مستويات ~4-أضعاف العالي في العضيات المعزولة من الدماغ الفئران (الشكل 4A). في المقابل، كان Afg3l1 الحاضر في انخفاض طفيف فقط المبالغ في الميتوكوندريا الدماغ قريبة الوحيدات 70 كيلو دالتون من سكسينات نازعة (الشكل 4A).

تين. 4.
الوفرة النسبية للparaplegin، Afg3l1 وAfg3l2 في الكبد والدماغ الميتوكوندريا. تم عزل الميتوكوندريا من (A) من النوع البري أو (B) Spg7 - / - كبد الفئران والدماغ. وقد تم تحليل المستخلصات التي تحتوي على كميات متساوية من Afg3l1 بواسطة الأجسام المضادة SDS-PAGE وimmunoblotting باستخدام paraplegin-، Afg3l1-، وAfg3l2 محددة فضلا عن الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الموجهة ضد الوحيدات 70 كيلو دالتون من نازعة سكسينات (Sdha). وتم قياس كمية Paraplegin وAfg3l2 موجودة في الكبد والدماغ الميتوكوندريا بواسطة التصوير القائم على مضان باستخدام Afg3l1 كعنصر تحكم التحميل. تم احتساب نسبة إشارات الكشف عن Afg3l2 وparaplegin في الدماغ مقابل الميتوكوندريا الكبد لمراقبة الوفرة النسبية للم -AAA مفارز البروتيني في كل الأنسجة. متوسط ​​ن وأظهرت تجارب مستقلة (± الخطأ المعياري للمتوسط) باستخدام الأنسجة المعزولة من مختلف الحيوانات اختيارها عشوائيا.

فمن المتصور أن الوفرة النسبية للAfg3l1 وAfg3l2 يتم تبديل في غياب paraplegin، مما يؤدي إلى تعويض جزئي عن فقدان paraplegin. وبالتالي فإننا مقارنة الوفرة النسبية للAfg3l1 وAfg3l2 في الميتوكوندريا المعزولة من الكبد والدماغ من Spg7 - / - الفئران التي تفتقر paraplegin (الشكل 4B). عندما تطبيع Afg3l1، Afg3l2 لا يزال المتراكمة في-أعلى ~10 أضعاف المستويات في الميتوكوندريا الدماغ من Spg7 - / - الفئران، مما يدل على أن الوفرة النسبية لكل من البروتينات لم تتغير في غياب paraplegin.
هذه التجارب تكشف عن اختلافات لم تكن متوقعة في الوفرة النسبية للم مفارز البروتيني -AAA في الأنسجة المختلفة. وبالنظر إلى التباين الملاحظ في جمعيتهم، يبدو من المرجح أن تكوين فرعية من المجمعات بروتين يختلف بطريقة الأنسجة محددة.

هومو ومغاير بلازميدة قليلة القسيمات م البروتياز -AAA في الميتوكوندريا الدماغ. لتقييم تجميع م -AAA مفارز البروتيني بطريقة أكثر الكمية، أجرينا تجارب immunodepletion. تم solubilized الميتوكوندريا الدماغ في ديجيتونين، وكانت تستخدم الأجسام المضادة Afg3l2 محددة، تنقية تقارب في استنزاف تماما مستخلص Afg3l2 (الشكل 5A). كان Afg3l2 مناعيا لا يمكن كشفها في جزء طاف بعد immunodepletion. كانت تصاحب Afg3l2، Afg3l1 وparaplegin الحالي عند مستويات فقط تضاءلت بشكل كبير (الشكل 5A). حضانة مقتطفات الميتوكوندريا مع المصل preimmune أثرت على مستوى الدولة المستقرة من لا Afg3l2 ولا Afg3l1 أو paraplegin (الشكل 5A). لذا نستنتج أن Afg3l1، Afg3l2، وparaplegin تجميع الكمية مع بعضها البعض في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا الدماغ.

تين. 5.
تعايش م البروتياز -AAA المبنية من مفارز مختلفة في الميتوكوندريا الدماغ. الميتوكوندريا (150 ميكروغرام البروتين الميتوكوندريا) من (A) من النوع البري (WT) و (B) Spg7 - / - وهي lysed الدماغ في ديجيتونين وحضنت مع تشبع كميات من المصل preimmune أو تنقية تقارب-Afg3l2- أو الأجسام المضادة Afg3l1C محددة. بعد إزالة راسب، وقد تم تحليل الكسور طاف (SN) بواسطة SDS-PAGE وفحصها لوجود paraplegin، Afg3l1، وAfg3l2 التي كتبها immunoblotting. تم استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الموجهة ضد الوحيدات 39 كيلو دالتون من مجمع I (Ndufa9) للسيطرة على قدم المساواة هلام التحميل. في حين Afg3l1 وAfg3l2 يمكن أن تنفد تماما من الكسر طاف باستخدام الأجسام المضادة Afg3l1- أو Afg3l2 محددة، تنقية تقارب، على التوالي، لا يمكن أن تستنفد مقتطفات من paraplegin باستخدام الأجسام المضادة paraplegin محددة المتاحة (لا تظهر البيانات).

والجدير بالذكر، عندما أجريت تجارب مماثلة مع الأجسام المضادة Afg3l1 محددة، Afg3l2 وparaplegin تم استنفاد إلا قليلا من مقتطفات الميتوكوندريا. هذا الأرجح أن ذلك يعكس وفرة انخفضت من Afg3l1 مقارنة بما كان عليه من Afg3l2 وparaplegin. وهكذا، على الأقل مختلفة م المجمعات البروتيني -AAA تتعايش في الميتوكوندريا الدماغ: Afg3l2 / paraplegin والمجمعات Afg3l1 أقل وفرة التي تحتوي أيضا Afg3l2، paraplegin، أو كليهما.
التي متر -AAA البروتيني المجمعات موجودة في الميتوكوندريا الدماغ paraplegin ناقصة؟ لمعالجة هذه المسألة، ونحن عزل الميتوكوندريا الدماغ من Spg7 - / - الفئران وتحليلها وتكوين معقد من م المجمعات -AAA البروتيني من قبل immunodepletion باستخدام Afg3l1- والأجسام المضادة Afg3l2 محددة (الشكل 5B). على غرار البرية من نوع الميتوكوندريا، وAfg3l1 المنضب بالكامل تقريبا من مقتطفات من Spg7 - / - الميتوكوندريا الدماغ مع الأجسام المضادة Afg3l2 يدل التجمع الكمي (الشكل 5B). في المقابل، كان مستوى ثابت للدولة من Afg3l2 لا يكاد يتأثر المستنفدة Afg3l1 (الشكل 5B). نستنتج أن Afg3l2 هي موجودة في الزائدة بالنسبة لAfg3l1 في الميتوكوندريا الدماغ من النوع البري وSpg7 - / - الفئران. بينما Afg3l1 تجميعها كميا مع Afg3l2، فإن غالبية Afg3l2 ليست جزءا من هذا الهيكل وعلى الأرجح تشكل مجمعا وطي بلازميدة قليلة القسيمات.

النشاط بروتين من هومو ومغاير بلازميدة قليلة القسيمات م البروتياز -AAA. هذه التجارب تثبت وجود م -AAA المجمعات البروتيني مع تكوين الوحيدات متغير في الميتوكوندريا الفئران. لدراسة النشاط بروتين للجمعيات مختلفة، أجرينا دراسات تكامل مع م -AAA البروتيني-ناقص yta10 Δ yta12 خلايا Δ الخميرة.
في التجارب الأولية، paraplegin، Afg3l1، وAfg3l2 وأعرب بشكل مستقل في yta10 Δ yta12 Δ الخلايا وتم فحص نمو الخلايا في الجهاز التنفسي (الشكل 6A). لافت للنظر، والتعبير عن إما Afg3l1 أو Afg3l2 ولكن ليس paraplegin استعادة نمو yta10 Δ yta12 خلايا Δ على المحتوية على الجلسرين المتوسطة (الشكل 6A). هذا يذكرنا hAFG3L2، والتي شكلت-وطي بلازميدة قليلة القسيمات، proteolytically مجمعات نشاطا عندما أعرب في الخميرة (الشكل 1). تحليل الترشيح هلام مقتطفات الميتوكوندريا كشف الحقيقة وطي oligomerization من Afg3l1 وAfg3l2 في الخميرة، في حين paraplegin لا تشكل مجمع عالية الجزيئية الكتلة في غياب الأخرى مفارز AAA البروتيني (لا تظهر البيانات). التعبير عن المتغيرات موقع بروتين من Afg3l1 (Afg3l1 E567Q) أو Afg3l2 (Afg3l2 E574Q لم) لا تعزز نمو الجهاز التنفسي من yta10 Δ yta12 خلايا Δ، مشيرا إلى أن المجمعات وطي بلازميدة قليلة القسيمات تمارس النشاط بروتين (الشكل 6A). باستمرار، لاحظنا نضوج MrpL32 في yta10 Δ yta12 خلايا Δ إيواء Afg3l1 أو Afg3l2، في حين تم إلغاء هذا النشاط عن طريق الطفرات في مركز بروتين من كل من البروتين (الشكل 6B). وعلاوة على ذلك، تم استعادة تجهيز CCP1 على التعبير عن Afg3l1 أو Afg3l2 لكن إعاقة إلى حد كبير في وجود متغيرات الخاملة proteolytically من كل من البروتين (الشكل 6C). وتجدر الإشارة إلى أن نقص التنفسي من yta10 Δ yta12 خلايا Δ لم ترد على التعبير عن paraplegin، كما لم تنضج MrpL32 أو CCP1 الحاضر في هذه الخلايا (الشكل 6). وهكذا، تظهر القدرة على تكوين مجمعات للوطي بلازميدة قليلة القسيمات أن يقتصر على Afg3l1 وAfg3l2.

تين. 6.
النشاط بروتين من هومو-بلازميدة قليلة القسيمات ومغاير بلازميدة قليلة القسيمات م المجمعات -AAA البروتيني في الخميرة. (A) نمو الجهاز التنفسي من yta10 Δ yta12 خلايا Δ معربا عن الفئران م مفارز -AAA البروتيني. البرية من نوع (WT) الخلايا، yta10 Δ yta12 Δ الخلايا، وyta10 Δ yta12 Δ الخلايا معربا إما paraplegin، Afg3l1 (Afg3lX)، Afg3l2 (Afg3lX)، أو متحولة من المتغيرات Afg3l1 E567Q أو Afg3l2 E574Q (Afg3lX EQ كانت تزرع) في 30 ° C على (YPG) وسائل الاعلام (YPD) أو التي تحتوي على الجلسرين التي تحتوي على الجلوكوز لفحص كفاءة الجهاز التنفسي من الخلايا. لتقييم نشاط المجمعات مغاير بلازميدة قليلة القسيمات، متحولة المتغيرات Afg3l1 E567Q أو Afg3l2 E574Q تم coexpressed مع paraplegin (الفقرة / Afg3lX EQ) أو مع paraplegin E575Q (الفقرة EQ / Afg3lX EQ) في yta10 Δ yta12 تم تحليل Δ الخلايا والخلايا النمو على النحو الوارد أعلاه. (B و C) تجهيز MrpL32 الخميرة وCCP1 من قبل الفئران م البروتياز -AAA. تم تحليل معالجة البروتين في yta10 Δ yta12 خلايا Δ إيواء الفئران م -AAA مفارز البروتيني بواسطة SDS-PAGE كما هو موضح لوحة ألف وimmunoblotting كما هو موضح في أسطورة عن الشكل 1 باستخدام MrpL32 (L32) أمصال مضادة -specific (B) أو أمصال مضادة CCP1 محددة (C). ص، أشكال السلائف. م، أشكال ناضجة. استخدمت Mge1 وTom40 للسيطرة على قدم المساواة هلام التحميل.

في مزيد من التجارب، ونشاط بروتين من الفئران-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات م تم تقييم البروتياز -AAA تتألف من Afg3l1 وparaplegin أو من Afg3l2 وparaplegin في الخميرة. بعد coexpression إما زوج من مفارز، تم التحقق من التفاعل من خلال التجارب coimmunoprecipitation (لا تظهر البيانات). على غرار الخلايا التي تحتوي فقط Afg3l1 أو Afg3l2، ونمو الجهاز التنفسي من yta10 Δ yta12 خلايا Δ تم ترميمه إذا كان coexpressed paraplegin مع أي البروتين (لا تظهر البيانات). لدراسة ما إذا كان هذا النمط الظاهري هو بسبب مغاير oligomerization مع paraplegin بدلا من هومو-oligomerization من Afg3l1 أو Afg3l2، على التوالي، عبرنا عن proteolytically المتغيرات غير نشطة من هذه البروتينات. الدراسات السابقة على الخميرة م وقد أثبتت -AAA البروتيني أن البروتيني هو المعطل فقط عندما تحمل جميع مفارز الطفرات نقطة في المركز بروتين بها (3). في المقابل، مجمع AAA البروتيني-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات تتألف من وحدات فرعية النشطة وغير النشطة proteolytically يتوسط معالجة البروتين ويحافظ على نمو الجهاز التنفسي (3). في حين لا التعبير عن paraplegin ولا أن من Afg3l1 E567Q يسمح yta10 Δ yta12 Δ الخلايا لتنمو على المحتوية على الجلسرين المتوسطة، تم استعادة نمو الخلايا في الجهاز التنفسي على coexpression كل من البروتينات (الشكل 6A). في المقابل، yta10 Δ yta12 Δ الخلايا معربا عن خاملة proteolytically Afg3l1 E567Q وparaplegin E575Q كانت بالقصور التنفسي. وبالتالي، يمكن الحفاظ على نمو الجهاز التنفسي عن طريق مجمع / paraplegin نشط proteolytically Afg3l1.
لتقييم مباشرة النشاط بروتين من Afg3l1 مجمع / paraplegin-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات، تم رصد نضوج CCP1 وMrpL32 في هذه الخلايا (الشكل 6B وC). تم الكشف عن أشكال ناضجة من كلا CCP1 وMrpL32 في الخلايا إيواء paraplegin وAfg3l1 E567Q ولكن ليس في وجود paraplegin E575Q وAfg3l1 E567Q. لذا نستنتج أن مجمع AAA البروتيني تتألف من Afg3l1 وparaplegin مفارز نشط proteolytically.
والجدير بالذكر، تم الحصول على نتائج مشابهة جدا عندما yta10 Δ yta12 Δ تم تحليل الخلايا معربا عن Afg3l2 وparaplegin (الشكل 6). إدخال طفرة نقطة في المركز بروتين من Afg3l2 (Afg3l2 E574Q) لم يلغ نمو الجهاز التنفسي إذا تم coexpressed paraplegin. وعلاوة على ذلك، تم تجهيز CCP1 وMrpL32 جزئيا في هذه الخلايا. على coexpression من Afg3l2 E574Q وparaplegin E575Q، ومع ذلك، لم ترد اختصاص الجهاز التنفسي من الخلايا، وكلا CCP1 وMrpL32 المتراكمة في شكل السلائف (الشكل 6). وهكذا، فإن مجمع / paraplegin Afg3l2 يمارس النشاط في بروتين الخميرة.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس